МУЗ «Первая городская клиническая больница скорой медицинской помощи»
СЕВЕРНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
КУРС КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
Руководитель курса
Проф. Воробьёва Н.А.
Лабораторная диагностика инфекций, передаваемых половым путём
Выполнила
врач-интерн КДЛ
Петрова Л.В.
г. Архангельск
2008 г.
Введение
Эпидемиологическая ситуация, связанная с эпидемическим ростом заболеваний, передаваемых половым путем (ЗППП), стала настолько серьезной, что послужила темой выделения основных проблем современной венерологии и лабораторной диагностики:
1.эпидемический рост сифилиса;
2.появление «новых» ЗППП (урогенитальный хламидиоз, генитальный герпес, микоплазмозы и т.д.), ранее в России не регистрировавшихся;
3.резкое омоложение носителей;
4.существенные перемены в социальном и имущественном статусе пациентов с ЗППП (повышение финансовых возможностей) переводит людей в группу повышенного риска;
5.повышение вероятности вспышки СПИД, поскольку при росте ЗППП, сопровождающихся нарушением целости кожных покровов (сифилис, герпес), увеличивается возможность проникновения вируса в кровь;
6.одновременное обнаружение у пациента нескольких инфекций с различными подходами к диагностике и лечению, что может привести к неадекватной и несвоевременной терапии;
7.трудности регистрации и контроля ЗППП в современных условиях (миграция населения, локальные конфликты, «прозрачность» границ со странами СНГ, расширение возможностей лечения ЗППП вне официальной медицины).
Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путём, имеет большое значение как для выявления больных, так и для установления эффективности проведённой терапии.
В данной работе разберём такие распространенные инфекции как сифилис, гонорея, трихомониаз и хламидиоз, а также методы их диагностики.
1 Сифилис
Сифилис – общее инфекционное заболевание, склонное к хроническому рецидивирующему течению с характерной периодизацией клинических симптомов.
Морфология, устойчивость и культуральные свойства бледных трепонем
Возбудитель сифилиса – бледная трепонема (Treponema pallidum) – микроорганизм спиралевидной формы с одинаковыми по высоте завитками и расстоянием между ними. Обладает характерными движениями:
· Роторное (вокруг своей продольной оси);
· Маятникообразное (поступательное);
· Контактильное волнообразное по всему телу.
Бледная трепонема размножается путем поперечного деления, может существовать в 4 формах (спиралевидная, зернистая, цистная и L‑форма), что вызывает разные клинические варианты течения болезни. В очагах поражения бледная трепонема чаще располагается в межклеточных щелях, в субэндотелиальном пространстве, в пери– и эпиневрии.
Культивирование бледных трепонем на искусственных питательных средах требует сложных специальных сред и анаэробной установки. Культуральные бледные трепонемы быстро теряют свою вирулентность, патогенность и морфологические свойства. Патогенные бледные трепонемы неустойчивы в окружающей среде, на них губительно действует высушивание. Нагревание до 60°С убивает их в течение 15 мин, а до 100°С – моментально. Бледные трепонемы мгновенно погибают в 0,005% растворе хлоргексидина, растворе сулемы 1:1000, 1‑2% растворе фенола, 70° спирте. Кислая и щелочная среда действуют на них губительно. Во влагалищном секрете, который имеет обычно кислую реакцию, трепонемы сразу теряют подвижность.
Эпидемиология сифилиса
Инфицирование происходит половым путем, но возможна передача интраплацентарно (врожденный сифилис), при бытовых контактах (бытовой сифилис) и, в редких случаях, при переливании крови (гемотрансфузионный сифилис). Непосредственная передача возбудителей сифилиса возможна и внеполовым путем – при поцелуях, укусах, кормлении грудью, а также при профессиональных прямых контактах медицинского персонала (гинекологов, хирургов, патологоанатомов, лаборантов и др.).
Важными условиями заражения сифилисом являются наличие в материале от больного достаточного числа вирулентных трепонем, нарушение целости кожного покрова или слизистых оболочек.
Общее течение сифилиса
В течение сифилиса принято различать следующие стадии:
1) инкубационный,
2) первичный,
3) вторичный,
4) третичный.
Инкубационный период – 3 – 6 мес. Первичный период разделяют на серонегативный и серопозитивный, вторичный – на свежий, скрытый и рецидивный, третичный – на активный и скрытый.
