Выполнил: Новак А.Л., 301 гр., л/ф, Владивосток, 1998.
Актуальность проблемы
Особо опасные инфекции (ООИ) - это инфекции, которые могут возникать среди населения в виде отдельных заболеваний, эпидемий и даже пандемий, чаще сопровождая ЧС (стихийные бедствия, войны, массовый голод и т.п.), характеризующиеся природной очаговостью, быстрым распространением и тяжелым течением. Единого во всем мире мнения о том, какие инфекции следует причислять к ООИ пока нет, отечественные эпидемиологи придерживаются такого перечня:
Чума
Туляремия
Миелоидоз
Геморрагические лихорадки
Желтая лихорадка
Холера
Генерализованная форма сибирской язвы
Наиболее вероятное появление ООИ возможно во время ЧС. Резкое ухудшение санитарно-гигиенических условий обостряет эпидемическую ситуацию по инфекциям, которые раннее имели эндемических характер, а завезение инфекции извне прибывающими лицами приводит к тому, что потенциальные источники инфекции оказываются неизолированными и в течение длительного времени имеют многочисленные контакты с окружающими их лицами. В связи с этим до установления окончательного диагноза заболевания соблюдается строгий противоэпидемический режим.
При первых признаках или подозрении на ООИ осуществляется:
Выявление контактных лиц и их обсервация;
Дача антибиотиков широкого спектра действия (доксицилин, тетрациклин и др.), т.е. экстренная профилактика;
Проведение дезинфекционных мероприятий;
Отбор материала от больных и доставка его в лабораторию для микробиологического исследования;
Организация частичной (полной) санобработки конкретных лиц.
В данной работе разбирается этап диагностики ООИ на примере чумы, холеры и туляремии. Если диагноз установлен с достаточной достоверностью, можно определить характер противоэпидемических мероприятий, установить возможный источник инфекции и механизмы его передачи. Именно по этому необходимо и оправдано применение экспресс-методов диагностики ООИ.
Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета
Современная иммунология исключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методов беспредельно разнообразны. Они используются практически во всех разделах биологии, ветеринарии и медицины - от фундаментальных молекулярно-биологических исследовании до медико-генетического консультирования и множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами и медиками. И, тем не менее, особенно важным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает быть тот старейший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которого обеспечивается развитие теории и осуществление практики противоэпидемической работы-диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методы иммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного решения названных проблем и осуществления всех соответствующих противоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именно этому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.
Важнейшей предпосылкой эффективности любых противоэпидемических мероприятий является своевременное прогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и социально-экологических взаимодействий, которые составляют существо эпидемических процессов. Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциации противоэпидемических мероприятий, обусловлено не только самобытностью каждой из существующего множества инфекционных болезней. Очень большое значение имеет в этом отношении фундаментальное явление гетерогенности популяций, входящих в состав соответствующих экологических и социально-экологических систем микроб-жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапа существования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознавание этих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованием иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию противоэпидемических мероприятий.
Экспресс-индикация - это своеобразная разведка большой армии лабораторной диагностики. Она находится на переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методов индикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лабораторной практики и благодаря этому последняя все время совершенствуется.
Основные объективные требования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятся к следующему:
1. получение результатов анализа в максимально короткие сроки (часы, идеально-минуты);
2. возможность проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае-с привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей;
3. бесспорно высокая специфичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащей достоверности анализа;
4. высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов.
Эти требования в равной мере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммунитета. Предпочтительность использования того или иного из существующих методов экспресс-диагностики зависит от многих конкретных условий. Однако наиболее желательным является параллельное использование 2-3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежность получаемого результата.
На ближайшие годы наиболее перспективными следующие направления развития экспресс-индикации микроорганизмов.
Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индикацией биохимических свойств и определением ферментативного спектра микробов. По-прежнему сохранят свою значимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питательных сред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их комбинации, которые с успехом применяются в лабораторной практике. При создании сложных поликомпонентных питательных систем необходимо исходить из различных биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для лучшего проявления жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и других микробов в средах необходимо создавать оптимальные условия для их роста и размножения и одновременно вводить ферментируемые субстраты (углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальных полисубстратных сред производится выделение и накопление чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических признаков. Перспективным следует рассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашей стране разработаны углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторные системы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки . Все эти препараты являются весьма перспективными, они позволяют в течение кратчайшего срока (3-5 ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду, определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов. Автономный препарат - карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет без применения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять биохимические свойства микробов. Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20 биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых "долгоживущих" препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определения биохимических свойств микробов. Электрофизический метод определения ферментативной активности микробов включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным расщеплением исследуемых веществ и образованием различных ионизированных продуктов распад по природе, форме и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и антител, способствующих повышению чувствительности комплексных иммунологических методов. Реакции пассивной гемагглютинации и их модификации связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов (например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных патологических материалах, получаемых от больных, и в объектах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьма чувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологические реакции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных от пораженных людей и животных. Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными, стабильными, не разрушающимися при длительном хранении, а применяемые реакции - простыми по технике постановки (например, стекольные тесты) и исследования с их помощью - экономичными. Совершенствуются реакции с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и антител.
Положительными свойствами такого рода препаратов являются:
отсутствие собственной антигенности;
стабильность при длительном хранении;
демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметном стекле;
высокая скорость прохождения реакции;
экономичность.
Кроме того, полезным и оправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношении перспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производные и ряд других веществ, которые могут способствовать повышению чувствительности серологических реакций.
Иммунохимическое направление, связанное с использованием разнообразных комплексных соединений специфических антител или антигенов с химическими веществами. Присоединенные химические вещества придают им новые феноменологические способности и свойства, тем самым, расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов в частности и лабораторного анализа вообще. Большую популярность и практическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного анализа (прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов. Дальнейшее развитие весьма перспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков, которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие в соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут быть получены препараты с новыми феноменологическими свойствами, позволяющими проводить экспресс-индикацию микробных культур и отдельных клеток с помощью широко распространенных микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).
Иммуноферментное направление, интенсивно развивающееся в последние годы. Разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов путем использования иммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов. Данное направление является весьма перспективным, развитие его может привести в ближайшие годы к появлению новых методов экспресс-индикации микроорганизмов.
Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается с конца 50-х годов. Разработаны многочисленные методы иммуноэлектрофореза. Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречному иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.
Иммунорадиологическое направление связано с использованием разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных с радиоактивными веществами, которые придают им новые феноменологические свойства и способности, р установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненности материала, он остается нераспознанным.
Биологическое направление, связанное с изучением токсических и агрессивных свойств патогенных микроорганизмов. Биологические методы осуществляются на одноклеточных организмах, на культурах клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы более трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.
Физико-химическое направление. Это направление связано с использованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов. Сюда входят методы изучения бактериальных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношении различных антибиотических, химических и лекарственных веществ, а также методы температурной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.
Рецепторное и генетическое направления быстрой индикации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные на этих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощью целлюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстро обнаруживают патогенный стафилококк, содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислотами устанавливают вид патогена.
Комплексное направление ускоренной идентификации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методы экспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов, связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем, позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами на анализ определить комплекс основных признаков патогена или санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.
Направления, связанные с разработкой новых принципов микробиологического анализа. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие 5-10 лет появления новых идей, подходов и принципов в микробиологической науке и смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической и генетической специфичности у микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы быстрой идентификации микроорганизмов.
Основные пути развития экспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы:
создание и конструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать очень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной степени исчерпали свои потенциальные возможности;
разработка новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа.
разработка комплексных методов и видов исследований. Будет продолжаться дальнейшая интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
создание новых схем исследований. Поскольку лабораторная диагностика инфекционных болезней, а также экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучением комплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованием обычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, то создание новых схем исследований с применением новых методов является объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самого процесса развития микробиологического анализа;
разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и лабораторных исследований.
разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований;
автоматизация и компьютеризация исследований.
