ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЯ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
ЧИТИНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией
КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА
по микробиологии
тема: Поксвирусы – возбудители натуральной оспы.
Выполнила: Курмазова И.В.
факультет ВСО, заочного
обучения, курс 2, группа 151
Проверил:
г. Чита – 2005 г.
Содержание
Введение………………………………………………………………...…………3
1. Поксвирус – возбудитель натуральной оспы…….………………….………..6
1.1 Морфология………………………………………………………….........…..6
1.2 Культивирование.…….………………………………………………….........6
1.3 Антигенная структура…………………………...……………………............7
1.4 Резистентность…………………………………………………………...........7
2. Патогенность для животных………...………………………………………...8
3. Патогенез заболевания у человека…..………………………………………...9
4. Иммунитет…………………………………..…………………...………….…11
5. Лабораторная диагностика……………………...………………...……….....12
5.1 Прямые методы диагностики клинического материала………........……..14
5.2 Непрямые методы диагностики…………………………........…………….18
5.3 Серодиагностика……………………………………………….........……….19
6. Профилактика…………………………………..……………………...……...22
Вывод………………………………………………………………………......…23
Литература…………………………………………………………………….....24
Введение
Вирусы (от лат. virus — яд), мельчайшие неклеточные частицы, состоящие из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой оболочки (капсида). Капсид ( от лат. сарsa — вместилище, ящик), белковая оболочка вируса, предохраняющая его нуклеиновую кислоту от внешних воздействий. Состоит из отдельных структурных идентичных единиц — капсомеров.
Формы могут быть различными, как палочковидная, так и сферическая. Размер 15 — 350 нм и более. Открыты (вирусы табачной мозаики) Д. И. Ивановским в 1892.
Вирусы — внутриклеточные паразиты: размножаясь только в живых клетках, они используют их ферментативный аппарат и переключают клетку на синтез зрелых вирусных частиц — вирионов. Варион, полностью сформированная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки (капсида). Хранит и переносит генетический материал вируса от одной клетки к другой.
Распространены вирусы повсеместно и вызывают болезни не только растений и животных, но и человека. Резко отличаясь от всех других форм жизни, вирусы, подобно другим организмам, способны к эволюции. Иногда их выделяют в особое царство живой природы. Вирусы широко применяются в работах по генной инженерии, канцерогенезу.
Вирусы бактерий (бактериофаги) — классический объект молекулярной биологии. Бактериофаги (от бактерии и греч. phagos — пожиратель) – вирусы бактерий способные поражать бактериальную клетку, репродуцироваться в ней и вызывать ее лизис. Классический объект исследований в молекулярной генетике. Используются для фагопрофилактики и фаготерапии инфекционных болезней.
Бактерии (от греч. bakterion — палочка), группа микроскопических, преимущественно одноклеточных организмов. Относятся к «доядерным» формам — прокариотам. В основу современной классификации бактерий, по которой все бактерии делят на эубактерий (грамотрицательные бактерии и грамположительные бактерии, микоплазмы) и архебактерий, положено строение их клеточной стенки. По форме клеток бактерии могут быть шаровидными (кокки), палочковидными (бациллы, клостридии, псевдомонады), извитыми (вибрионы, спириллы, спирохеты); диаметр 0,1-10 мкм, длина 1-20 мкм, а нитчатых многоклеточных бактерий — 50-100 мкм. Некоторые бактерии образуют споры. Многие подвижны, имеют жгутики. Питаются, используя различные органические вещества (гетеротрофы) или создавая органические вещества клеток из неорганических (автотрофы). Способны расти как в присутствии атмосферного кислорода (аэробы), так и при отсутствии (анаэробы). Участвуют в круговороте веществ в природе, формировании структуры и плодородия почв, в образовании и разрушении полезных ископаемых; поддерживают запасы углекислого газа в атмосфере. Используются в пищевой, микробиологической, химической и других отраслях промышленности. Патогенные (болезнетворные) бактерии — возбудители болезней растений, животных и человека. Полагают, что бактерии — первые организмы, появившиеся на Земле.
