Микрохирургия

Федеральное Агентство Науки и Образования

Сибирский Федеральный Университет

Институт Фундаментальной Биологии и Биотехнологии

Кафедра биотехнологии

РЕФЕРАТ

На тему: Микрохирургия

Выполнил: студент группы Б-31

Холодилова Валентина

Проверил: доцент кафедры

Биотехнологии, д. б. н

Голованова Т.И.

Красноярск, 2008 г.

Содержание

Введение

1. Реконструкция клеток - важный прием в решении многих задач биологии

2. Слияние клеточных мембран

3. Метод электростимулируемого слияния при реконструкции животных и растительных клеток

4. Реконструкция зигот млекопитающих при сочетании микрохирургии и электростимулируемого слияния клеток

5. Перспективы метода

Заключение

Литература

Введение

МИКРОХИРУРГИЯ (греч, mikros малый + хирургия) - направление в хирургии, сочетающее обычные хирургические приемы и технику операций под микроскопом с использованием специальных миниатюрных инструментов и тончайших травматических игл с впаянными в них нитями.

Экспериментальные методы стали применяться цитологами уже во второй половине прошлого столетия. Первые микрооперации проводились на сравнительно крупных объектах, например на развивающихся клетках различных животных, без использования каких-либо специальных приспособлений и при небольших увеличениях лупы или препаровального микроскопа. Микрооперации на отдельных клетках мелких размеров стали проводить только в начале XX столетия, когда был сконструирован прибор, называемый микроманипулятором. Микроманипуляторы позволяют проводить очень тонкие операции над клеткой и ее органоидами. Для этих операций требуются большие увеличения микроскопа и специальные микроинструменты, которые чаще всего изготовляются самим экспериментатором из тонких стеклянных нитей или палочек. Методы микрургии широко применяются и для выделения тканевых клеток или одноклеточных органоидов при переносе их в новую культуральную среду или в организм животного, что особенно важно для получения клонов. Наконец, к числу сложных микрохирургических операций, которые начали применяться сравнительно недавно, относится извлечение и трансплантация ядер, ядрышек и других органоидов клетки. Для этих операций пригодны главным образом крупные клетки простейших и других одноклеточных организмов, а также и крупные клетки некоторых многоклеточных животных, например амфибий. Операции по пересадке ядер дают возможность изучить роль ядра и цитоплазмы в жизни клеток, изучить изменения, происходящие в безъядерных клетках, выяснить участие ядра и цитоплазмы в передаче по наследству тех или иных признаков.

1. Реконструкция клеток - важный прием в решении многих задач биологии

За последние 15 лет активно развиваются работы по реконструкции клеток, причем число публикаций лавинообразно нарастает. И это естественно, так как реконструируемые клетки, формируемые из ядра и цитоплазмы различного происхождения, могут использоваться для решения большого количества важнейших биологических проблем. В настоящий момент проблема клеточной реконструкции вступает в новый этап в связи с появлением нового эффективного физического метода – электростимулируемого слияния клеток.

Реконструкция эмбриональных клеток и проблемы биологии развития. Реконструкция эмбриональных клеток, по существу включает в себя такую важную задачу биологии развития, как механизмы реализации генетической информации. Это направление призвано решить такие важные проблемы как исследование реальной тотипотентности генома клеток разного уровня дифференцировки, способность геномов к репрограммированию, исследование подходов к получению отцовских и материнских копий или клонированию, получению гибридных животных и межвидовых химер путем искусственного слияния геномов и создания реконструированных зигот и ранних эмбрионов. Реконструкция эмбриональных клеток позволяет взглянуть на взаимодействие ядра и цитоплазмы, рецепторных структур мембраны и генома. Особое место занимают опыты по пересадке ядер опухолевых клеток в энуклеированные яйцеклетки. Реконструкция эмбриональных клеток открывает возможность для изучения роли внеядерной наследственности в развитии.

