гемостаз бесплодие экстракорпоральный оплодотворение
1.5.1 Протромбиновое время
Протромбиновое время (синоним время Квика) - показатель интенсивности процессов свертывания крови на стадии превращения протромбина в тромбин, представляющий собой продолжительность (в секундах) образования сгустка исследуемой плазмы крови в присутствии тромбопластина и солей кальция.
ПВ - скрининг-тест для определения факторов (фибриногена, протромбина, факторов V, VII и X), участвующих в свертывании крови, инициированном высокой концентрацией тканевого фактора.
1.5.2 Активированное частичное тромбопластиновое время
Скрининг-тест для определения факторов (фибриногена, протромбина, факторов V, VIII,IX, X, XI, XII, прекалликреина и высокомолекулярного кининогена), участвующих в свертывании крови при контактной активации. Скрининговый фосфолипидзависимый тест, дающий представление о нарушениях, связанных с эффектом волчаночного антикоагулянта – ВА.
1.5.3 Тромбиновое время
Тромбиновое время - показатель активности антитромбинов крови; определяется по продолжительности свертывания исследуемой плазмы (до образования сгустка) после добавления к ней стандартного раствора тромбина.
ТВ - скрининг-тест последней стадии свертывания крови – реакции между тромбином и фибриногеном – антикоагулянтной активности антитромбина III
1.5.4 Фибриноген
Фибриноген – гликопротеид с молекулярной массой около 340000 дальтон.
Молекула фибриногена представляет собой димер, каждая единица которого содержит три полипептидные цепи –α (А), β (В) и γ с молекулярной массой соответственно 67000, 58000 и 47000 дальтон. Общая формула молекулы фибриногена: (α(А), β(В) γ)2 . целостность этой молекулы во многом определяется дисульфидными связями.
Фактор I в том виде, в каком он вырабатывается паренхиматозными клетками печени и поступает в кровь, получил название фибриногена А. Под действием тромбина фибриноген превращается в нерастворимый в крови фибрин, составляющий основу тромба.
1.6 Противосвертывающие механизмы и система фибринолиза
В свертывающей системе крови действуют силы как аутокатализа, или самоускорения, так и самоторможения, в силу чего многие факторы свертывания крови и их фрагменты приобретают свойства антикоагулянтов. В частности, сам фибрин и продукты расщепления фибриногена плазмином обладают противосвертывающим действием.
Однако наиболее важны для поддержания крови в жидком состоянии так называемые первичные, т. е. самостоятельно синтезируемые и постоянно находящиеся в крови, антикоагулянты (табл. 2).
Таблица 2. Основные первичные антикоагулянты
| Наименование | Механизмы действия |
Ингибитор внешнего пути свертывания крови (TFPI) Тромбомодулин «Контактные ингибиторы» (фосфолипидный, плацентарный) Антитромбин III (ATIII) Гепарин и другие кислые мукополисахариды Протеин С Протеин S а2 -макроглобулин |
Синтезируемый в эндотелии белок, инактивирующий комплекс «ТФ+фактор Vila+фактор Ха» Гликопротеин мембраны эндотелиальной клетки, связывающий и инактивирующий тромбин, в комплексе с которым тромбин сохраняет способность активировать протеин С Подавляют пусковой механизм внутреннего пути свертывания крови (комплекс факторов XIIa-XIa и калликреина) Прогрессивно действующий ингибитор тромбина, фактора Ха и в меньшей степени других протеаз, участвующих в свертывании крови В комплексе с ATIII действуют как мощные антикоагулянты Синтезируемый гепатоцитами витамин К-зависимый ингибитор факторов Villa и Va, эндогенный активатор плазминогена. Активируется тромбином и комплексом «тромбин+тромбомодулин» Синтезируемый гепатоцитами витамин К-зависимый кофактор протеина С; активируется так же, как и протеин С Слабый ингибитор комплекса «ТФ+фактор Vila», тромбина, плазмина и калликреина |
Помимо перечисленных в табл. 2 важнейших физиологических антикоагулянтов, в патологических условиях в крови могут появляться в высоком титре иммунные ингибиторы факторов свертывания крови - антитела к факторам VIII, IX и другим, а также к фосфолипидным матрицам, на которых взаимодействуют и активируются факторы свертывания крови (антифофолипидный синдром).