Первичный период сифилиса (syphilis primaria) – начальная стадия болезни – манифестирует образованием на месте внедрения бледной трепонемы – первичного аффекта (первичной сифиломы, или твердого шанкра), обусловленного скоплением бледных трепонем. Проникновение трепонем, распространение их по лимфатическим пространствам, в эндо– и периневрии сопровождается продромальными симптомами. Могут выявляться позитивные, но слабо положительные РИФ, РСК, РВ. Необходимо повторное серологическое обследование. Таким образом, первичный период подразделяется на 2 равные стадии: серонегативный, протекающий не более 3 - 4 нед, и серопозитивный, длящийся 3 - 4 нед, завершающийся симптомами вторичного периода при отсутствии лечения.
Вторичный период сифилиса (syphilis secundaria) манифестирует изменениями на коже и слизистых оболочках. Генерализация инфекции проявляется множественными воспалительными процессами в различных органах и тканях. Начальным сигналом служит сопутствующий твердому шанкру регионарный аденит, трансформирующийся в полиаденит, сопровождающийся лихорадочным состоянием, недомоганием, астенизацией, болями в костях, суставах, головными болями, анемией, лейкоцитозом, увеличением СОЭ. Формирующаяся органная патология проявляется гепатитом, панкреатитом, нефрозонефритом, или поражением опорно-двигательного аппарата, нервной системы.
Вторичный период сифилиса варьирует по течению от 2 до 3 – 5 лет при отсутствии лечения. Подразделяется на вторичный свежий (syphilis secundaria recens), скрытый, или латентный (syphilis secundaria latens), который с целью проведения необходимых эпидемиологических мероприятий делят на скрытый ранний и скрытый поздний. Заключительным этапом вторичного периода сифилиса является рецидивный сифилис (syphilis secundaria recidiva).
Третичный период сифилиса (syphilis tertiaria) характеризуется стадийным течением проявлений инфекции, вследствие чего его подразделяют на третичный скрытый и третичный активный. В возникновении третичного сифилиса большое значение придается травме (физическая, механическая, медикаментозная, психологическая и др.), а также факторам, ослабляющим иммуноэкологические защитные силы организма (очаги хронической инфекции, интоксикации, соматические заболевания, алкоголизм, наличие дополнительной венерической инфекции типа хламидиоза, микоплазмоза). В позднем третичном периоде, помимо позднего висцерального сифилиса, возможны явления поздних форм нейросифилиса (спинная сухотка, прогрессивный паралич).
Лабораторная диагностика сифилиса
Наряду с традиционными разрабатываются новые более чувствительные и специфические методы. Особенности биологии бледной трепонемы обусловливают вариабельные ответы организма-хозяина, что клинически выражается в многофазности течения заболевания и сложности серологических реакций.
Методы обнаружения бледных трепонем традиционно подразделяют на прямые (заражение животных, микроскопия в темном поле и т.д.) и непрямые серологические тесты для выявления AT. В свою очередь, серологические методы представлены двумя классами:
1) Нетрепонемные тесты, определяющие AT к липоидным АГ тканей хозяина или возбудителя (VDRL и RPR – плазмореагиновый тест); реактивность в этих местах обычно указывает на повреждение тканей и не всегда специфична в отношении сифилиса. Простота выполнения и низкая стоимость этих тестов позволяет использовать их как отборочные реакции для постановки предварительного диагноза сифилиса при соответствующих клинических симптомах.
2) Трепонемные тесты, в которых используются специфические АГ трепонем, обязательны для подтверждения диагноза (микрогемагглютинационный тест на AT к бледной трепонеме, РПГА и РИФ). Они являются более сложными и дорогостоящими, чем тесты 1-й группы.
В перспективе предполагается использование новых прямых методов определения возбудителя – ИФА и ПЦР, клинические испытания которых дают хорошие результаты при диагностике врожденного сифилиса и нейросифилиса.
Прямая визуализация патогенных трепонем является широко используемым и доступным методом бактериологического их обнаружения. Он заключается в исследовании возбудителя сифилиса непосредственно в тканевой жидкости из высыпных элементов, подозрительных на сифилитические проявления. Тканевую жидкость, полученную способом аппликации, скарификации или пункции, исследуют в наивном препарате в темном поле зрения или в окрашенных препаратах (по Романовскому‑Гимзе, по Бурри или после импрегнации по Фонтану и Морозову). Трепонемы можно выявить в экссудате из очагов поражения при первичном, вторичном свежем, вторичном рецидивном сифилисе, в пунктате, полученном из лимфатических узлов, в соке плаценты при родах. Отсутствие трепонем в типичных очагах поражения может быть обусловлено длительностью существования очага или предварительным лечением пациентов.
Серологическая диагностика
При серологическом обследовании на сифилис применяется комплекс реакций: стандартные (КСР) – реакция Вассермана с двумя‑тремя антигенами и две осадочные реакции (Кана и цитохолевая); при необходимости рекомендуется постановка более чувствительных и специфических реакций РИБТ и РИФ. Особенно велико значение РИБТ и РИФ для распознавания ложноположительных результатов стандартных серологических реакций и ретроспективной диагностики сифилиса.
