Ликвор получают при люмбальной пункции. В пробирку собирают 7 - 8 мл (но не более 10 мл) ликвора. Это количество распределяют в две пробирки, одну из которых направляют в клиническую лабораторию, а другую – в серологическую.
В клинической лаборатории исследуют цитоз, содержание белка, глобулиновые реакции Панди и Нонне-Апельта. Минимальные патологические изменения в спинномозговой жидкости следующие: содержание белка, начиная с 0,4%, цитоз - 8 клеток в 1 мкл, глобулиновые реакции (реакция Нонне-Апельта++, реакция Панди+++; реакция Ланге - больше 2-х 2-ек в цифровом значении, положительная РВ). Показатели выше указанных, будучи изолированными, свидетельствуют о выраженных патологических изменениях в спинномозговой жидкости. Патологической считается также ликвор, в котором несколько показателей изменены соответственно данным минимальной патологии, а РВ положительна. Концентрация белка в ликворе свыше 400 мг/л и число клеток более 5000 на 1 л свидетельствуют о воспалительном процессе в ЦНС. Для обозначения позитивности глобулиновых реакций и РВ применяется система четырех плюсов; резко положительный результат (4+), положительный - 3+, слабоположительный - 2+ и сомнительный - 1+.
В серологической лаборатории ставятся РВ, реакция Ланге с коллоидным золотом, РИТ, РИФ, РИФ-ц, ТРНА, либо FTAABS, либо IgM TPHA. Отрицательная ТРНА, либо FTAABS исключает нейросифилис. Положительная IgM TPHA со спинномозговой жидкостью и индекс ТРНА свыше 10 подтверждают наличие сифилитического процесса в ЦНС. Использование РИФ целесообразно при ликвородиагностике сифилиса. Особенно высокочувствителен и специфичен тест с цельным ликвором (РИФ-ц). Применение РИФ РИБТ и IgM ТРНА расширяет возможности выявления сифилитического поражения нервной системы.
При ранних формах нейросифилиса более выражены количественные отклонения цитоза, концентрации белка, сочетающиеся с минимальной патологией коллоидной реакции. Тяжелые паренхиматозные сифилитические поражения головного и спинного мозга сопровождаются выраженными изменениями коллоидных реакций до пяти или шести «шестерок» в реакции Ланге. Реакция Вассермана в спинномозговой жидкости иногда может быть ложноотрицательной или ложноположительный. Положительные неспецифические данные реакции Вассермана в спинномозговой жидкости могут наблюдаться при опухолях мозга, эхинококкозе, цистицеркозе, рассеянном склерозе и паркинсонизме.
2 Гонорея
Гонорея – венерическое заболевание, передаваемое в основном при интимных контактах, вызываемое гонококком.
Морфология, устойчивость и культуральные свойства гонококков
Возбудитель грамотрицательный диплококк, адсорбирующийся на поверхности эпителиальных клеток, способный проникать в межклеточные щели с образованием микроколоний, защищенных от воздействия антител и клеточных факторов иммунитета. Характерно внутриклеточное расположение возбудителей в сегментоядерных лейкоцитах на всех стадиях процесса, особенно при обильном гнойном отделяемом. Эндоцитобиоз – внутриклеточная персистенция гонококков позволяет оставаться недоступными действию антибиотиков. В организме больных гонококки претерпевают L‑трансформацию после применения химиотерапевтических средств или при хроническом течении заболевания.
На ультратонких срезах у гонококков выявляются клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана, цитоплазма с множественными рибосомами, многочисленными полирибосомами, лизосомами и нуклеоид с нитями ДНК. На поверхности гонококков выявляются тонкие трубчатые нити – пили. Им приписывают способность гонококков передавать генетические свойства, в частности, устойчивость к антибиотикам, способность прилипать к клеткам эпителия хозяина и ряд других биологических особенностей. С пилями, по-видимому, связан механизм передачи генетической информации к способности переноса плазмид и β-лактамазопродуцирующих штаммов гонококков. Устойчивость β-лактамазопродуцирующих гонококков к антибиотикам обусловлена полиантибиотикорезистентностью, и такими адаптационными механизмами как L-трансформация, образование спороподобных форм и др.. Помимо штаммов, образующих β-лактамазопродуцируюших клонов гонококков, существуют штаммы трансформирующиеся в L-формы. Для начальной стадии L-трансформации характерен множественный нуклеоид с последующим истончением наружной стенки, потерей ее структуры и фестончатости. L-трансформация может происходить спонтанно или при действии антибиотиков. После прекращения действия препарата, вызвавшего образование L-форм, наступает реверсия. При L‑трансформации между наружной стенкой и цитоплазматической мембраной образуются элементарные тельца – округлые образования разной величины, из которых образуются типичные гонококки. Именно биологическое свойство образовывать нестабильные варианты L-форм рассматривается как одна из наиболее частых причин рецидивов болезни. Отдельные штаммы гонококков вырабатывают фермент пенициллиназу, что объясняет их устойчивость к пенициллину и его дериватам.