Фибринолитическая (плазминовая) система, как и система свертывания крови, активируется как по внешнему, так и по внутреннему механизму.
Наиболее мощным внешним активатором этой системы является продуцируемый в эндотелии, а также в ряде тканей тканевый плазминогеновый активатор (ТПА), на долю которого приходится около 70% всего активаторного эффекта. Еще около 15% внешнего механизма активации приходится на фермент урокиназу, который вырабатывается в почках и в наибольшей своей части выделяется с мочой, а в кровь попадает в значительно меньшем количестве. На остальные активаторы, поступающие в кровь извне, приходится лишь небольшая часть указанной активности, но в патологических условиях она может быть резко усилена тканевыми и лейкоцитарными протеазами, бактериальными активаторами (стрептокиназой, стафилокиназой и др.) и другими экзогенными протеолитическими ферментами (протеазами змеиных ядов и др.).
Внутренний механизм активации фибринолиза осуществляется в основном комплексом «фактор XIIа+калликреин+высокомолекулярный кининоген» (так называемый XIIа - калликреин зависимый фибринолиз), активированными протеинами C+S.
Механизмы активации фибринолиза замыкаются на плазминогене, который трансформируется в активный фермент – плазмин (в прошлом он обозначался как фибринолизин).
Плазминоген и его активаторы фиксируются в основном на сгустках фибрина в тромбах, в связи с чем лизис фибрина преобладает над лизисом растворенного в плазме фибриногена. Кроме того, действию плазмина на фибриноген препятствует содержащийся в плазме мощный ингибитор этого фермента – а2 -антиплазмин. Однако при чрезвычайно сильной активации плазминогена происходит истощение а2 -антиплазмина, и в плазме крови обнаруживается большое количество продуктов как фибринолиза, так и фибриногенолиза. Эти продукты не идентичны друг другу. В результате расщепления фибриногена в плазме нарастает количество конечного продукта этого процесса - фрагмента D, тогда как при расщеплении фибрина увеличивается концентрация фрагментов D-D (димера) и D-E-D.
Путем раздельного определения концентрации в плазме фрагментов D и D-димеров можно получить представление, в какой степени у больного активированы фибринолиз и фибриногенолиз. Более того, при проведении таких анализов учитывается, что для нарастания в крови продуктов фибринолиза, т. е. D-димера, должно раньше произойти свертывание крови - образование фибрина, а затем его расщепление до фрагмента D-D. Поэтому увеличение концентрации в плазме D-димера служит ценным показателем как интенсивного внутрисосудистого свертывания крови, так и сопряженного с этим процессом фибринолиза. Такое нарастание содержания в крови D-димера является важным маркером массивного тромбоза кровеносных сосудов, тромбоэмболии, диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.
1.6.1 Антитромбин III
Антитромбин III(АТ III) является а2 -глобулином с молекулярной массой около 64000. Синтезируется в печени. Выполняет роль основного плазменного кофактора гепарина, под влиянием которого трансформируется из прогрессивного антикоагулянта в ингибитор немедленного действия.
Инактивирует тромбин, факторы ХIIа, XIa, Ха, IXa, калликреин и фибринолизин.
1.6.2 Протеин С
Физиологический антикоагулянт, в активированном состоянии инактивирует активные V, VII факторы, ингибирует активатор плазминогена (активность проявляется преимущественно в микроциркуляторном русле).
Активность протеина С кратковременно увеличивалась к 5-7 дню стимуляции, что связано с действием половых гормонов.
В нашем городе активность протеина С не определяется.
1.7 Осложнения
У определенного процента женщин в ходе реализации программы ЭКО и ПЭ возникает такое осложнение, как СГЯ (синдром гиперстимуляции яичников). По выраженности симптомов и уровню половых гормонов СГЯ подразделяют на легкую, среднюю и тяжелую формы. Распространенность умеренных и тяжелых форм СГЯ составляет от 1 до 10%. Тяжелые проявления сопровождаются кровотечением, асцитом, гидротораксом, нарушением баланса электролитов, печеночно-почечной недостаточностью, тромбоэмболией и поэтому рассматриваются, как один из основных рисков при реализации программы ЭКО и ПЭ.