Реконструкция дифференцированных клеток и проблемы цитологии. Подобные приемы реконструкции весьма важны для выяснения механизмов деления, в частности механизмов активации хроматина при реконструкции клеток из предшественниц, находящихся на разных стадиях митотического цикла. Эти исследования помогают выявить механизмы корреляции тех или иных свойств клеток, например взаимосвязь между увеличением способности клетки к метастазированию и злокачественному росту с уменьшением способности к формированию межклеточных диффузионных каналов. Наконец, они важны для изучения механизмов старения клетки.

Реконструкция клеток и проблемы реализации генетической информации криоконсервированных геномов исчезающих видов животных. При существующих методах криоконсервации и размораживания различных клеточных структур (гаметы, гонады, зародыши) в 30-50% случаев повреждается цитоплазматическая мембрана. Цитоплазматическая мембрана может также нарушаться при перекисном окислении мембранных липидов. Вместе с тем неоднократно указывалось, что хромосомы гораздо устойчивее к процессам замораживания и размораживания. В этой связи очень существенна проблема замены поврежденной клеточной оболочки на клеточную оболочку зиготы от другого, но близкого вида. В ряде случаев очень важна возможность пересадки отдельных хромосом, например при необходимости переопределения пола. Подобные же проблемы встают при решении задачи о роли материнской цитоплазмы для развивающихся организмов. Здесь интересны разработки методических приемов по замене цитоплазмы в целом и ее отдельных элементов. Особенно интересны указанные задачи в связи с реализацией генетической информации криоконсервированных геномов при межвидовых трансплантациях ядер. Также важны задачи по получению межлинейных и межвидовых химер путем замены одного ядра в одной из клеток на стадии двух бластомеров. Получение подобных химер может содействовать преодолению при межвидовой трансплантации эмбрионов несовместимости реципиента и донора.

Реконструкция клеток и биотехнологические задачи. В первую очередь имеются в виду такие комбинации частей реконструированной клетки, когда можно будет получать клетки-продуценты, способные к активному синтезу тех или иных ценных биотехнологических препаратов. Для решения различных задач физиологии клетки очень важно получение химер на клеточном уровне, когда искусственно создаются клетки с таким сочетанием свойств, которое не встречается в естественных условиях. Например, сочетание очень больших размеров клетки, что создает хорошие условия для физиологического анализа, с синтезом мембранных рецепторов, ионных каналов и т.д., наличие которых характерно лишь для мелких клеток, труднодоступных для физиологического анализа. Кроме того, уже описанные возможности при использовании реконструированных клеток, в частности зигот животных, или камбиальных клеток растений, позволяет подойти к клонированию ценных для сельского хозяйства особей.

2. Слияние клеточных мембран

В большинстве случаев необходимым завершающим этапом для получения реконструированных клеток является процесс слияния основных исходных элементов - цитопласта и кариопласта. Хорошо известно, что при энуклеации клеток после обработки их цитохалазином В с последующим выделением ядра, центрифугированием или микрохирургией выделенное ядро всегда окружено цитоплазмой и поверхностной мембраной, т.е., при этом всегда формируется кариопласт. В то же время безъядерная часть клетки также сохраняет непрерывную целостность поверхностной клеточной мембраны и образует цитопласт. Таким образом, при искусственном отделении ядра от цитоплазмы всегда происходит по существу деление клетки, т.е. цитоплазмы разделяющихся частей всегда остаются полностью отделенными от наружной среды клеточной мембраной.

Это, по-видимому, главное условие удачной изоляции ядер от цитоплазмы для большинства клеток животного происхождения (у которых линейные размеры не превышают 100-150 мкм). Всякое нарушение непрерывности поверхностной клеточной мембраны при энуклеации, как правило, приводит к гибели клетки в связи с резким нарушением клеточного гомеостаза. Исключительно благоприятная роль цитохалазина В в резком повышении клеточной устойчивости к механическим повреждениям в процессе энуклеации, вероятно, определяется, главным образом тем, что за счет деконденсации микрофиламентов клеточного цитоскелета резко повышается автономность, а в силу этого, пластичность и адаптивность поверхностной клеточной мембраны к различным механическим повреждениям.