2.2 Формы гонорейной инфекции
Патологический процесс чаще ограничивается местом первоначального внедрения возбудителя. В связи с этим принято различать гонорею:
· мочеполовых органов (генитальная),
· экстрагенитальную (гонорея прямой кишки, глотки, рта, миндалин, глаз)
· метастатическую (диссеминированная), являющуюся осложнением двух первых.
2.3 Диагно стика гонококковой инфекции
В диагностике гонореи решающее значение имеют лабораторные данные. Этиологическая диагностика проводится с использованием бактериоскопических и бактериологических методов. Если в препарате при бактериоскопии обнаружены типичные гонококки, то культуральное исследование не проводится. Топическая диагностика применяется обязательно для точного определения локализации воспалительного процесса в уретре с помощью двухстаканной пробы. Более точная топическая диагностика осуществляется методом уретроскопии, но этот способ исследования рекомендуется применять только при хронической форме процесса, так как при острой форме данная процедура может способствовать распространению инфекции в вышележащие отделы мочеполовой системы.
Методы лабораторной диагностики гонококковой инфекции:
· микроскопические (бактериоскопические),
· культуральные (бактериологические).
· молекулярно-биологические.
2.3.1 Микроскопические методы исследования
В случае если нефиксированный препарат доставляется в лабораторию: препарат фиксируют 960 спиртом или трехкратным проведением стекла через пламя горелки.
Хранение мазков:
Фиксированные препараты можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней.
A.Окраска метиленовым синим:
Окраска метиленовым синим является ориентировочной и позволяет оценить морфологию и расположение микроорганизмов в мазке. Можно использовать водный или спиртовой растворы метиленового синего. Использование спиртового раствора позволяет сократить время фиксации препарата, не снижал качества окраски.
B.Окраска по методу Грама:
При окраске по методу Грама в препарате выявляются тинкториальные свойства бактерий. В зависимости от химической структуры клеточной стенки (наличие или отсутствие тейхоевых кислот) бактерии либо обладают способностью удерживать комплекс кристаллического фиолетового с йодом и устойчивы к обесцвечиванию спиртом (грамположительные), либо нет (грамотрицательные).
C.Микроскопия окрашенных препаратов.
При проведении микроскопического исследования последовательно оцениваются препараты, окрашенные двумя способами: метиленовым синим и по Граму. Нельзя выносить заключение по результатам просмотра лишь одного препарата.
Окраска метиленовым синим позволяет сделать заключение о наличии воспаления и выявлении морфотипа бактерий. При окраске по Граму возможно выявление грамотрицательных диплококков. При микроскопии препаратов врачом-лаборантом оценивается наличие эпителия, количество лейкоцитов, эритроцитов, морфотип бактерий (лактобациллы, кокки, коккобациллы), наличие вне- и внутриклеточно расположенных диплококков.
Мазки, окрашенные метиленовым синим или по Граму, оцениваются при двух увеличениях (с применением объективов xl0, х100, т.е. при увеличении соответственно в 100 и 1000 раз). Микроскопическое исследование следует начинать с малого увеличения (х100), позволяющего обнаружить клинический материал на стекле, оценить адекватность взятия из соответствующего анатомического участка, определить наличие «загрязнений» из других анатомических участков, выбрать участок препарата для дальнейшего исследования при большом увеличении (х1000). Микроскопия при большом увеличении позволяет выявить и оценить воспалительную реакцию и наличие микроорганизмов. При увеличении xl000 с иммерсией подсчет лейкоцитов следует проводить в пяти полях зрения. При этом особое внимание следует уделить поиску внутриклеточных диплококков в лейкоцитах.