Была выявлена прямая зависимость между тяжестью течения СГЯ и выраженностью изменений, свидетельствующих об активации во всех звеньях системы гемостаза.
У пациенток с риском развития СГЯ рекомендуется проводить исследования системы гемостаза несколько раз в период с момента переноса эмбрионов до дня первичной диагностической беременности с целью своевременного назначения противотромботической терапии и контроля за ее проведением.
2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования
Для исследования системы гемостаза были обследованы 10 пациенток в возрасте 26 – 33 лет на всех основных этапах реализации программы ЭКО и ПЭ (стимуляция, день введения ХГ, день ПЭ, 14-й день после ПЭ). Показатели гемостаза исследовали в плазме крови.
Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз оценивали по количеству тромбоцитов. Для подсчета тромбоцитов использовали агрегометр АР 2110.
Для оценки изменений прокоагулянтной активности плазмы крови определяли ПВ, АПТВ, ТВ и концентрацию фибриногена на гемокоагулометре CGL 2110.
Антикоагулянтное звено гемостаза оценивали с помощью определения активности АТ III на гемокоагулометре CGL 2110.
Необходимо отметить, что на 14 день после переноса эмбрионов у пациенток проводили определение β-ХГ для выяснения вопроса о наступлении беременности (эффективности программы).
В ходе обследования десяти пациенток был получен следующий результат: у семи женщин наступила беременность (эффективный цикл); у трех женщин – отсутствие беременности (неэффективный цикл).
2.2 Методы исследования сосудисто – тромбоцитарного гемостаза
2.2.1 Определение количества тромбоцитов
Состав набора: адреналин; растворитель для адреналина, 8,5 мл – во флаконе.
Оборудование, материалы, реагенты: пипетки вместимостью 0,05 – 2,0 мл; физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия.
Приготовление анализируемых образцов: венознуюкровь центрифугируют при 1000 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (1200g) в течение 15 мин., в результате получают бедную тромбоцитами плазму.
Разведение адреналина: во флакон с адреналином внести 8,0 мл растворителя для адреналина и развести содержимое при комнатной температуре путем встряхивания в течение 10 мин. В результате получают маточный раствор адреналина (500 мкг/мл).
Для приготовления рабочего раствора адреналина из маточного пользуются следующей схемой:
| Номер раствора с адреналином | Физиологический(0,9%) раствор хлорида натрия |
Разведение маточного раствора | Конечная концентрация при агрегометрии (0,45 мл плазмы + 0,05 мл раствора адреналина) |
| 1 | 4,9 мл + 0,1 мл маточн. раствора | 1:50 | 10 мкг/мл |
| 2 | 1,0 мл + 1,0 мл из раствора 1 | 1:100 | 5 мкг/мл |
| 3 | 1,0 мл + 1,0 мл из раствора 2 | 1:200 | 2,5 мкг/мл |
Запись агретограммпроводят в соответствии с инструкцией к агрегометру. С помощью растворов адреналина разной концентрации получают запись кривых агрегации тромбоцитов. Наряду с кривыми агрегации на экране отображается количество тромбоцитов в исследуемой плазме. В норме количество тромбоцитов составляет 140 – 400*109 /л
2.3 Методы исследования коагуляционного гемостаза
2.3.1 Определение протромбинового времени (Техпластин – тест)
Принцип метода: тромбопластин (фактор III, тромбокиназа) превращает протромбин плазмы крови в присутствии ионов кальция в активный фермент тромбин, трансформирующий фибриноген плазмы крови в нерастворимый фибрин. Измеряется протромбиновое время – время образования фибрина в плазме крови в присутствии ионов кальция и тканевого тромбопластина (растворимого экстракта из мозга человека).
Состав набора: техпластин – лиофильно высушенная тромбопластин-кальциевая смесь, на 5,0 мл суспензии – 4 фл. МИЧ Техпластина в разных сериях составляет 1.1 или 1.2.; контрольная плазма – лиофильно высушенный пул плазмы крови не менее, чем от 20 здоровых людей, на 0,5 мл – 1фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 0,5; 5,0 мл; вода дистиллированная.
