Нормофлора (выращивание, препараты)

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию РФ

ГОУ ВПО «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РОСЗДРАВА»

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат

по биотехнологии

Нормофлора (выращивание, препараты)

Исполнитель:

студентка 6 курса 64 группы

Крыпаева Евгения Александровна

Руководитель:

зав. кафедрой

фармацевтической технологии,

доктор фармацевтических наук,

профессор Первушкин С.В.

Самара 2009

Содержание

Введение. 3

1.Виды и функции нормальной микрофлоры человека. 4

2. Препараты нормофлоры.. 7

3. Технология получения пробиотиков. 11

Заключение. 15

Список литературы.. 16

Введение

Организм человека и населяющие его микроорганизмы являются единой экосистемой. Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани, во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы [3].

В организме человека в соответствии с условиями обитания формируются биотипы с определенными микробиоценозами. Любой микробиоценоз- это сообщество организмов, существующее как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией.

Нормальная микрофлора (нормофлора) - это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взимосвязями и местом обитания.

Велика защитная роль нормофлоры в обеспечении здоровья, поэтому нарушение равновесия между отдельными видами микроорганизмов в местах их постоянного обитания за счет более интенсивного размножения или гибели какого-либо вида может повлечь нарушение гомеостаза с соответствующими последствиями патологического характера.

При определенных условиях микрофлора человека может оказать неблагоприятное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. Возможно возникновение гнойно-воспалительных реакций, сенсибилизации организма со многими клиническими проявлениями аллергического порядка, формирование в организме банка плазмид и генов с проявлениями мутагенной и антимутагенной активности.

1. Виды и функции нормальной микрофлоры человека

Существует два вида нормальной микрофлоры:

1)резидентная – постоянная, характерная для данного вида. Количество характерных видов относительно невелико и относительно стабильно. Резидентная микрофлора обнаруживается в определенных местах тела человека, при этом важным фактором является его возраст;

2)транзиторная – временно попавшая, не характерная для данного биотопа; она активно не размножается, поэтому, хотя видовой состав транзиторных микроорганизмов и разнообразен, но они не являются многочисленными. Характерная особенность этого вида микрофлоры заключается в том, что, попадая на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывает заболеваний и не обитает постоянно на поверхностях тела человека.

Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель. Присутствие транзиторной микрофлоры определяется также состоянием иммунной системы организма хозяина [8].

Состав транзиторной микрофлоры не является постоянным и зависит от возраста, внешней среды, условий труда, рациона питания, перенесенных заболеваний травм и стрессовых ситуаций.

Нормофлора формируется с рождения, заселение ее бактериями продолжается в течение всей жизни. При качественный и количественный состав нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов.

В норме многие ткани и органы здорового человека стерильны, в частности кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы. Стерильность обеспечивается неспецифическими клеточными и гуморальными факторами иммунитета, препятствующими проникновению микробов в эти ткани и органы.

На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях формируется относительно стойкая микрофлора, специфичная для данного органа, биотипа или его участка [1].

Наибольшей обсемененностью характеризуются:

1)толстый кишечник. В составе нормальной микрофлоры преобладают анаэробные бактерии (96-99%), аэробные и факультативно-анаэробные бактерии;

2)ротовая полость. Нормальная микрофлора ротовой полости различна и определяется биологическими особенностями обитающих здесь видов. Представители ротовой полости делятся на три категории:

а)стрептококки, нейссерии, вейлонеллы;

б)стафилококки, лактобактерии, нитевидные бактерии;

в)дрожжеподобные грибы;

3)мочевыделительная система. Нормальная микрофлора наружной части уретры у мужчин и женщин представлена коринебактериями, микобактериями, грамотрицательными бактериями фекального происхождения и неспорообразующими анаэробами (пептококки, пептострептококки, бактероиды).

4)верхние дыхательные пути. Собственная микрофлора носа состоит из коринебактерий, нейссерий, коагулазо-отрицательных стафилококков, α- гемолитических стрептококков. Микрофлора зева более разнообразна из-за смешивания микрофлоры полости рта и воздухоносных путей. В верхних дыхательных путях преобладают стрептококки и нейссерии, встречаются стафилококки, дифтероиды, гемофильные бактерии, пневмококки, микоплазмы, бактероиды;

5)кожа, особенно ее волосистая часть. В связи с постоянным контактом с внешней средой кожа является местом обитания транзиторных микроорганизмов, имея при этом постоянную микрофлору. Состав резидентной микрофлоры кожи и слизистых оболочек характеризуется наличием Staphylococcus epidermis, S. aureus, Micrococcus spp., Sarcinia spp., Propionibacterium spp., коринеформными бактериями.

Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган с определенной анатомической структурой и следующими функциями [10].

1.Антагонистическая функция. Нормальная микрофлора обеспечивает устойчивость соответствующих участков тела к заселению случайной, в том числе и патогенной, микрофлорой.

2.Иммуногенная функция. Бактерии, являющиеся представителями номофлоры, постоянно поддерживают иммунную систему в должном состоянии своими антигенами.

3.Пищеварительная функция. Нормальная микрофлора принимает участие в полостном пищеварении за счет своих ферментов.

4.Метаболическая функция. Нормофлора участвует в обмене белков, липидов, уратов, оксалатов, стероидных гормонов, холестерина за счет свих ферментов.

5.Витаминообразующая функция. В процессе метаболизма отдельные представители нормальной микрофлоры образуют витамины.

6.Детоксикационная функция. Нормальная микрофлора обезвреживает образующиеся в организме токсические продукты обмена веществ или организмы, попавшие из внешней среды.

7.Регуляторная функция. Нормальная микрофлора участвует в регуляции газового, водно-солевого обмена, поддержания рН среды.

8.Генетическая функция. Нормофлора является неограниченным банком генетического материала.

2. Препараты нормофлоры

Микроорганизмы, составляющие нормофлору, представляют собой четкую морфологическую структуру в виде биопленки. Толщина ее 0,1 – 0,5мм. В ней содержится от нескольких сотен до нескольких тысяч микроколоний, образующихся как из анаэробных, так и аэробных бактерий [2].

Формирование биопленки создает для бактерий дополнительную защиту. Внутри биопленки бактерии более устойчивы к действию химических и физических факторов, влияющих на состояние нормальной микрофлоры. К ним относятся:

1)эндогенные:

а)секреторная функция организма;

б)гормональный фон;

в)кислотно-основное состояние;

2)экзогенные: условия жизни (климатические, бытовые, экологические).

Любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро- или микроорганизм различных неблагоприятных факторов приводят в дисбактериозу.

Для коррекции дисбактериоза необходимо устранить причину, вызвавшую его, затем использовать эубиотики(пробиотики) и пребиотики и симбиотики.

Пребиотики – это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника, стимулирующие рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олисахариды, инулин, лактулоза и др.), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами [7].

Основные известные препараты:

- лактулоза – синтетический дисахарид. Микрофлора толстой кишки гидролизует лактулозу до молочной (в основном) и частично до муравьиной и уксусной кислот. Она способствует понижению рН содержимого толстого кишечника, снижению концентрации гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику кишечника и усиливает рост бифидо- и лактобактерий;

- кальция пантотенат участвует в процессах ацетилирования и окисления в клетках, углеводном и жировом обменах, синтезе ацетилхолина, стимулирует образование кортикостероидов в коре надпочечников;

- лизоцим способствует нормализации нарушений микрофлоры. наиболее активен в отношении грамположительных патогенных и условнопатогенных бактерий. Лизоцим обладает бифидогенным, имунномоделирующим, противовоспалительным действием, улучшает пищеварение, стимулирует метаболические процессы и эритропоэ, проявляет синергизм со многими антибиотиками.

Симбиотики – комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик [4].

Пробиотеки – это препараты нормальной микрофлоры человека. пробиотики имеют в своем составе живые клетки специально подобранных штаммов микроорганизмов растительного или животного происхождения; они выживают в условиях кишечного окружения, непатогенны, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения.

Механизм положительного влияния пробиотиков включает:

- подавление микробных патогенов за счет продукции антибактериальных веществ, конкуренции за лимитируемые питательные вещества и сайты адгезии на кишечной стенке;

- влияние на ферментативную активность кишечных микроорганизмов;

- стимуляцию иммунной системы макроорганизма.

В России производят в основном моновалентные препараты: бифидумбактерин (на основе Bifidobacterium bifidum), апилак (на основе Lactobacillis acidophillus), колибактерин (на основе кишечной палочки E. Coli M-17), лактобактерин (на основе Lactobacillus plantarum, fermentum). комплексные препараты, например бификол (Bifidobacterium и E. Coli M -17). За рубежом производя поливалентные (комплексные) препараты: симбиофтор, бификор, примадофилюс (содержит комплекс микроорганизмов симбионтов) и другие.

Они предназначены в основном для профилактики и лечения дисбактериоза. Особенно широко применяют в клинике детских болезней (при острой дизентерии, сальмонеллезе, эшерехиозе, вирусных диареях, диатезе и др.). При несформировавшейся микроэкологической системы ЖКТ у детей применение препаратов пробиотиков оказывается очень эффективным.