Диагноз уретрита у мужчин устанавливается на основании обнаружения 4 и более лейкоцитов в поле зрения микроскопа при увеличении xl000. При наличии цервицита количество полиморфно ядерных лейкоцитов повышено (более 10 при увеличении х1000). При клиническом исследовании следует принимать во внимание наличие или отсутствие слизисто-гнойных цервикальных выделений (зеленовато-желтый гной со слизью на белом ватном тампоне).
При исследовании вагинального мазка у женщин нужно помнить о том, что число лейкоцитов зависит от индивидуальных особенностей организма - от дня менструального цикла, наличия внутриматочной спирали и т.д. Поэтому для диагностикки слизисто-гнойного цервицита рекомендуется использовать оба критерия, т.е. наличие клинических проявлений и воспалительный характер цервикального мазка.
Диагноз уретрита у женщин подтверждается нахождением более 10 лейкоцитов в поле зрения при увеличении микроскопах 1000, Следует помнить, что если во влагалище и/или шейке матки имеется патологический воспалительный процесс и при этом наблюдаются выделения из влагалища, уретральный мазок всегда загрязнён материалом этих выделений (клетки плоского эпителия, лейкоциты, вагинальная микрофлора) и не годится для дальнейшей оценки, поскольку он не имеет ничего общего с уретрой.
D.Оценка результатов микроскопии окрашенных мазков.
На основании микроскопического исследования диагноз гонореи устанавливается по трем признакам гонококка:
· его форме;
· расположению;
· окраске.
Если же отсутствует хотя бы один из них, требуется культуральное исследование.
Решающее значение при микроскопической диагностике гонореи имеет учет расположения диплококков. Гонококки в основном располагаются внутри лейкоцитов и эпителиальных клеток. На основании обнаружения диплококков, расположенных вне клеток, микроскопический диагноз гонореи не ставится, требуется культуральное исследование.
Окраска гонококков (по методу Грама) - красно розовая(грамотрицательный диплококк). При этом ядра лейкоцитов и эпителиальных клеток окрашиваются т фиолетовый цвет.
Оценка мазков, окрашенных метиленовым синим
При микроскопии препарата видны:
· ядра клеток, окрашенные в синий цвет;
· цитоплазма, окрашенная в голубой цвет разной интенсивности;
· бактериальная микрофлора, окрашенная в синий цвет разной интенсивности.
Окраска метиленовым синим является ориентировочной и позволяет оценить морфологию (форму) и расположение микроорганизмов в мазке (внутри лейкоцита и на эпителиальных клетках).
Оценка мазков, окрашенных по Граму
Методика оценки мазка, окрашенного по Граму, принципиально не отличается от методики оценки мазка, окрашенного метиленовым синим. Окраска по Граму позволяет выделять в картине мазка красно-розовые (грамотрицателъные) или сине-фиолетовые (грамположительиые) элементы. Основной целью исследования является выявление грамотрицательных диплококков со специфической морфологией, а также степени выраженности лейкоцитарной реакции.
2.3.2 Культуральное (бактериологическое) исследование
Дополнительно к микроскопии окрашенных мазков бактериологическое исследование на гонорею должно всегда проводиться при обследовании:
· детей, так как у них встречается большое количество непатогенных нейссерий. особенно в полости рта, глотки и гениталиях;
· женщин, так как диагностическая чувствительность микроскопии генитальных мазков женщин низкая;
· пациентов с бессимптомной и экстрагекитальной гонореей (глотки, прямой кишки, конъюнктивы и др.);
· сексуальных контактов пациентов с доказанной гонореей (где при микроскопии не удалось выявить возбудителя);
· пациентов с гонореей после окончания лечения(не раньше 10 дней) и при снятии их с учета;
· с целью окончательной идентификации нейссерий;
· для определения чувствительности нейссерий к антибиотикам;
· в случае если будет проводиться фенотипическая и/или генотипическая диагностикаN. gonorrhoeae;
· в случае сексуального насилия, при запросе следственных органов и/или судебно-медицинских экспертов.
Ответ по результатам посева при выделении чистой культуры и её идентификации выдаётся через 5 дней после взятия пробы.
A.Проведение бактериологического анализа
Подученный биологический материал необходимо сразу же поместить одновременно на селективную и неселективную питательную среду, поскольку некоторые штаммы гонококков чувствительны к концентрациям ванкомицина и триметоприма, входящих в состав селективной среды.