Приготовление анализируемых образцов: венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение Техпластина : в один флакон с Техпластином внести 5,0 мл дистиллированной воды. Флакон встряхнуть и выдержать при +370 С в течение 20 мин.
Разведение контрольной плазмы: во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин. Разведенную плазму перед исследованием выдержать 25-30 мин. при комнатной температуре.
Проведение анализа:
Определение контрольных (нормальных) показателей:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы.
2. Инкубировать при температуре + 370 С 1 мин.
3. Добавить 0,2 мл разведенного Техпластина, имеющего температуру +370 С и начать отсчет времени свертывания до образования фибрина.
Аналогично определить протромбиновое время в образцах плазмы больных.
В норме протромбиновое время, измеренное на коагулометре, составляет 12-15 с.
Рассчитывают протромбиновый индекс по следующей формуле:
ПТИ = (ПВ контрольной нормальной плазмы /ПВ больного) x 100%
В норме ПТИ составляет 85 – 105%.
2.3.2 Методы определения АЧТВ ( (АПТВ/АЧТВ) – тест)
Принцип метода: определяется время свертывания плазмы крови в условиях стандартизированной контактной (каолином) и фосфолипидной (кефалином) активации процесса в присутствии ионов кальция.
Состав набора: кефалин (лиофильно высушенный фосфолипидный компонент) – 2 фл.; каолин (концентрированная суспензия 200:1 в дистиллированной воде), 1 мл – 1 фл.; буфер трис НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 1 фл.; кальция хлорид (концентрированный 20:1 раствор, 5 М), 10 мл – 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1; 5,0 мл; вода дистиллированная; цилиндр мерный вместимостью 200 мл.
Приготовление анализируемых образцов: венознуюкровь центрифугируют при 1000 об/мин (240 g) в течение 7 мин. Богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (1200g) в течение 15 мин., в результате получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение кефалина: в один флакон с кефалином внести 2,0 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и энергичном покачивании в течение 2 мин. В результате получают раствор кефалина, который до использования должен быть выдержан при комнатной температуре в течение 60 мин.
Приготовление АПТВ – реагента: концентрированный буфер трис НСl и концентрированную суспензию каолина количественно перенести из флаконов в мерный цилиндр и общий объем довести дистиллированной водой до 200 мл. В результате получают рабочую суспензию каолина. Для приготовления AЧТВ - реагента смешать в пробирке 0,1 мл раствора кефалина с 3,0 мл рабочей суспензии каолина.
Приготовление рабочего раствора хлорида кальция: в день исследования, в соответствии с потребностью, концентрированный раствор хлорида кальция развести дистиллированной водой в 20 раз (1 объем концентрированного раствора + 19 объемов воды).
Проведение анализа:
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл исследуемой плазмы и прогреть ее при +370 С в течение 1 мин.
2. В кювету добавить 0,1 мл AЧТВ - peaгeнтa, имеющего комнатную температуру.
3. Через 3 мин к смеси добавить 0,1 мл рабочего раствора хлорида кальция и зарегистрировать время свертывания.
AЧТВ в нормальной плазме составляет 28-38 с.
2.3.3 Определение тромбинового времени (Тромбо – тест)
Принцип метода: заключается в определении времени свертывания плазмы крови под влиянием тромбина стандартной активности.
Состав набора: тромбин (лиофильно высушенный, 6-8 ед NIH во фл.) - 4 фл.; контрольная плазма (лиофильно высушенная) - 1 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: коагулометр; пипетки вместимостью 0,1 - 1,0, 10,0 мл; вода дистиллированная;
Приготовление анализируемых образцов: венозную кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200 g) в течение 15 мин. получают бедную тромбоцитами плазму.
Подготовка реагентов к работе:
Разведение тромбина: в один из флаконов с тромбином внести необходимое количество дистиллированной воды (см. таблицу) и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 2-3 мин.
Ориентировочные значения нормы тромбинового времени свертывания
| Объем дистиллированной воды на флакон с тромбином, мл | Время свертывания, сек., при коагулометрическом определении |
| 2,0 | 11-14 |
| 3,0 | 15-19 |
| 5,0 | 20-29 |
Разведение контрольной плазмы: во флакон с контрольной плазмой внести 0,5 млдистиллированной воды и растворить содержимое при комнатной температуре и легком покачивании в течение 3 мин.