Итак, изоляция ядер, как правило, - процесс искусственного клеточного деления. Это, в свою очередь, означает, что реконструкция новой клетки из цитопласта и кариопласта возможна только при истинном слиянии клеточных мембран, при котором вновь формируется единый объем. Без такого процесса реальная реконструкция клеток невозможна.

3. Метод электростимулируемого слияния при реконструкции животных и растительных клеток

Проблема микрохирургии клеток с помощью электростимулируемого слияния - бурно развивающееся направление. Ее рождение связано с работой Сеида и др., выполненной в 1979 г. В этой работе было показано, что при пропускании тока через внутриклеточные электроды, введенные в два соседних протопласта, может происходить их слияние. А уже через несколько лет вышли обзоры по данному вопросу. В них рассмотрено уже множество работ по электрослиянию. Правда, больше половины из них вышло из лаборатории Циммермана, родоначальника и одного из активных пропагандистов этого метода. К настоящему времени количество подобных работ резко увеличилось. Разработка метода и его использование охватывает все новые и новые лаборатории мира.

У нас в стране инициаторами данного интересного направления явились сотрудники лаборатории, руководимой Ю.А. Чизмаджевым в Институте электрохимии АН СССР. Этому способствовали, во-первых, проводимые в лаборатории теоретические и экспериментальные исследования по механизмам электропробоя искусственных и естественных мембран, явления, несомненно, лежащего в основе процесса электрослияния; во-вторых, теоретические и экспериментальные разработки непосредственно по проблеме электрослияния мембран. Соответствующие публикации и тесные научные контакты сотрудников Института электрохимии с биологическими институтами способствовали использованию метода электростимулируемого слияния клеток для их реконструкции в других лабораториях страны

В упомянутом обзоре рассмотрены работы, в которых показано, что слияние клеток с помощью электрического стимула - явление довольно универсальное. Так, было показано, что при наложении импульсов электрического поля длительностью в 40 мкс и амплитудой 4-6 кВ/см на суспензию микроорганизмов Dictyosteliumdiscoideum приводит к их слиянию и появлению значительного количества многоядерных клеток (до 40 ядер). Важно подчеркнуть, что эти клетки не удается сливать двумя широко распространенными для слияния методами: полиэтиленгликолем и вирусом Синдай. В других работах было показано, что аналогичный прием по электростимуляции суспензии клеток приводит к увеличению частоты слияния протопластов дрожжей. При этом отмечается, что слившиеся клетки способны к делению.

В описанных работах, а также многих других проводили слияние клеток в суспензии. В данном случае предварительно перед сильным импульсом тока, вызывающим слияние, необходимо каким-либо способом вызвать агрегацию клеток, чтобы клетки контактировали друг с другом. Для этих целей широко используется метод диэлектрофореза, при котором клетки в случае достаточно высокой их концентрации в растворе, плотно контактируют друг с другом и создают цепочки клеток вдоль силовых линий неоднородного высокочастотного электрического поля. Интересны различные модификации указанного подхода. Так, при слиянии клеток миеломы и лимфоцитов мышей вначале с помощью диэлектрофореза формировали монослой клеток миеломы с помощью специальной формы платинового электрода, а затем в ячейку вводили лимфоциты. При этом установлено, что возникающие после электрослияния клетки-гибриды хорошо растут.

Для получения соматических гибридов при электростимуляции были использованы и другие приемы: создание плотной суспензии с помощью центрифугирования, стимулирование адгезии с помощью различных химических агентов, культивирование клеток в монослое, где естественным образом формируются межклеточные контакты, на электропроводящей подложке.