В современных условиях эти вопросы должны решаться комплексно. Таким образом, рассмотре от 10 лиц. Флаконы помещают в термостат при 370С. Через 3 - 4 часа холерные вибрионы начинают агглютинироваться и постепенно (в течение ближайших 2 часов) падают в виде хлопьев на дно флакона. Исследуя под микроскопом окрашенные мазки и "висячую каплю", обнаруживают склеившихся и частично свободных вибрионов. Через 6 часов дается ответ и в случае обнаружения холерных вибрионов немедленно производится посев индивидуально от каждого из 10 лиц. Такой метод дает возможность исследовать до 16 000 человек за 3 - 4 дня. Метод иммунодиагностической микропленки. Изучение антигенных свойств холерных вибрионов проводят путем постановки пробирочной или пластинчатой реакции агглютинации с использованием сухих лиофилизированных диагностических агглютинирующих холерных 0-сывороток и сывороток Огава и Инаба. Сыворотку разводят в физиологическом растворе или дистиллированной воде и смешивают при постановке агглютинации на стекле с исследуемой культурой вибрионов. При подготовке сыворотки используется дополнительная посуда, что усложняет работу бактериолога, а в оставшейся разведенной сыворотке быстро прорастает бактериальная микрофлора и инактивирует ее. Для изучения антигенной структуры холерных вибрионов были разработан иммунодиагностический препарат в виде микропленок разового применения, который обладал достаточной специфичностью, демонстративностью и экономичностью. Иммунодиагностические холерные микропленки (ИХМП) в виде полимерной пленки с нанесенными высушенными каплями, фиксированными на бумаге, содержат минимальное количество сыворотки, пленкообразующий компонент и консервант. Пленкообразующий компонент связывает, склеивает и фиксирует микроколичества ингредиентов к поверхности носителя, исключает крошение микропленок; консервант предохраняет препарат от разрушения при длительном хранении. Концентрация диагностической сыворотки в ИХМП является достаточной, поскольку после эмульгирования в капле физраствора, антитела содержатся в титре 1:100, что полностью обеспечивает ход реакции. Тем самым обеспечивается достаточная концентрация антител, снижается, расход диагностической сыворотки и исключается возможность ее неиспользования. При этом создаются условия для быстрого растворения ИХМП, контакта ее с холерными вибрионами и проведения реакции непосредственно на полимерной пленке. Готовые ИХМП хранят в темном сухом месте при 4- 7°С в картонных коробках (срок годности 3 года - срок наблюдения) и по мере надобности ИХМП используют для определения холерных вибрионов. Для исключения случайного заражения окружающих предметов ИХМП помещают в чистую чашку Петри. На поверхность ИХМП наносят каплю физиологического раствора, в которой растворяют ее. Разведенную сыворотку смешивают с изучаемой культурой вибрионов, снятой бактериологической петлей с питательной среды. При другом варианте постановки реакции ИХМП снимают скальпелем с бумажной подложки и переносят на предметное стекло, растворяют в капле физиологического раствора и смешивают с изучаемой культурой вибрионов. При положительной реакции через 1-3 мин появляются зерна агглютината, окрашенные в зеленый цвет, а капля просветляется. При отрицательной реакции капля остается гомогенно-мутной. Использованную часть полимерной пленки отрезают, а оставшуюся часть пленки с ИХМП сохраняют в той же чашке Петри для дальнейших исследований. Использование ИХМП в исследованиях вибрионов и других микроорганизмов позволяет получить статистически достоверные результаты, сэкономить дорогостоящие диагностические сыворотки, повысить качество и эффективность исследований. Реакция агглютинации микрометодом.
В последнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием специальных планшеток и микротитровальных игл . Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном, предназначенных для иммунологическ агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же. Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма. Все штаммы вибрионов 040-056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками. Большинство изученных штаммов представителей семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у которого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках. При пользовании этим методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок.
Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность метода позволяют рекомендовать его при идентификации холерных вибрионов, изучении штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности. А также: Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты "раздавленная капля", которые исследуют с помощью темнопольной и фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 минут движение
8-09-2015, 19:13