Проведение анализа :
1. В кювету коагулометра внести 0,1 мл контрольной плазмы и прогреть ее при +370 С в течение 1 мин.
2. В ту же кювету добавить 0,1 мл раствора тромбина и зарегистрировать время свертывания.
Исследование плазмы больного выполняется аналогично.
Чтение результатов: результат выражают в секундах, сравнивают время свертывания контрольной и исследуемой плазмы. В норме ТВ составляет 14 – 17 с.
2.3.4 Определения концентрации фибриногена (Квик – Фг – тест)
Принцип метода: образовавшийся после свёртывания плазмы крови фибрин быстро высушивается и по его весу определяется содержание фибриногена в плазме.
Состав набора: тромбопластин, 1 г – 2 фл.; хлорид кальция (концентрированный 20:1 раствор, 5,54%), 10 мл – 6 фл.; буфер трис – НСl (концентрированный 20:1 раствор, 1 М), 10 мл – 2 фл.
Оборудование, материалы, реагенты: термобаня на 370 ; весы торсионные; центрифуга лабораторная; пробирки стеклянные; цилиндр мерный вместимостью 200 мл; ступка фарфоровая с пестиком; вода дистиллированная; бумага фильтровальная.
Приготовление анализируемых образцов: кровь центрифугируют при 3000 – 4000 об/мин (1200g) в течение 15 мин. Получают бедную тромбоцитами плазму.
Приготовление реагентов:
Приготовление суспензии тромбопластина : навеску сухого тромбопластина (50 мг) поместить в фарфоровую ступку, добавить 1,0 мл физиологического (0,9 %) раствора хлорида натрия или раствора трис – буфера (0,05 М, pH 7,4) и тщательно растирать в течение 2 мин. Затем дополнительно добавить в ступку 4,0 мл выбранного раствора, перемешать с помощью пестика и взвесь центрифугировать при 1000 об/мин (240 g) в течение 5-6 мин. Надосадочную жидкость слить в другую пробирку и использовать для анализа.
Разведение концентрированного буфера: содержимое одного флакона с концентрированным буфером трис – НСl перенести в мерный цилиндр и довести объем дистиллированной водой до 200 мл. Получаем рабочий раствор буфера.
Проведение анализа:
1. В пробирке последовательно смешать 1,0 мл исследуемой бедной тромбоцитами плазмы крови, 0,1 мл суспензии тромбопластина и 0,1 мл 5, 54 % раствора хлорида кальция.
2. Пробирку встряхнуть и поместить на водяную баню при +37о С на 10 мин.
3. Образовавшийся в результате инкубации сгусток перенести на фильтровальную бумагу и высушивают путём сжатия и перемещения сгустка по фильтру.
4. Сгусток фибрина выдержать на открытом воздухе при комнатной температуре в течение 15 – 20 мин и взвесить на торсионных весах.
В норме масса сгустка, полученного из 1 мл плазмы крови, составляет 10 – 20 мг. Содержание фибриногена в г/л находят при умножении массы сухого фибрина на коэффициент 0,2. В норме содержание фибриногена в плазме составляет 2,0 – 4,0 г/л.
2.4 Методы исследования антикоагулянтного гемостаза
2.4.1 Определение активности антитромбина III
Принцип метода: исследуемую плазму обрабатывают сорбентом гепарина, подвергают тепловой дефибрикации и смешивают со стандартным количеством тромбина. После инкубации смеси в ней определяют остаточную коагуляционную активность тромбина. По уровню снижения активности тромбина оценивают активность АТ III в исследуемой плазме.
Оборудование и материалы: коагулометр; набор реагентов для определения активности антитромбина III ООО Технология – Стандарт.
Проведение анализа:
в пробирку вносят 0,4 мл раствора тромбина и прогревают на водяной бане (37о
С) в течение 2 мин. Параллельно в кювету коагулометра вводят 0,15 мл разведённой плазмы (или раствора фибриногена) и инкубируют при t 37о
С не
8-09-2015, 23:30