В настоящее время ПЦР получила дальнейшее развитие в виде ПЦР в реальном времени, способной давать количественную оценку исследуемых нуклеиновых кислот. При проведении ПЦР требуется разрушение клеток и тканей для изоляции нуклеиновых кислот и перевода их в жидкую фазу. Следовательно, результаты ПЦР невозможно связать с конкретным гистологическим типом клетки, определить процент клеток, содержащих исследуемую последовательность.
Молекулярная техника, объединившая высокую чувствительность ПЦР и клеточную локализацию последовательностей, выявляемых гибридизацией insitu, получила название ПЦР insitu. Часто эта техника используется для определения вирусных или провирусных последовательностей нуклеиновых кислот. Помимо этого, ПЦР insituприменяют для изучения эндогенных последовательностей ДНК, включая перестроение клеточных генов, хромосомные транслокации и картирование геномных последовательностей с небольшим числом копий в метафазных хромосомах. Однако эта техника не находит широкого применения из-за лёгкости получения псевдоположительного результата и необходимости проведения большого количества контролей, сложности интерпретации полученных результатов и их низкой воспроизводимости.
Микродиссекция
В связи с вышеизложенным, был предложен метод микродиссекции, позволяющий вырезать отдельные идентифицированные клетки или группы клеток с последующим их анализом с помощью обычной ПЦР. Первые шаги в этом направлении были сделаны путём вырезания бритвой или соскобов интересующих участков ткани на срезе под микроскопом. В дальнейшем стали использовать микроманипуляторы, позволяющие точно выделить отдельные скопления клеток. В обоих методах процесс микродиссекции очень долог и во многом зависит от мастерства оператора. В настоящее время для точной и воспроизводимой микродиссекции всё чаще используют лазеры. В ряде приборов применён принцип лазерной микропучковой микродиссекции, когда точно сфокусированным пучком ультрафиолетового лазера вырезают клетки или область, защищенную фотопигментом, предотвращающим разрушение ДНК в УФ-свете. В других приборах используют принцип лазерного захвата. Этот принцип основан на селективном прилипании выбранных клеток или фрагментов ткани к термопластической мембране, активированной пульсами низкоэнергетического инфракрасного лазера. Термопластическая мембрана, используемая для переноса выбранных клеток, имеет диаметр около 6 мм и располагается на дне оптически прозрачной крышки, которая закрывает 0,5 мл микроцентрифужную пробирку с раствором для экстракции ДНК или РНК. Морфология вырезанных клеток хорошо сохраняется и может быть документирована на всех стадиях процедуры. Поскольку микродиссекция с лазерным захватом не разрушает окружающие ткани, 2—3 участка, содержащие разнородные морфологические структуры (нормальные, пограничные и опухолевые клетки), могут быть взяты для анализа с одного препарата. В настоящее время микродиссекция с лазерным захватом широко используется для анализа генетических изменений ДНК, определения потери гетерозиготности в инвазивных опухолях.
Таким образом, современный патолог обладает возможностью использовать значительный арсенал методов, начиная с рутинных и заканчивая молекулярно-биологическими, для диагностики цитологического и биопсийного материалов.
Выбор тех или иных методов обусловливается видом материала (мазок, криостатный или парафиновый срез), особенностями его фиксации, гистоархитектурными особенностями ткани и конечными целями исследования.
8-09-2015, 19:31