Препараты пробиотиков также применяют в комплексном лечении кишечных инфекций, энероколитах на фоне нарушения микрофлоры с дефицитом или полным отсутствием бифидофлоры и др.).

Пробиотики также назначаются ослабленным людям после соматических заболеваний и по завершении лечения антибиотиками, лицам преклонного возраста, так как у них в связи с изменением гормонального статуса уменьшается количество бифидо- и лактобактерий.

Действующим началом лактосодержащих препаратов являются живые лактобациллы, обладающие антагонистическим действием против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий за счет продукции кислот, перекиси водорода, лизоцима и антибиотическихвеществ. локтобациллы выделяют ферменты, витамины, способствуют пищеварению, улучшают обмен веществ, обладают иммуномоделирующим действием, нормализуя естественную резистентность организма. Лактосодержащие препараты целесообразно назначать детям и взрослым при лечении ОКИ, хрогических заболеваниях ЖКТ с выраженными дисбиотическими явлениями, особенно в случае дефицита лактофлоры или при использовании этих препаратов в комбинированной терапии с антибиотиками [5].

К лактосодержащим препаратам относится лактобактерин, апилакт, аципол, линекс, гастрофарм, биобактон.

Среди колисодержащих препаратов следует отметить колибактерин, лечебное действие которого обусловлено антагонистической активностью кишечной палочки в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, включая шингеллы, сальмонеллы, протей и др., бификол и бифилор.

Препараты из апатогенных представителей других таксономических групп или микробных метаболитов. В этой группе относятся препараты из апатогенных представителей родов Bacillus, Aerococcus и Saccharomyces. Из спорообразующих бацилл готовят препараты бактисубтил, споробактерин, бактиспорин и биоспорин. Лечебное свойство споровых препаратов обусловлено их выраженными антагонистическими свойствами против широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий, в том числе протеев, стафилококков и грибов рода Candida. Эти препараты содержат комплекс ферментов, стимулирующих пищеварение, способствуют лучшему усвоению пищи, содержат протеолитические и фибринолитические ферменты, чем способствуют очищению воспалительных очагов от некротических тканей. Наиболее известный представитель этой группы – это препарат Хилак-форте. Он содержит концентрат продуктов метаболизма бактерий тонкой и толстой кишки, в том числе метаболиты Lactobacillus acidophilus, L.helveticus, E-coli, Enterococcus faecalis, молочную и фосфорную кислоты, аминокислоты и другие вещества, способствущие нормализации рН, восстановлению водно-электролитного баланса, состава нормофлоры и поддержанию физиологической функции слизистой оболочки кишечника.

3. Технология получения пробиотиков

Необходимым условием массового производства препаратов пробиотиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые организмы, относятся к наименее стойким. На выживаемость микроорганизмов в сухих препаратах влияют следующие факторы:

- регламентированное содержание остаточной влаги;

- наличие защитных сред;

- хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород.

В целях защиты пробиотиков от кислой среды желудка на таблетированные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте.

Для получения препаратов пробиотиков необходимо иметь штаммы микроорганизма симбионта. Их выделяют из кишечного содержимого здоровых детей и взрослых. Эти штаммы должны обладать следующими свойствами:

- наличие полезного воздействия на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями;

- штаммы должны быть идентифицированы с учетом генетических признаков так как для получения пробиотиков разрешены штаммы только определенных видов микроорганизмов;

- при длительном использовании они не должны вызывать побочных эффектов. Штаммы не должны быть непатогенными и нетоксичными;

- наличие колонизационного потенциала, то есть сохранение в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия (должны быть устойчивы к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробной субстанциям, продуцируемым индогеннлй микрофлорой с адгезией к эпителию соответствующих слизистых оболочек);

- наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

- наличие стабильных характеристик как в клиническом, так и в технологическом плане;

- наличие высокой скорости роста и размножения в условиях, близких к таковым в кишечном тракте;

- штаммы молочнокислых палочек должны продуцировать преимущественно L(+) – изомер молочной кислоты;

- при введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта во внутреннюю среду макроорганизма;

- наличие четкой физиолого-биохимической и генетической маркировки как для исключения фальсификации, так и для периодического контроля идентичности свойств исходных и производственных культур.

Удовлетворяющие всем этим требованиям штаммы поступают в контрольный институт, откуда их передают в фармацевтическое производство с соответствующими документами, отражающими их характеристики [6].

В заводских лабораториях штаммы высеивают на искусственные питательные среды, проверяют их соответствие паспортным данным (род, вид, биологические свойства). После этого их используют для получения препаратов пробиотиков. В условиях промышленного производства эти штаммы рассеивают и получают отдельные колонии, которые затем пересевают на агаризированные или жидкие питательные среды (например, молочнокислые бактерии хорошо растут в обезжиренном молоке).

