2. Способы иммобилизации коллагена из различных органов и тканей. Возможность применения в иммобилизации коллагенов сухожилий
Для растворения коллагена используются различные методики, но большинство из них основано на растворении в уксусной кислоте.
Энуклеированные замороженные глазные яблоки свиньи (–20°) размораживают при комнатной температуре, склера отделяется от остатков мышц, связок и пигмента и промыта холодной водой. Полученная ткань может храниться в замороженном виде в течение 3–4 недель. Выделение коллагена. 100 г. очищенной склеры заливается 5 л щелочного раствора (66 г. NaOH + 100 г. Na2 SO4 на 1 л раствора) и при периодическом перемешивании выдерживается при 20° в течение 36 ч. При этом полисахариды и протеогликаны, составляющие значительную часть склеры, переходят в раствор. Затем склеру отделяют от раствора на воронке Бюхнера и промывали 10 л дистиллированной воды. Для нейтрализации щелочи ткань обрабатывают 2%-м H3 BO3 в течение 40 мин при перемешивании на магнитной мешалке. Обработку склеры раствором борной кислоты повторяют 4 раза до установления pH раствора 6.0. После нейтрализации щелочи склеру 4 раза отмывают от H3 BO3 и Na2 SO4 дистиллированной водой (5 л), каждый раз в течение 40 мин при 20° при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Степень отмывки определяют по полному удалению (SO4 ) – (реакция с BaCl2 ). Получение раствора коллагена. К отмытой склере добавляют равное по объему количество 0.3 MCH3 COOH и выдерживают полученную гелеобразную полупрозрачную массу в течение 7–8 сут при 4° и слабом перемешивании. В этих условиях коллаген переходит в раствор, и склера растворяется практически без остатка. Полученный раствор гомогенизируют и фильтруют через стеклянный фильтр с размером пор 160 мкм, используя водоструйный насос. Концентрация коллагена в полученном растворе (по сухому остатку) составляет 2% по массе. Часть полученного раствора разбавляли 0.2 М Na‑ацетатным буфером с pH 3.44 до концентрации 8.6⋅10–6 и 8.6⋅10–7 М.
Определение концентрации. Содержание коллагена в пробах определяют модифицированным методом Лоури [18] при помощи реактива Фолина–Чиокалто. В качестве стандарта используют раствор желатины известной концентрации. Регистрацию проводят спектрофотометрически при λ = 750 нм. Реакционная смесь состоит из 0.04 М CuSO4 , 0.11 М Na2 C4 H4 O6 , 0.05М Na2 CO3 , 0.4 М NaOH, реактива Фолина–Чиокалто и коллагенового раствора. Метод основан на регистрации окрашенного соединения, образующегося при взаимодействии белка с реактивом Фолина [19].
Известен способ получения коллагена по патенту США 5106949, МПК A 61 K 35/32, опубл. 21.04.1992 г. Согласно патенту коллаген получают из сухожилий (предпочтительно сухожилий сгибателя копыта телят). Далее производят следующие операции:
– удаляют оболочки сухожилий;
– измельчают материал;
– промывают измельченный материал физиологическим фосфатным буфером (PBS) (2 г хлористого калия КС1, 2 г однозамещенного фосфорнокислого калия KH2 РО4 , 80 г. хлористого натрия и 79,3 г двузамещенного фосфата натрия на 1 л раствора), рН 6,5–8,5, разбавленным 1:3–1:1; наиболее эффективен разбавленный 1: 3 PBS с ионной силой 0,05 М (0,05 молярного) NaCl и 0,0022 М Na2 HPO4 (6‑кратная промывка по 2 ч);
– экстрагируют коллаген слабой кислотой (0,5–2 М уксусная кислота); предпочтительно 0,5 М уксусная кислота с добавкой 4 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА);
– осаждают коллаген с помощью NaCl (0,6–1,8 М);
– выделяют осадок и растворяют его в уксусной кислоте;
– переводят раствор диализом в 0,01 М уксусную кислоту.
Данные методики не противоречат целям исследования ввиду того, что и склера и сухожилия построения одним и тем же типом коллагена, т.е. все указанные типы взаимодействия белка с реактивами применимы в обоих случаях иммобилизации.