КСР позволяет выявить значительное число больных сифилисом в разных стадиях заболевания. При замене неспецифических антигенов трепонемными и при постановке серологических реакций на холоде (реакция Колмера) можно повысить процент выявления и увеличить специфичность реакции. Применение в качестве обязательных антигенов кардиолипинового антигена, трепонемного озвученного антигена из протеиновой фракции патогенных или культуральных трепонем дает возможность судить об иммунном состоянии больного сифилисом при постановке диагноза, определении результатов терапии и критерия излеченности (в совокупности с другими показателями). Кроме того, серологическое обследование проводится лицам, поступающим на работу в детские учреждения, на пищевые предприятия и ряд других производств при периодическом обследовании декретированных контингентов. Обязательному серологическому обследованию подвергаются доноры, а также больные терапевтических, неврологических, психиатрических и других стационаров.
Для выполнения комплекса серологических реакций требуется высококвалифицированный персонал лабораторий, соответствующее лабораторное оборудование и значительное количество ингредиентов. Многочисленность серологических реакций объясняется тем, что доказана антигенная мозаичность бледных трепонем, а в связи с этим и наличие в сыворотке крови больного сифилисом соответствующей множественности антител (реагины, комплементсвязывающие и полисахаридные антитела, агглютинины, иммобилизины, антитела, вызывающие иммунную флюоресценцию, и др.). В каждой стадии сифилиса преобладают те или иные антитела и, следовательно, реакции с одними антителами могут быть уже положительными, а с другими – еще отрицательными. Кроме того, относительная специфичность стандартных серореакций побуждает в целях избежания диагностических ошибок пользоваться не одной из этих реакций, а их комплексом. Несмотря на такой комплексный подход при серологическом обследовании пациента, следует помнить, что в ряде случаев даже весь комплекс может давать ложноположительный, неспецифический, результат. Ложноположительные серологические реакции в крови наблюдаются при малярии, сыпном и возвратном тифе, лепре, бруцеллезе, пневмонии, скарлатине, при злокачественных новообразованиях, во время менструаций, за 2 нед до родов и в течение 3 нед после родов, после приема алкоголя, жирной пищи, некоторых лекарственных препаратов, при хронических гнойных процессах, болезнях печени и др. Установлено, что с увеличением возраста пациентов возрастает количество неспецифических ложноположительных результатов стандартных серореакций. Все это заставляет весьма осторожно относиться к показателям серологического обследования пациентов и считать серореакций ценной, но вспомогательной методикой, подтверждающей данные клинической картины, результаты других лабораторных исследований (на бледную трепонему, спинномозговой жидкости), результаты конфронтации.
A. Реакция Вассермана (РВ)
Основана на феномене связывания комплемента. В постановке реакции используют как специфические антигены из бледных трепонем, так и неспецифические антигены (экстракты из органов здоровых животных, например, мышцы бычьего сердца). Связывание комплемента производится комплексом (липоидный антиген и реагин испытуемой сыворотки). Для индикации образовавшегося комплекса применяют гемолитическую систему (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). При постановке РВ с кардиолипиновым антигеном ее чувствительность возрастает.
В связи с большим объемом профилактических обследований и сложностью выполнения КСР в настоящее время широко применяется экспресс-метод серодиагностики сифилиса, когда не требуется брать кровь из вены.
B. Ускоренный метод серодиагностики сифилиса
Техника постановки реакции с плазмой. Кровь в пробирке при стоянии разделяется на два слоя. Нижний содержит эритроциты, а верхний – плазму. Пастеровской пипеткой отсасывают плазму, стараясь не захватить эритроциты. При недостаточном количестве плазмы пробирку с кровью следует отцентрифугиоовать в течение 5 - 10 мин при 1000 ‑ 2000 об/мин. В лунку пластинки из органического стекла вносят кровь от 1 больного и нумеруют лунку соответственно составленному списку. В каждой лунке к 2 - 3 каплям плазмы добавляют по 1 капле эмульсии антигена; капли перемешивают, и смесь встряхивают в течение 5 мин, затем во все лунки добавляют по 1 капле изотонического раствора натрия хлорида; смесь перемешивают покачиванием и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. В плазме, полученной от больного сифилисом, появляются хлопья разной степени интенсивности, расцениваемые как положительный результат (3+, 4+), слабо положительный (2+, 1+). При отсутствии сифилиса иногда может быть слабо выраженный флокулят, поэтому учет результатов следует производить, ориентируясь на характер реакции в контролях. Поскольку микрореакция носит отборочный характер, при получении положительных результатов сыворотку крови исследуют в КСР, а при необходимости – в РИБТ и РИФ.
