Лабораторная диагностика токсоплазмоза

Диагностика токсоплазмоза

Диагностика острого токсоплазмоза основана на выделении токсоплазм из жидкостей организма или крови, обнаружении тахизоитов в гистологических срезах (или в мазках-отпечатках) или жидкостях организма, выявлении характерных гистологических изменений в лимфатических узлах, а также на результатах тестов.

Выделение возбудителя

Возбудители могут быть выделены при введении лейкоцитов, жидкостей организма или образцов тканей в тканевую культуру или заражении мышей путем подкожной или внутрибрюшинной инокуляции им исследуемого материала. Жидкости организма должны быть обработаны и введены немедленно, а кровь и ткани могут сохраняться некоторое время (в течение ночи) при +4°С. Замораживание или обработка образцов формалином губительно действуют на возбудителя. Мышей следует обследовать на наличие паразитов в перитонеальной жидкости через 6 - 10 дней после инокуляции или, в случае их гибели, раньше. Мышей, выживших в течение 6 нед, необходимо обследовать на наличие антител к токсоплазмам в сыворотке. При обнаружении антител и визуальном выявлении цист токсоплазм в головном мозге диагноз подтверждается. Если у мышей, в крови которых присутствуют антитела против токсоплазм, цисты в головном мозге не обнаружены, кусочки их головного мозга, печени и селезенки следует ввести другим мышам.

У большинства больных выделение токсоплазм как из жидкостей организма, так и из крови свидетельствует об острой стадии инфекции. Хотя персистирующая паразитемия и была описана у лиц с латентной инфекцией, это достаточно редкий случай, исключая, возможно, больных с хроническим миелолейкозом. Выделение паразитов из тканей (скелетных мышц, легких, головного мозга или глаз), полученных при биопсии или аутопсии, может свидетельствовать о наличии тканевых цист, но не является доказательством острой инвазии.

Гистологическая диагностика

Обнаружение тахизоитов в срезах тканей (эндомиокардиальных биоптатах от реципиентов трансплантатов сердца), в мазках (из биоптата головного мозга, пунктата костного мозга) или в жидкостях организма (спинномозговая, амниотическая жидкость) дает основание для диагностики острой инвазии. Тахизоиты трудно идентифицировать с помощью обычных методов окраски; для этих целей используются прямой и непрямой методы выявления флюоресцирующих антител и метод пероксидазо-антипероксидазной (ПАП) иммуногистохимической окраски. Обнаружение тканевых цист не позволяет отдифференцировать острую инвазию от хронической. Наличие множества цист в каком-либо органе свидетельствует о недавнем заражении. Характерные гистологические признаки имеются при токсоплазмозном лимфадените.

Серологические тесты

Методами, наиболее широко используемыми для диагностики острого токсоплазмоза, служат:

реакция с красителем Сейбина-Фельдмана,

непрямая реакция флюоресцирующих антител (НРФА),

реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Перспективным является определение антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или радиоиммунного метода, так как эти методы могут быть автоматизированы.

Тест с красителем, определяющий антитела класса IgG, можно рассматривать как чувствительный и специфичный. По рекомендациям ВОЗ титры в тесте с красителем следует выражать в международных единицах (МЕ/мл).

Непрямая реакция флюоресцирующих антител пригодна для определения тех же антител, что и тест с красителем, и является наиболее широко используемым методом диагностики. В обеих реакциях титры имеют тенденцию изменяться параллельно. Нейтрализующие антитела IgG в тесте с красителем и антитела в непрямой реакции флюоресценции обычно выявляются через 1 - 2 нед после заражения, достигают высоких титров (1:1000) через 6 - 8 нед и постепенно снижаются на протяжении нескольких месяцев или лет; низкие титры (1:4 или 1:64) обычно персистируют в течение всей жизни. Величина титра антител не коррелирует с тяжестью заболевания.

Наборы для постановки реакции агглютинации выпускаются с коммерческими целями фирмой Bio-Merieux (Лион, Франция). Эта реакция выявляет антитела класса IgG. В качестве антигена используются цельные паразиты, консервированные в формалине. Так как реакция весьма чувствительна к антителам класса IgM, «естественные» антитела IgM часто являются причиной неспецифической агглютинации в сыворотке крови лиц с отрицательными результатами в тесте с красителем и непрямой реакции флюоресцирующих антител. Проблему удается устранить использованием в реакции агглютинации 2-меркаптоэтанола. Эту реакцию не следует использовать для определения антител IgM. Она является простым, точным, недорогим и эффективным методом для скрининга сывороток беременных женщин и используется при выявлении антител к токсоплазмам у больных со СПИДом.