Расширение возможностей в лечении и профилактике вирусных болезней с использованием противовирусных препаратов, иммуномодуляторов и вакцин с различным механизмом действия нуждается в быстрой и точной лабораторной диагностике. Узкая специфичность некоторых противовирусных препаратов также требует быстрой и высокоспецифичной диагностики инфицирующего агента. Появилась необходимость в количественных методах определения вирусов для мониторинга противовирусной терапии. Помимо установления этиологии заболевания лабораторная диагностика имеет важное значение в организации противоэпидемических мероприятий.
Ранняя диагностика первых случаев эпидемических инфекций позволяет своевременно провести противоэпидемические мероприятия – карантин, госпитализацию, вакцинацию и пр. Реализация программ по ликвидации инфекционных заболеваний, например, натуральной оспы, показала, что по мере их выполнения возрастает роль лабораторной диагностики. Существенную роль играет лабораторная диагностика в службе крови и акушерской практике, например, выявление доноров, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (HBV), диагностика краснухи и цитомегаловирусной инфекции у беременных.
1. Поксвирус – возбудитель натуральной оспы
Поксвирусы (Poxviridae) – семейство крупных ДНК-содержащих вирусов, вызывающих у человека, животных (коров, овец, коз, верблюдов, лошадей, свиней, кроликов) и птиц заболевания с выраженным поражением кожи - пустулезного дерматита, папулезного стоматита, миксомы и конгиозного моллюска человека, т.е. натуральную оспу.
Вирус натуральной оспы – крупный вирус, относящийся к Orthopoxvirus. Несмотря на то, что натуральная оспа известна человечеству с давних времен и широко распространена во многих странах мира, этиология этой болезни была окончательно установлена только в начале двадцатого века. В 1892 году Г.Гуарниери обнаружил в гистологических срезах роговицы кролика, зараженного оспенным материалом, внутриклеточные включения величиной от 1—4 до 10 мкм, имеющие шаровидную или серповидную форму. В 1906 году Э. Пашен, применив специальный метод окраски, выявил в содержимом пузырьков вирусные корпускулы.
1.1 Морфология
Вирус оспы отличается сложностью строения, он имеет форму параллелепипеда с закругленными углами. Размер его 200—250 нм. Он состоит из нуклеотида, покрытого трехслойной оболочкой. От наружного осмиофильного слоя отходят ворсинки. На противоположных сторонах вириона под оболочкой расположены два боковых тела, похожие на линзы.
1.2 Культивирование
Вирус натуральной оспы хорошо развивается в куриных эмбрионах, спустя 48—72 часа после заражения. На хорион – аллантоисной оболочке вызывает образование белых мелких, плотных, резко отграниченных от окружающей ткани точечных поражений. Вирус хорошо культивируется на первичных и перевиваемых клеточных культурах человека, обезьяны, овцы и других животных, в которых обнаруживаются через 24—72 часа после заражения выраженное цитопатическое действие, проявляющихся округлением и увеличением клеток с последующим их отторжением их от стекла.
1.3 Антигенная структура
У вируса натуральной оспы не обнаружено антигенных разновидностей или вариантов, он имеет общие антигены с вирусом вакцины. Различают четыре антигена: растворимые L и S, нуклеопротеидный (NP), антигены и Х –гемагллютиин. Вирус оспы имеет общие антигены с эритроцитами человека группы А и АВ.
1.4 Резистентность
Возбудитель оспы устойчив к действию фенола, высыханию, в высушенных оспенных корочках и в 50% глицерине сохраняется месяцами, легко переносят низкую температуру. Вирус чувствителен к действию света, при температуре 1000С погибает моментально. При 600С в течение 1 часа; 3% раствор хлорамина, фенола, лизола инактивирую вирус через 30 минут, а 1% раствор хлорной извести – через 1 час; при действии перманганата калия погибает через 70 минут.