В некоторых работах было специально проведено сравнение эффективности электрослияния фибробластоподобных клеток при различных способах достижения мембранного контакта:

1) посредством диэлектрофореза клеток в переменном электрическом поле,

2) с помощью центрифугирования и образования плотного клеточного осадка,

3) путем выращивания клеток на проводящей подложке и формирования двойного клеточного слоя. Показано, что наиболее эффективным оказался третий способ (индекс слияния 50-70%) и практически неэффективным - первый. Авторы объясняют это возникновением в условиях естественного формирования двойного клеточного слоя (по данным электронной микроскопии) обширных межклеточных контактов, что повышает вероятность слияния при воздействии поля. Однако использование этого способа возможно только для клеток, способных к росту и формированию контактов, поэтому авторы предполагают, что наиболее универсальным может оказаться второй способ получения мембранных контактов.

Другой важный вопрос состоит в подборе оптимальной межклеточной среды, в которой проводится электрообработка клеток. Так, имеются указания, что присутствие в среде одновалентных ионов в концентрации выше 20 мМ значительно понижает эффективность электрослияния. Однако в одной из работ убедительно показано, что ионная сила раствора не влияет на величину нарушения барьерных свойств мембраны при электрическом пробое, а, по-видимому, изменяет характер контактов между мембранами. В случае наличия хороших контактов между фибробластами, когда они растут на плоской подложке, наблюдается высокий индекс электрослияний при концентрациях Nad или КCl, достигающих 140 мМ.

В работах Сухарева, Бандриной, Барбула отмечается, что электрообработка клеток в среде, содержащей 1-2 мМ Са 24 ", приводит практически к 100% -ной гибели клеток. По-видимому, в этих условиях необратимо нарушается ионный гомеостаз за счет значительного входа ионов кальция в цитоплазму. А при обработке клеток в среде с низким содержанием кальция (10 мкМ) выживаемость клеток резко возрастает (до 40%). Ситуация улучшается еще больше, если после электрообработки клетки помещаются в среду, богатую ионами натрия. В этих работах также указывается, что важным положительным компонентом среды электрообработки является сахароза (100-150 мМ), а также диализованная против бескальциевого буфера сыворотка (в количестве l/s по объему). Это позволяет получить максимальный выход поликарионов, которые жизнеспособны в течение нескольких дней.

В ряде исследований указывается, что цитоскелет, вероятно, не принимает непосредственного участия в процессе слияния клеток после их электрообработки и слияния цитоплазм, характерное время которого для L-клеток ~90-120 мин, так как ни цитохалазин В и Д, николцемид практически не влияют на скорость и конечный индекс слияния. Также указывается, что разбавление среды после электрообработки дистиллированной водой на Уз ускоряет процесс объединения цитоплазм клеток. Предполагается, что это связано с изменением натяжения поверхностной мембраны.

Итак, в настоящее время уже достаточно широко ведутся исследования по поиску оптимальных условий для электрослияния животных клеток.

Метод электростимулируемого слияния клеток начинает широко использоваться и для растительных клеток. Для растительных протопластов Petuniainflata установлено, что полученные электростимулируемым слиянием гибридные клетки способны образовывать клеточные стенки и делиться. Описано электрослияние протопластов из листьев диплоидного вида картофеля с суспензионными протопластами махорки. Разная способность к слиянию протопластов из листьев и суспензии позволила подобрать условия для получения 40-50% гетерологических слияний, 60-70% из которых составляли бинарные (1:

1). Отмечается, что важная модификация метода электрослияния растительных клеток состоит в возможности предварительного отбора пары протопластов, предназначенных для слияния. Это позволяет по-новому подойти к решению трудной проблемы отбора гибридных продуктов при массовом слиянии протопластов. Несомненное преимущество электрослияния - контролируемость процесса, увеличение числа попарно слившихся и, более того, специально выбранных для этого протопластов, привлекает к указанному методу все большее число исследователей.

Таким образом, на разнообразных типах животных и растительных клеток показана эффективность использования для их реконструкции метода электростимулируемого слияния клеток. Не случайно метод получает быстрое распространение в различных лабораториях.