Заключение
Важной особенностью коллагена и других биологических полимеров является их способность образовывать комплексы с различными лекарственными веществами для направленного действия: усиливающих свертывание крови, стимулирующих восстановление соединительной ткани, противобактериальных и др. Таким образом, открываются широкие перспективы для лечебных препаратов пролонгированного влияния, причем коллаген или другие биополимеры играют для лекарственного средства роль депо. Так, введение коллагеновых препаратов, содержащих линкомицин, показало, что антибиотик сохраняется в окружающих тканях 23-25 суток. На этом принципе сейчас основаны лекарства с увеличенными сроками бактериального воздействия на микробную флору, применяющиеся при лечении остеомиелита, лейшманиозных язв, бронхиальных свищей, при пластике кровеносных сосудов в условиях инфекции.
Способность коллагена образовывать комплексы с гепарином – веществом, препятствующим свертыванию крови и возникновению тромбов, закупоривающих просвет сосуда, послужила основанием для создания сосудистого протеза с антикоагулянтными – противосвертывающими – свойствами. Такой комбинированный сосудистый протез представляет собою тканую или вязаную синтетическую трубку, поры которой заполнены коллагенгепариновой пленкой. Подобные имплантаты можно использовать для замещения не только пораженных артерий, но и пораженных вен, поскольку коллагенгепариновый комплекс длительно обеспечивает противосвертывающий эффект и препятствует образованию пристеночных тромбов.
Явным достоинством коллагена и полученных на его основе коллагеновых материалов для медицины является отсутствие токсических и канцерогенных свойств, слабая антигенность, высокая механическая прочность и устойчивость к тканевым ферментам, регулируемая скорость лизиса в организме, способность образовывать комплексы с биологически активными веществами, стимуляция регенерации собственных тканей организма.
Список литературы
1. В.В. Серов, А.Б. Шехтер – Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология) – М, 1981
2. Журнал структурной химии – С.П. Габуда, АА Гайдаш, В.А. Дребущак, С.Г. Козлова – Данные ЯМР о структуре связанной воды в коллагене с помощью сканирующей калориметрии – том 46, №6, 2005
3. ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ – Л.В. Кухарева, Б.А. Парамонов, И.И. Шамолина, Е.Г. Семенова – Способ получения коллагена для лечения патологий тканей организма – СПб, 2003
4. Патент США 5106949, МПК A 61 K 35/32 – 1992 г.
5. Елисеев В.Г. Соединительная ткань. – М.: Медгиз, 1961.
6. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых белков. – М.: Медицина, 1974.
7. Никитин В.Н., Перский Е. Э» Утевская Л.А. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур. – Киев.: Наукова думка, 1977.
8. Хилькин А.М., Шехтер А.Б., Истранов Л.П. Коллаген и его применение в медицине.‑М.: Медицина, 1976.
9. Bazin S., Lelous M., Delannay A. Collagen in granulation tissue. – Agent and Act., 1976, v. 6, p. 272–275
10.Bruns R. Supramolekular structure of polymorphic collagen fibrills. – J. Cell Biol., 1976, v. 68, p. 521–538
11.Gay S., Muller P., Meigel W., Kuhn K. Polymorphic des Kollagens: Neue Aspekte fur die Structur und Funktion des Bindegewebe.–Hautarzt, 1976, v. 27, p. 196–205
12.Gross J. Collagen biology: structure, degradation, and disease. – Harvey Lectures, 1974, v. 68, p. 351–432
13.Gross J. Aspects of the animal collagenases. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 275–317
14.Kefalldes N. Basement membranes: structural and biosynthetic considerations. – J. invest. Derm., 1975, v. 65, p. 85–92
15.Miller A. Molecular packing in collagen fibrils. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 85–136
16.Minor R., Clark C, Kefalides N. Synthesis and deposition of basement membrane procollagen. – J. Cell. Biol., 1975, p. 67, part 2, p. 287–899.
17.Piez K – The regulation of collagen fibril formation. – In: Extracellular matrix influences on gene expression. New York, 1975, v. 231–237.
18.Ratnachandran G., Ratnakrishnan C. Molecular structure of collagen. – In: Biochemistry of Collagen. New York, 1976, p. 45–84.
19.Reddi A. Collagen and cell differentiation. – In: Biochemistry of collagen. New York, 1976, p. 449–478
20.Trelstad R. Basement membrane collagens: isolation by heat gelation fractionation. – Upsala J. Med. Sci., 1977, v. 82, p. 157–162.
21.Weiss J. Enzymic degradation of collagen. – Intern. Rev. Connect. Tissue Res., 1976, v. 7, p. 101–157.
8-09-2015, 19:38