2. Патогенность для животных
К вирусу натуральной оспы чувствительны обезьяны; при введении им вируса в кожу или тестикулы появляется специфические высыпания на коже, развивается архит, а иногда генерализация процесса. У кроликов и морских свинок наблюдаются незначительные местные поражения, а у новорожденных белых мышей при заражении в мозг развивается оспенный энцефалит.
3. Патогенез заболевания у человека
Натуральная оспа - карантинное заболевание человека. Вызывается поксвирусом. Характеризуется лихорадкой и сыпью, оставляющей рубцы. Передается от больного через воздух и предметы. В народе ее называют «Ветряная оспа».
Источник болезни – больной человек. Заражение оспой происходит воздушно—капельным и воздушно—пылевым путем, а также посредством контакта с заразным материалом. Возбудитель передается при разговоре, кашле, чихании, через пылевые частицы и предметы (одежда, белье, посуда). За последние годы были зарегистрированы случаи оспы у людей, инфицированных вирусом обезьяньей оспы.
Патогенез натуральной оспы изучен недостаточно. Известно, что во время болезни в крови находится вирус, который обладает резко выраженными дерматотропными свойствами. Он также поражает слизистые оболочки и другие ткани и органы. Наряду с вирусемией нередко наблюдается и бактериемия, вызванная стрептококками и стафилококками.
Для натуральной оспы характерная лихорадка, высыпание, образование пустул и рубцов на коже. После продромального периода и падения температуры появляется истинная сыпь на лице, туловище и конечностях; в начале она имеет папулезный характер, затем превращается в везикулезную и пустулезную. Оспенные везикулы многокамерные с прозрачным содержимым, придающим им вид жемчужины с перламутровым блеском, окруженным красным узким ободком. Оспенные пустулы имеют кратерообразные вдавления на вершине.
В стадии нагноения присоединяется вторичная (стафилококковая и стрептококковая) инфекция. У большинства переболевших на месте глубоких пустул образуются рубцы (рябины).
Летальность в зависимости от тяжести болезни колеблется в широких пределах – от 0 до 100%; в среднем она равна 15—20%, при геморрагической форме – 100%. При легких формах и вариолоиде летальных исходов обычно не бывает. У лиц с группой крови А и АВ натуральная оспа протекает тяжелее, смертельные исходы и поствакцинальные осложнения бывают чаще, постинфекционные и поствакцинальный иммунитет слабого напряжения.
К числу легких форм натуральной оспы относится вариолоид. Вариолоид характеризуется более коротким и легким течением, отсутствием сыпи или лихорадки.
Аластрим – самостоятельное, но сходная с натуральной оспой заболевание. Аластрим протекает как легкая форма натуральной оспы. Характеризуется меньшей контагиозностью. Папулезно—пузырьковая сыпь образуется в основном на лице и конечностях, цикл ее развития короче, чем при натуральной оспе. Оспенные пузырьки не имеют кратерообразных вдавлений на вершине, при отпадании корочек рубцы не остаются. Летальность низкая до 1%.
4. Иммунитет
У большинства людей, болевших оспой, остается прочный иммунитет. Повторные заболевания крайне редки. У переболевших и вакцинированных в крови можно обнаружить агглютинины, комплементсвязывающие, вируснейтрализующие антитела, а также преципитины и лизины.
5. Лабораторная диагностика
Для диагностики оспы применяют вирусоскопические, вирусологические и серологические методы исследования.
Вирусоскопия заключается в обнаружение телец Пашина в мазках, приготовленных из содержимого везикул и пустул, окрашенных серебрением или обработанных люминесцирующими красителями (примулином). При просмотре их в люминесцентном микроскопе вирусные частицы легко дифференцируются по яркости и характере свечения.