Культивирование гонококков следует проводить на чашках Петри диаметром 90 мм с количеством среды не менее 20 мл на чашку или 100 мм с количеством среды 26 мл. После приготовления чашек со средой они ставятся в термостат при 36±1°С на 1 час для удаления конденсата (излишней влажности). Пересушивание среды недопустимо, т.к. это отразится на качестве роста гонококков. Перед проведением посева чашки необходимо прогреть в термостате при температуре +36±1°С в течение 30 минут.
Клинический материал от каждого пациента должен засеваться на отдельную чашку Петри. При использовании больших чашек (90 или 100 мм) материал из уретры и цервикального канала у женщин может засеваться на одну чашку Петри в разные ее секторы с соответствующей маркировкой. Материал из уретры мужчин должен засеваться на отдельную чашку.
Взятый материал тампоном наносится на поверхность. Затем стерильной бактериологической петлей материал распределяется по площади поверхности питательной среды штриховыми движениями в 3 - 4 разных на правлениях с целью создания условий для роста отдельно расположенных колоний гонококков. Чашки немедленно помещаются в анаэростат с содержанием СО2 5±2%. влажностью 70%, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±10 С. Допускается использование эксикатора, который ставится в термостат с контролируемой температурой 36±10 С, в эксикаторе создаются условия повышенного содержания СО2 при помощи свечении газогенерирующих пакетов и влажности. Чашки просматриваются через 18 - 24 часа инкубации, в случае отсутствия роста - через 48 часов:
·При отсутствии признаков роста через 72 часа инкубации наблюдение прекращают.
·При выявлении характерных колоний проводится первичная и видовая идентификация.
B.Идентификация нейссерии
Первичная идентификация нейссерии проводится путем:
· визуальной оценки вида колоний,
· окраски материала подозрительных колоний по Граму;
· оксидазного теста.
· Оценка вида колоний
Типичные колонии гонококков через 18 - 24 часа инкубации выпуклые прозрачные серо-белого цвета, имеют диаметр 0,5 - 1,0 мм. При дальнейшей инкубации колонии могут увеличиваться в размерах до 3,0 мм и уплощаться. Нередко на одной чашке можно встретить колонии разного вида.
Большие трудности возникают при идеитификации колоний гонококка в посевах из ротоглотки, т.к. при этом часто вырастают менингококки и непатогенные нейссерии, колонии которых сходны с колониями гонококков. Колонии менингококка выглядят голубоватыми, колонии непатогенных нейссерии - беловатыми, а гонококков - бесцветными, слизистыми. Размер, цвет, морфология и консистенция колоний могут варьировать в зависимости от применяемой питательной среды. Идентифицировать возбудителя можно только при определении сахаролитических свойств культур или другими тестами, подтверждающими видовую принадлежность микроорганизма.
· Применение оксидазного теста
Обнаружение оксидазоположительных грамотрицательных диплококков считается достаточным для их идентификации как N. gonorrhoeae при рутинной диагностике. Для определения цитохром-с оксидазы можно использовать один из рекомендованных методов:
· На подозрительную колонию наносится капля оксидазного реагента {тетраметилфенилендиамина, 1%-ный водный раствор). Быстрое изменение цвета реагента, в течение 5 - 10 секунд, на сине-фиолетовый и его сохранение дольше 30 секунд позволяет считать тест положительным. Реагент, используемый в оксидазном тесте, убивает гонококки, поэтому дальнейшая работа с этими колониями будет невозможна.
· Полоска фильтровальной бумаги смачивается несколькими каплями реагента, затем на нее помещается бактериологической петлей материал из подозрительной колонии. Этот способ позволяет сохранить материал на чашке для проведения дальнейших исследований. Высокая чувствительность оксидазного теста не согласуется с его специфичностыо. Оксидазоположительными могут быть и другие бактерии, выделяющие цитохромную оксидазу, поэтому оксидазоположнтельные колонии микроорганизмов обязательно нужно исследовать микроскопически с окраской по Граму.
· Имеются коммерческие диски и полоски, содержащие диметил-р-фенилендиамина гидрохлорид. Платиновой петлей или стерильной стеклянной палочкой испытуемую культуру наносят на диск, предварительно слегка смоченный дистиллированной водой.
Учет результата
Темно-лиловое или синее окрашивание, появляющееся через 10 - 30 секунд, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Отсутствие изменения цвета - об отсутствии данного фермента.