Бифидобактерии, лактобациллы, энтерококки – это ауксотрофы. Они не могут сами синтезировать аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, поэтому их должна содержать питательная среда, в которой они выращиваются. Для культивирования этих бактерий используется сырье, разрешенное в пищевой промышленности, так как препарат, выращенный на этих средах, используется для внутреннего применения.

Источником аминокислот обычно служит белок молока (казеин), который гидролизуют с помощью ферментов (трипсина и пепсина) и получают, соответственно триптол или пептол. Как источник витаминов, а также пиримидиновых и пуриновых оснований используют дрожжевой экстракт, который получают из дрожжей Saccharomyces (пивных либо пекарстких). В качестве микроэлементов используют соли магния, марганца, цинка, которые добавляют в питательную среду для культивирования молочнокислых бактерий. Источником энергии служит лактоза или глюкоза.

Молочнокислые бактерии культивируют от 8 до 16часов, собирают штаммы в той фазе роста, при которой выживание клеток будет наиболее длительным. Это обеспечит длительное хранение полученного препарата.

После процесса культивирования получают бактериальную суспензию, содержащую в 1 мл 109 и более клеток. Эти клетки собирают, используя поточные центрифуги или сепараторы, в которой образуется похожая на сметану с кремовым оттенком масса со специфическим запахом кислого молока. Раствор криопротекторов (вещества белковой природы - обезжиренное молоко или желатин, углеводы – лактоза, сахароза) добавляют в проточную массу и получают густую суспензию клеток, которую разливают в ампулы.

Затем их замораживают в жидком азоте и подвергают лиофильной сушке. Сухая масса приобретает пузырчатый вид. Ее измельчают и определяют титр, в соответствии с которым вносят во флаконы или смешивают с культурой другого штамма.

Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры (-400ºС) и глубокого вакуума.

Укупорку сухих биопрепаратов в виду их гигроскопичности производят под вакуумом или в токе инертного газа.

Форма выпуска – флаконы (бифидумбактерин), или ампулы (бификол), или капсулы («Нутролин В»), или пакетики (бифидумбактерин фирмы «Партнер»).

Заключение

Велика защитная роль нормофлоры в обеспечении здоровья, поэтому нарушение равновесия между отдельными видами микроорганизмов в местах их постоянного обитания за счет более интенсивного размножения или гибели какого-либо вида может повлечь нарушение гомеостаза с соответствующими последствиями патологического характера. Дисбиотические состояния приводят к изменениям количественного и качественного состава нормофлоры человека.

Нормальная микрофлора кишечника в процессе эволюции приобрела исключительно важную роль в формировании колонизационной резистентности организма.

Одним из главных механизмов защиты от колонизации условно-патогенными и патогенными бактериями является присутствие в организме достаточного количества собственной полезной микрофлоры.

Нормальная микрофлора кишечника играет важную роль в конверсии желчных пигментов м желчных кислот, абсорбции питательных веществ и продуктов их расщепления. Ее представители продуцируют аммиак и другие продукты, которые могут адсорбироваться и участвовать в развитии печеночной комы.

Нормофлора кишечника выполняет и регулирует многие функции организма, которые можно уподобить работе лаборатории, осуществляющей многие сотни биохимических процессов.

Поэтому очень важно поддерживать нормальную работу микрофлоры организма человека.

Список литературы

1. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки: Пер. с англ. / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис. – М.: Мир, 1994. – Т.1. – 515с.

2. Барзашка – Попова С.Н. Коррекция микрофлоры кишечника при дисбактериозе с помощью лактобацилл / С.Н. Барзашкина-Попова: Автореф. Дис. …к.б.н. – М., 1990. – 22с.

3. Биотехнология: Учебное пособие для вузов / Под. ред. Н.С. Егорова. – М.: 1987.

4. Качура В.И. Способы высушивания молочнокислых бактерий // Виноделие и виноградорство СССР.- 1985. – №2. – С. 49-50.

5. Михайлов И.Б. Клиническая фармакология / И.Б. Михайлов. – СПб., 1998. – 473с.

6. Промышленная технология лекарств: В 2-х т. / Под. ред. В.И. Чуешова. – Харьков: НФАУ, МТК-книга, 2002, - Т.1. – 557с.; Т.2. – 714с.

7. Северин С.Е. Биохимия и медицина – новые подходы и достижения / С.Е. Северин. – М.: Русский врач, 1998. – 94 с.

8. Сорокулова И.Б., Белявская В.А. Рекомбинантные пробиотики: проблемы использования в медицине и ветеринарии.//Вест.Рос. АМН. – 1997. - №3 – с.17-19.