Тельца Гуарниери выявляют в клетках в клетках роговицы кролика, зараженного исследуемым материалом. Препараты обрабатывают по Романовскому—Гизе, Манну, люминесцентными красителями.
Вирусологические исследования производятся для выделения вируса на хорион—аллантоисной оболочки куриного эмбриона и в культурах тканей, а также для идентификации при помощи специфических сывороток в реакциях связывания комплемента и реакции торможения гемагглютинации, задержки гемадсорбции, иммунофлюоресценции.
Для серологической диагностики оспы применяют реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента, нейтрализации на куриных эмбрионах и тканевых культурах.
Специфический антиген можно обнаружит в везикулярной жидкости и корочках с помощью реакции преципитации в геле, а также реакции непрямой гемагглютинации с использованием бараньих эритроцитов, сенсибилизированных противооспенными антителами.
В дифференциации натуральной оспы от ветряной оспы генирализованной вакцины аластрима учитываются характер высыпаний, очередность их появлений и исчезновения, полиморфизм, особенности, свойственные их возбудителям при культивировании культуры клеток и культурных эмбрионах, лабораторные данные.
Лечение специфическое не разработано. Первые дни болезни применяют противооспенный иммуноглобулин, полученный из крови людей, специально ревакцинированных против оспы, а также метисазон (марборан). При развитии вторичной инфекции назначают антибиотики (пенициллин, левомитецин, стрептомицин, окситетрациклин).
В лабораторной диагностике вирусных инфекций имеются три основных подхода:
1) непосредственное исследование материала на наличие вирусного антигена или нуклеиновых кислот;
2) изоляция и идентификация вируса из клинического материала;
3) серологическая диагностика, основанная на установлении значительного прироста вирусных антител в течение болезни.
При любом выбранном подходе к вирусной диагностике одним из важнейших факторов является качество исследуемого материала. Так, например, для прямого анализа образца или для изоляции вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще экскретируется в относительно больших количествах и не связан пока антителами, а объем образца должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Также важен выбор материала в соответствии с предполагаемым заболеванием, то есть того материала, в котором исходя из патогенеза инфекции вероятность присутствия вируса наибольшая.
Не последнюю роль в успешной диагностике играет среда, в какую берется материал, как он транспортируется и как хранится. Так, носоглоточные или ректальные мазки, содержимое везикул помещают в среду, содержащую белок, предотвращающий быструю потерю инфекционности вируса (если планируется его изоляция), или в соответствующий буфер (если планируется работа с нуклеиновыми кислотами).
5.1 Прямые методы диагностики клинического материала
Прямые методы – это методы, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту (НК) непосредственно в клиническом материале, то есть являются наиболее быстрыми (2–24 ч). Однако из-за ряда особенностей возбудителей прямые методы имеют свои ограничения (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов). Поэтому они часто требуют подтверждения непрямыми методами.
Электронная микроскопия (ЭМ). С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса его концентрация в пробе должна быть примерно 1·106 частиц в 1 мл. Но поскольку концентрация возбудителя, как правило, в материале от больных незначительна, то поиск вируса затруднен и требует предварительного его осаждения с помощью высокоскоростного центрифугирования с последующим негативным контрастированием. Кроме того, ЭМ не позволяет типировать вирусы, так как у многих из них нет морфологических различий внутри семейства. Например, вирусы простого герпеса, цитомегалии или опоясывающего герпеса морфологически практически неотличимы.
Одним из вариантов ЭМ, используемым в диагностических целях, является иммунная электронная микроскопия (ИЭМ), при которой применяются специфические антитела к вирусам. В результате взаимодействия антител с вирусами образуются комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются.
ИЭМ несколько более чувствительна, чем ЭМ, и используется в тех случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro, например при поиске возбудителей вирусных гепатитов.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Метод основан на использовании антител, связанных с красителем, например флюоресцеинизотиоцианатом. РИФ широко применяется для выявления вирусных антигенов в материале больных и для быстрой диагностики.