Непрямую реакцию флюоресцирующих антител-IgM (IgM-НРФА) используют для диагностики острого токсоплазмоза, так как антитела IgM появляются рано (уже через 5 дней после заражения) и рано исчезают в отличие от антител γ-О-глобулина (IgG). В большинстве случаев антитела IgM-НРФА быстро повышаются (достигая уровня 1:80 - 1:1000) и снижаются до невысоких титров (1:10 - 1:20) или исчезают в течение нескольких недель или месяцев. Однако у некоторых больных они сохраняются на низком уровне на протяжении нескольких лет. У некоторых иммунодефицитных больных с острым токсоплазмозом и у большей части больных с наличием только активного токсоплазмоза глаз антитела IgM к токсоплазмам могут отсутствовать. Причиной ложноположительной реакции IgM-НРФА может служить ревматоидный фактор, удаление которого (путем абсорбции) устраняет ложноположительные результаты в этой реакции. Антинуклеарные антитела могут быть причиной ложноположительных реакций как в НРФА, так и в IgM-НРФА.

Дабл-сэндвич твердофазный иммуноферментный анализ (DS-ELISA IgM) более чувствителен и специфичен, чем IgM-НРФА для выявления антител класса IgM. При этом антинуклеарные антитела и ревматоидный фактор не являются причиной ложноположительных результатов исследования.

При интерпретации результатов этой реакции у взрослых больных используются следующие критерии:

содержание в сыворотке антител класса IgM против токсоплазм от 6 до 10 указывает на то, что заражение токсоплазмозом, вероятнее всего, произошло недавно (т.е. в пределах предшествующих 5 мес);

уровень от 2 или 3 указывает на то, что инвазия существовала уже несколько месяцев или долее;

уровень 4 или 5 можно рассматривать как промежуточный,

уровень 0 или 1 свидетельствует об отсутствии инфекции.

DS-IgM-ELISA более специфичен и чувствителен, чем IgM-НРФА для диагностики врожденного и острого приобретенного токсоплазмоза. DS-IgM-ELISA выявляет приблизительно 75% младенцев с врожденной токсоплазмозной инфекцией, в то время как IgM-НРФА - лишь 25% младенцев с подтвержденным врожденным токсоплазмозом. DS-IgM-ELISA не дает ложноположительных результатов при наличии ревматоидного фактора (который может продуцировать плод) и ложноотрицательных результатов вследствие конкуренции, обусловленной высоким уровнем материнских антител IgM (что отмечается в IgM-НРФА).

IgM-иммуносорбентный метод (IgM-ISA) предназначен для выявления антител IgM и сочетает фиксацию IgM к твердой поверхности и обработанным формалином паразитам или частичкам латекса, покрытым антигеном. Он является специфичным, чувствительным, не требует использования энзимных конъюгатов и прост в исполнении.

Антитела, определяемые в РНГА, могут персистировать годами и отличаются от антител, выявляемых в НРФА и тесте с красителем. Применение РНГА целесообразно в тот период времени, когда титры в НРФА или в тесте с красителем стабилизировались, поскольку титры РНГА повышаются позднее. Однако повышение титров может произойти настолько поздно, что не будет иметь диагностического значения в случае острой инвазии. Ввиду большой частоты случаев ложноотрицательных результатов РНГА не может быть использована у детей с подозрением на врожденную инвазию или при скрининге для определения возможности заражения во время беременности, так как реакция может быть отрицательной в течение длительного периода в начале инфекции.

Титры в реакции связывания комплемента (РСК) также могут появляться несколькими неделями позднее, чем это установлено в НРФА и тесте с красителем, и также могут персистировать в течение ряда лет. Отрицательный результат в РСК не исключает острой или хронической инфекции, положительный же титр только в одной РСК не доказывает наличия острой инфекции. Существенное повышение титра в РСК, порядка двух серийных разведении при одновременной постановке реакции с парными сыворотками свидетельствуют о недавно приобретенной инфекции.

Острый приобретенный токсоплазмоз у иммунокомпетентных лиц

При подозрении на наличие острой приобретенной инфекции у иммунокомпетентного человека отрицательные результаты теста с красителем или НРФА фактически исключают этот диагноз. Подтвердить диагноз недавно приобретенной острой инфекции может лишь двукратное повышение титров при одновременном исследовании парных сывороток, полученных с интервалом в 3 нед или наличие сероконверсии от отрицательных к положительным титрам (при отсутствии передачи антител при трансфузии). Отдельный высокий титр в любой реакции не доказывает наличия активной инфекции.