C. Реакция с липоидным антигеном (VDRL)
Одним из лучших стандартных методов, в которых используются липоидные антигены, является рекомендуемая ВОЗ реакция VDRL. Название этой реакции происходит от заглавных букв учреждения, где она была разработана, – Venereal Diseases Research Laboratory в Атланте. Антиген добавляют к инактивированной сыворотке больного, помещаемой на предметное стекло, которое вращают в течение 4 - 5 мин при комнатной температуре и сразу регистрируют результат: наличие в сыворотке реагинов вызывает макроскопически видимую флокуляцию. Реактоспособность сыворотки в реакции VDRL выявляется примерно через 4 нед после заражения сифилисом. Количественную оценку циркулирующих антител получают путем разведения сыворотки перед постановкой реакции в геометрической прогрессии: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Ложноположительные результаты могут обусловливаться аутоантителами при заболеваниях, протекающих с нарушениями иммунитета (красная волчанка, ревматизм, болезнь Шегрена, дисгаммаглобулинемия), а также при заболеваниях, связанных с усиленным разрушением клеточных ядер (малярия, пситтакоз, вирусная пневмония, карцинома).
Главными достоинствами реакции VDRL являются:
· низкая стоимость, легкость постановки,
· быстрое получение результатов с довольно высокой чувствительностью,
· специфичностью, хотя и меньшей, чем в реакции с трепонемным антигеном.
D. Реакции иммунофлюоресценции
Все большее значение приобретают специфические серологические реакции РИФ и РИБТ.
Принцип РИФ основан на выявлении флюоресцирующих антител, так как меченные флюорохромом антитела не теряют способности соединяться с соответствующим антигеном и тем самым обусловливают свечение препаратов в сине-фиолетовых лучах, источником которых является ртутно-кварцевая лампа.
Отличительной чертой РИФ, по сравнению со стандартными серореакциями, является более высокая чувствительность (поэтому она бывает положительной у ряда больных в первичном серонегативном периоде сифилиса) при сохранении высокой специфичности. Однако, РИФ уступает по специфичности РИБТ, хотя по технике постановки она значительно проще.
Реакция ставится в нескольких модификациях: РИФ-ц, РИФ-200 и РИФ-абс. Считается, что РИФ-ц более чувствительна, а РИФ-200 и РИФ-абс – более специфичны.
Реакция ставится непрямым методом в 2 фазы. В первой фазе реакции на антиген наносится испытуемая сыворотка крови. Если в ней имеются соответствующие антитела, то образуется комплекс антиген – антитело. Для выявления образовавшегося комплекса проводится вторая фаза реакции, при которой его обрабатывают меченной флюорохромом иммунной кроличьей сывороткой (против сывороточных глобулинов человека)
Полученный во второй фазе комплекс антиген-антитело определяется с помощью люминесцентной микроскопии. Если свечения антигена нет, то это указывает на отсутствие в испытуемой сыворотке крови соответствующих антигену антител.
Наиболее ценной модификацией РИФ является РИФ-200, основным назначением которой считается не ранняя серодиагностика сифилиса, а распознавание неспецифических результатов КСР и серодиагностика других форм сифилитической инфекции, в том числе и скрытого сифилиса. При установлении излеченности сифилиса решающим является отрицательный результат РИФ-200. не обладает абсолютной специфичностью, поэтому вопрос о наличии или отсутствии заболевания должен решаться на основании совокупности клинических, серологических и других данных.
Техника постановки РИФ-200. Из антигена готовят препараты на тонких, обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. Антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. После фиксации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при +35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной температуре, после чего препараты 10 мин промывают в изотоническом растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина, накрывают их тонкими, обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло. Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе. Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.
E. Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с БТ (FTA‑ABS)
Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кролика, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инактивированную сыворотку инкубируют с сорбентом для абсорбирования неспецифических групповых антител. Затем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела связываются бледными трепонемами. После промывания к трепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобулина с флюоресцентным красителем. Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.
Появления реактоспособности можно ожидать примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе, – на протяжении десятилетий.
Главными достоинствами реакции FTA‑ABS являются:
· высокая специфичность и чувствительность,
· быстро наступающая реактоспособность.
Положительная FTA‑ABS может иметь решающее значение для диагностики в сомнительных случаях, особенно при положительных реакциях VDRL или автоматизированной реакции микрогемагглютинации (АМНА‑ТР), используемых для скрининга.
F. Реакция 19S IgM-FTA-ABS
При идентификации антител IgM к бледным трепонемам реакцией FTA‑ABS с использованием конъюгата анти-IgM в качестве реагента выявлялись ложноположительные
8-09-2015, 22:18