В практике применяются два варианта РИФ: прямой и непрямой. В первом случае применяются меченные красителем антитела к вирусам, которые наносятся на инфицированные клетки (мазок, культура клеток). Таким образом, реакция протекает одноэтапно. Неудобством метода является необходимость иметь большой набор конъюгированных специфических сывороток ко многим вирусам.
При непрямом варианте РИФ на исследуемый материал наносится специфическая сыворотка, антитела которой связываются с вирусным антигеном, находящимся в материале, а затем наслаивается антивидовая сыворотка к гамма-глобулинам животного, в котором готовилась специфическая иммунная сыворотка, например антикроличья, антилошадиная и т. п. Преимущество непрямого варианта РИФ состоит в потребности лишь одного вида меченых антител.
Метод РИФ широко применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций при анализе мазков-отпечатков со слизистой оболочки верхних дыхательных путей. Успешное применение РИФ для прямой детекции вируса в клиническом материале возможно лишь в случае содержания в нем достаточно большого числа инфицированных клеток и незначительной контаминации микроорганизмами, которые могут давать неспецифическое свечение.
Иммуноферментный анализ (ИФА). Иммуноферментные методы определения вирусных антигенов в принципе сходны с РИФ, но основываются на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также а-галактозидазу и в-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде нерастворимого осадка, и тогда учет проводится с помощью обычного светового микроскопа, или в виде растворимого продукта, который обычно окрашен (или может флюоресцировать или люминесцировать) и регистрируется инструментально.
Поскольку с помощью ИФА можно измерять растворимые антигены, то не требуется наличия интактных клеток в образце, и таким образом могут использоваться различные виды клинического материала.
Другое важное преимущество метода ИФА – возможность количественного определения антигенов, что позволяет применять его для оценки клинического течения болезни и эффективности химиотерапии. ИФА, как и РИФ, может применяться как в прямом, так и в непрямом варианте.
Твердофазный ИФА, дающий растворимый окрашеный продукт реакции, нашел наибольшее распространение. ИФА может быть использован как для определения антигена (тогда на твердую фазу – дно лунки полистиролового планшета – наносятся антитела), так и для определения антител (тогда на твердую фазу наносятся антигены).
Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).
Молекулярные методы. Первоначально классическим методом выявления вирусного генома считался высокоспецифичный метод гибридизации НК, но в настоящее время все шире используется выделение геномов вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот. Метод основан на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК с образованием двунитевых структур и на выявлении их с помощью метки. Для этой цели используются специальные ДНК - или РНК-зонды, меченные изотопом (32Р) или биотином, обнаруживающие комплементарные нити ДНК или РНК. Существуют несколько вариантов метода:
– точечная гибридизация – выделенную и денатурированную НК наносят на фильтры и затем добавляют меченый зонд; индикация результатов
– авторадиография при использовании 32Р или окраска – при авидин-биотине;
– блот-гибридизация – метод выделения фрагментов НК, нарезанных рестрикционными эндонуклеазами из суммарной ДНК и перенесенных на нитроцеллюлозные фильтры и тестируемые мечеными зондами; используется как подтверждающий тест при ВИЧ инфекции;
– гибридизация in situ – позволяет определять НК в инфицированных клетках.
ПЦР основана на принципе естественной репликации ДНК. Суть метода заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусоспецифической последовательности ДНК с помощью термостабильной Taq ДНК-полимеразы и двух специфических затравок – так называемых праймеров.
Каждый цикл состоит из трех стадий с различным температурным режимом. В каждом цикле удваивается число копий синтезируемого участка. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации, что позволяет за 25–35 циклов наработать достаточное число копий выбранного участка ДНК для ее определения, как правило, с помощью электрофореза в агарозном геле.
Метод высокоспецифичен и очень чувствителен. Он позволяет
8-09-2015, 22:48