Необходимо отметить, что, как правило, в работах, где используют либо суспензии клеток, либо монослойную культуру, применяют способ множественного слияния клеток. Площадь электродов в этом случае всегда во много раз превышает размеры единичной клетки. Вместе с тем при реконструкции клеток в связи с переносом генетического материала оказалось целесообразным использовать метод локального электрослияния, когда два электрода непосредственно подводят к паре клеток, которые предполагается сливать. Такие приемы, например, были использованы при слиянии бластомеров ранних эмбрионов млекопитающих с формированием полиплоидных клеток.

4. Реконструкция зигот млекопитающих при сочетании микрохирургии и электростимулируемого слияния клеток

Интересные результаты по применению метода электростимулируемого слияния клеток были получены в последнее время на эмбриональных клетках млекопитающих.

Проблема пересадки ядер зиготы или реконструкция клетки - одна из центральных в биологии, так как позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биологии развития. Успехи, в этой области, достигнутые на зародышах амфибий, рыб и беспозвоночных, вселяли, в частности, уверенность в принципиальную возможность клонирования организмов. Особый интерес представляют подобные исследования на зародышах млекопитающих. Однако опыты по пересадке ядер у зародышей млекопитающих технически существенно сложнее, чем у зародышей рыб и амфибий.

Яйцеклетки млекопитающих значительно более чувствительны к микрохирургическим манипуляциям, связанным с удалением и введением в них ядер. Инъекционный способ введения кариопластов приводит, как правило, клетку к гибели. Подобные особенности зигот млекопитающих вероятнее всего, связаны с тем, что их объемные размеры в несколько тысяч раз меньше, чем объемные размеры зигот амфибий и рыб. В соответствии с этим при проколе поверхностной мембраны микроинструментом для удаления и введения ядер зиготы млекопитающих испытывают несравненно большее повреждение, чем зиготы рыб и амфибий. Такое повреждение поверхностной мембраны практически всегда приводит к гибели клетки млекопитающих в связи с необратимым нарушением гомеостаза.

Была предложена методика, которая не требовала пенетрации микропипеткой цитоплазматической мембраны клетки. Введение ядра донора в энуклеированную зиготу достигалось с помощью вируса Сендай.

Эксперименты были проведены на мышах CBWA альбиносах-тетрагибридах. В качестве приемных самок использовали гибриды Fi (СВАХ ХС57) (aqouti). Мышей получали из питомника "Светлые горы". Одноклеточные зародыши на стадии пронуклеусов, практически лишенные кумулюса, получали от мышей CBWA первого дня беременности. Для вымывания и культивирования зигот использовали модифизированную среду Виттена. Для микрохирургии эту среду разбавляли на 20% дистиллированной водой с целью поддержания тургора клеток. Кроме того, в среду для операций добавляли цитохалазин В в дозе 5мкг/мл. В специальную микрокамеру типа Фонбрюна помещали 10-15 зигот в среду для микрохирургии. Время инкубации зигот в среде до операции не превышало 15 мин. Все манипуляции проводили при комнатной температуре.

При проведении микрохирургической операции выяснилось, что после прокола зоны пеллюцида микроинструмент внедряется в глубь клетки, не повреждая поверхностную мембрану клетки. Это определяется главным образом действием цитохалазина В. Клетка сохраняет жизнеспособность до тех пор, пока не нарушена целостность цитоплазматической мембраны. Кариопласт формируется за счет всасывания пронуклеусов вместе с цитоплазмой и наружной поверхностной мембраной в микропипетку. Происходит как бы искусственное деление клетки. Попытки вернуть кариопласт обратно в зиготу не удаются. Мембрана кариопласта контактирует с зиготой и может так сохраняться в течение достаточно долгого времени (1-2 суток), но слияния не происходит. При этом энуклеированная зигота не делится, а кариопласт частично фрагментирует. Для реконструкции зиготы необходимо их истинное слияние. Для слияния


8-09-2015, 22:25