Титры теста с красителем или НРФА >1:1000, высокий титр IgM-НРФА (>1:80) или высокие титры DS-IgM-ELISA или IgM-ISA (>6, как ориентир) подтверждают вероятность недавнего острого заражения как при наличии, так и при отсутствии симптомов. У лиц с положительным титром в тесте с красителем или в НРФА отсутствие антител в IgM-НРФА или DS-IgM-ELISA или IgM-ISA почти исключает недавнюю инфекцию.

Токсоплазмоз глаза

Диагностика токсоплазмоза глаза у. детей старшего возраста и взрослых затруднена тем, что уровень титров антител в сыворотке крови не всегда коррелирует с наличием активных поражений в глазном дне. У больных с активным токсоплазмозным хориоретинитом выявляют невысокие титры в серологических реакциях (1:4 - 1:64).

Если результаты серологической реакции, выполненной на неразведенной сыворотке, отрицательные, токсоплазмозный хориоретинит исключают.

Если поражения сетчатки являются характерными и серологические реакции положительны, диагноз может быть установлен с высокой степенью точности.

Если поражения сетчатки атипичны и серологические тесты положительны, диагноз токсоплазмоза является только предположительным; высокая распространенность антител против токсоплазм у нормальных людей исключает предположение о причинной связи.

Активная инфекция у больных с ослабленным иммунитетом. В связи с тем, что формирование антител у больных с ослабленным иммунитетом неполноценно, имеющиеся в настоящее время серологические методы, включая IgM-НРФА, DS-IgM-ELISA и IgM-ISA, являются недостаточными для выявления активной инфекции. Серологические тесты для скрининга на токсоплазмоз целесообразно использовать у больных с ослабленным иммунитетом и бессимптомной инфекцией с целью выявления лиц, находящихся под риском первичного заражения или обострения латентной инфекции. Выявление антигенов токсоплазм в сыворотке крови и, возможно, в спинномозговой жидкости с помощью ELISA является перспективным дополнительным методом для диагностики диссеминированной токсоплазмозной инфекции у больных с ослабленным иммунитетом.

Токсоплазмоз и токсоплазмозная инфекция у беременных женщин

У каждой женщины, готовящейся зачать ребенка, необходимо определить серологический статус с целью выявления зараженных и обеспечения их необходимой информацией о результатах исследований в течение беременности.

При отсутствии обычной программы скрининга, в рамках которой реакции на токсоплазмоз неоднократно выполняются в течение беременности, следует проводить тесты IgM-НРФА, DS-IgM-ELISA или IgM-ISA, если другие серологические тесты были положительными в любой период беременности.

Если нет возможности поставить тест IgM-НРФА, DS-IgM-ELISA или IgM-ISA, повторное серологическое тестирование следует проводить через 3 нед для определения стабильности титра или тенденции к повышению.

Если тесты IgM-НРФА, DS-IgM-ELISA или IgM-ISA отрицательны, а НРФА или тест с красителем стабильны и менее 1:1000 (<300 ME), необходимости в дальнейшей оценке нет.

Если тест с красителем или НРФА больше или равны 1:1000 (>300 ME) и стабильны (не считая титров в тесте IgM-НРФА), инфазию следует рассматривать как приобретенную по меньшей мере в течение последних 4 нед и, вероятно, более чем за 8 нед до того, как были взяты пробы сыворотки.

С практической точки зрения степень риска для плода весьма невысока, если титр теста с красителем или НРФА больше или равен 1:1000 и стабилен в первые 2 мес беременности.

В то время как титры в тесте с красителем или НРФА достигают пика и стабилизируются к 8-й неделе после заражения, титры в РСК или РНГА продолжают возрастать на протяжении 4 - 6 мес и более. В связи с этим повышение титров в последних двух тестах может быть не столь информативным при установлении времени возникновения инфекции по отношению к срокам беременности и его не следует использовать в качестве единственного критерия для этих целей.

Проблема часто возникает, когда у женщины без клинических признаков инфекции при исследовании на антитела против токсоплазм в конце I или во II триместре беременности обнаруживают титры в НРФА или тесте с красителем в пределах 1:2000, при этом титры в IgM-НРФА, DS-IgM-ELISA или IgM-ISA отрицательны. В этой ситуации невозможно установить, произошло ли заражение до или после зачатия. Выявление антигена токсоплазм в амниотической жидкости может быть полезным дополнительным методом при решении вопроса о том, произошло ли инфицирование плода у женщины, заразившейся токсоплазмозом в период текущей беременности. Однако в настоящее время этот метод является экспериментальным.