При исследовании мазков, окрашенных по Граму, из культур учитываются морфология, расположение и окраска гонококков. После 18 - 24 часов культивирования гонококки представляют собой скопления грамотрицательных кокков и диплококков, имеющих более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное распределение по периферии.
Наряду с интенсивно окрашенными в розово-красный цвет кокками встречаются и бледно-окрашенные формы. Более старые культуры (48 часов и более) трудно интерпретировать, т.к. отмечается большое количество полностью лизированных клеток. По мере старения культуры увеличивается полиморфность гонококков.
Для подтверждающей идентификации нейссерий используются тесты:
· изучение ферментативной активности;
· иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация);
· молекулярно-биологические методы (ПЦР).
C. Изучение ферментативной активности
Ферментативная активность Neis. gonorrеаеизучается в реакции окисления сахаров. Реакция может быть ложноположительной из-за контаминации исследуемых культур гонококков другими бактериями и ложноотрицательной при использовании гонококков, культивируемых более 24 часов (вследствие аутолиза микроорганизмов). Для предупреждения этих возможных факторов необходимо выделить чистую культуру гонококков путем пересева типичных колоний на чашки Петри с неселективной средой (шоколадный агар). Инкубация проводится в течение 18 - 24 часов.
Изучение ферментативной активности Neis. gonorrhoeaeможет проводиться в ростозависимых и ростонезависимых тестах. При проведении ростозависимых тестов сахара и другие субстраты (например, феноловый красный) вводятся непосредственно в питательную среду, на которой осуществляется рост гонококка. Однако в настоящее время эти тесты не могут быть рекомендованы, т.к. широко используемые ростонезависимые тесты дают возможность получить более быстрый (в течение нескольких часов) и специфический результат, позволяя идентифицировать исключительно Neis. gonorrhoeaeи исключить другие непатогенные нейссерий. Существуют коммерческие наборы для изучения ферментативной активности Neis. gonorrhoeae.
Оценка проводится по изменению цвета среды: при ферментации сахаров - от красного к желтому (результат положительный). Энзимсубстратные тесты с использованием ферментов (орто-нитрофенил-бета-галактозидаза (ONPG), гамма-глютамил аминопептидаза (GLU-AMP), гидроксипролил аминосинтидаза (PIP), гидроксипролин аминопептидаза (НРА), пролин аминопептидаза (Рго-АР)) предназначены для быстрой дифференциации между N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. tacarnicaи некоторыми штаммами N. cinerea и N. Catarrhalis. Результаты теста считаются положительными, если происходит изменение цвета среды - от бесцветного к желтому для ОФГ и от светло-желтого к интенсивно оранжевому для Глю-АП и Про-АЛ. Однако чувствительность и специфичиость этих быстрых энзимсубстратных тестов оказались неоптимальными.
Проведение видовой идентификации возможно также с использованием бактериологических анализаторов и коммерческих наборов реагентов.
D. Иммунологические/антигенные подтверждающие тесты
Иммунологические тесты рекомендуется использовать только в референс-лабораториях для окончательного подтверждения N. gonorrhoeae .
Иммунологические тесты с использованием моноклональных антител для прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), коагглютинации и иммуноферментного анализа являются высокочувствительными и специфичными для точной идентификации N. gonorrhoeae . Эти тесты могут проводиться с культурой нейссерий, выделенных при первичном посеве. При этом не требуется выделение чистой культуры гонококков, и изоляты могут быть идентифицированы на18 - 24 часа раньше, чем при изучении ферментативной активности N. gonorrhoea . Однако эти тесты дороже, чем ферментативные, коммерческие тест системы имеют меньший срок годности.
E. Прямая иммунофлюоресценция
Тест основан на использовании флюоресцирующих моноклональных антител против очищенного Рro В белка наружной мембраны гонококка, ранее называвшегося 1 или главный белок наружной мембраны гонококка. Очень важно строгое следование инструкции производителя каждого отдельного теста.
Молекулярно-биологические методы
Для выявления N. gonorrhoeaeмогут быть использованы ДНК/РНК методы, такие как полимеразно цепная реакция (ПЦР), а также методы, основанные на гибридизации. Однако результаты, полученные при использовании этих методов, должны оцениваться в связи с клинической ситуацией, т.к. после проведенного лечения гонореи в некоторых случаяхДНК может определяться в образцах до
8-09-2015, 22:18