Лечение токсоплазмоза

Терапия в.специфических клинических условиях. Необходимость лечения и его продолжительность определяются тяжестью клинической картины и наличием сопутствующих заболеваний.

Специфическую терапию следует продолжать от 4 до 6 нед. у больных с нормальным иммунным статусом, но требующих лечения из-за тяжести и персистенции симптомов или явных поражений жизненно важных органов (хориоретинит, миокардит). В ряде случаев может возникнуть необходимость более длительного лечения.

Лечение больных с ослабленным иммунитетом целесообразно проводить в течение 4 - 6 нед. после полного разрешения всех признаков и симптомов активного заболевания. За этими больными должно быть установлено диспансерное наблюдение, поскольку, могут иметь место рецидивы, требующие безотлагательного повторного лечения.

Для лечения острой инфекции у женщин в период беременности Desmonts и Couvreur рекомендуют спирамицин в общей суточной дозе 2 - 3 г перорально, дробно в 4 приема. Трехнедельный курс лечения чередуют с двухнедельным перерывом. Такой режим следует соблюдать до наступления родов.

Профилактика токсоплазмоза

Меры по профилактике инвазии включают вмешательство в цикл передачи, и их соблюдение особенно важно для больных с иммунодефицитом и серонегативных беременных женщин. Очень важно, чтобы больные из групп риска знали о том, как можно избежать заражения цистами (плохая кулинарная обработка мяса) и спорулированными ооцистами (при контактах с домашними кошками). Для уничтожения цист мясо следует прогревать до 60°С или замораживать при -20°С. (Бытовые морозильные камеры не способны создавать и поддерживать такую температуру.) После приготовления пищи из сырого мяса руки следует тщательно мыть; необходимо также мыть фрукты и овощи, которые могут быть загрязнены ооцистами. Обработка продуктов сухим жаром (66°С) или кипящей водой делает ооцисты неинфективными. Следует избегать контактов с экскрементами кошек.

Данных, позволяющих дать четкие рекомендации относительно использования цельной крови, переливания лейкоцитов или трансплантации органов в случае обнаружения у донора антител против токсоплазм нет. Вместе с тем не следует использовать кровь или продукты крови, полученные от лиц с наличием антител против токсоплазм, для переливания больным с иммуносупрессией, а органы для трансплантации серонегативным реципиентам следует брать от лиц с отрицательными серологическим реакциями на токсоплазмоз.

Эффективной вакцины для профилактики токсоплазмоза не разработано.

Заключение

Токсоплазмоз - это паразитарное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы, глаз, скелетной мускулатуры и мышцы сердца, а также увеличением лимфоузлов, печени и селезенки. Склонно к хроническому течению.

Возбудитель - Toxoplasma gondii - внутриклеточный паразит, относящийся к простейшим.

Заражение человека происходит при контакте с кошачьими испражнениями, с землей и песком, загрязненными ими, а также при опробовании мясного фарша или употреблении недостаточно проваренного мяса. Баранина и свинина часто содержат токсоплазмы (10 - 25%). Контакт с собаками, сельскохозяйственными животными к заражению людей не приводит. Больной человек для окружающих не заразен.

Передача токсоплазм возможна при пересадке органов инфицированных доноров, и при внутриутробном заражении плода от матери через плаценту.

Инкубационный период - около 2 нед.

В зависимости от характера инфицирования различают приобретенный и врожденный токсоплазмоз.

В зависимости от преобладающего синдрома выделяют энцефалитическую, тифоподобную и смешанную формы острого токсоплазмоза.

После стихания процесса острый токсоплазмоз переходит во вторично-хроническую или, реже, вторично-латентную формы.

Диагноз подтверждается исследованиями крови - выявление специфических антител в крови. Наиболее чувствительным и специфическим методом диагностики токсоплазмоза является иммуноферментный анализ (ИФА), т.е. выявление антител классов IgM и IgG к токсоплазмам.

Обследованию на токсоплазмоз подлежат:

в обязательном порядке все беременные женщины в максимально ранние сроки беременности (в идеале - до нее);

женщины, страдающие бесплодием и невынашиванием беременности (выкидыши в сроке до 12 недель).

Список использованных источников

1. Грачёва Л.И. и др. Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение токсоплазмоза. Москва, 1996 г.

2. Руководство по инфекционным болезням под ред. проф. Ю.В. Лобзина СПб, 1996 г.

3. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. Москва, 1995 г.