Вирулентность входящих в состав сероваров штаммов лептоспир варьирует в широких пределах. Поэтому чрезвычайно важным представляется поиск маркеров их вирулентности на штаммовом уровне. 1 из таких маркеров может служить белок с мМас 30кД, входящий в состав гликолипопопротеина вирулентных штаммов лептоспир. У авирулентных штаммов вместо него экспрессируется белок с мМас 20 кД (40). Установлено также, что синтез трансмембранного наружного мембранного протеина у авирулентных штаммов происходит значительно интенсивнее, чем у вирулентных штаммов ЛС, а протеины с мМас 45 и 32–34 кД, наоборот, являются маркерами вирулентности этих спирохет.
– Серотипирование
Разделение лептоспир на серогруппы осуществляют по результатам перекрестной реакции агглютинации-лизиса (РАЛ). Деление серогрупп на серовары проводят в тесте адсорбционной агглютинации (РАА), с помощью антисывороток, моноклональных антител, рестрикционного эндонуклеазного анализа и ПЦР.
Моновалентные антисыворотки к серогруппам и сероварам получают иммунизацией кроликов культурами соответствующих штаммов лептоспир. Перекрестную РА ставят со всеми известными серогруппами и сероварами лептоспир. Сравнение величины титров агглютинации-лизиса музейных и тестируемого штаммов лептоспир моновалентными антисыворотками позволяет установить степень родства между ними. В случае, когда тестируемый изолят не проявляет серологического родства с музейными штаммами лептоспир, его определяют как оригинальный серовар.
РАА основана на адсорбции агглютинирующих антител из моновалентных сывороток формалинизированным бактерином музейного и тестируемого штаммов лептоспир. Их выращивают в жидкой среде с полисорбатом-80 и бычьим сывороточным альбумином при температуре 29 °C. Антиген готовят из 4–8-дневных культур. Смесь (1:9) антисыворотки с титром не более 1:3000 и сконцентрированного центрифугированием в 60–70 раз антигена выдерживают при температуре 37 °С в течение 18 ч, центрифугируют (30 мин при 10000 об/мин) и тестируют в РАА. Снижение первоначального титра сыворотки соответствует ее истощению тестируемым штаммом. Перекрестную реакцию с истощенными сыворотками ставят по обычной схеме в ряде возрастающих разведений (1:100, 1:500 и т.д.).
Оценку результатов проводят по следущим критериям:
а) при идентичности музейного и тестируемого штаммов они полностью сорбируют антитела из гомологичной и гетерологичной антисывороток;
б) сравниваемые штаммы относят к разным серотипам, если 10% или более гомологичного титра антител обнаруживается в каждой из 2 (гомологичной и гетерологичной) истощенных сывороток;
в) сравниваемые штаммы относят к разным подтипам одного серотипа, когда 1 антисыворотка после истощения гетерологичным штаммом сохраняет менее 10% гомологичного титра, а другая -10% или более гомологичного титра.
– Серологическая диагностика
Лептоспироз может быть диагностирован также на основании обнаружения высоких титров специфических антител или сероконверсии. Кроме того, серологические тесты применяют для контроля экспериментальной инфекции лабораторных животных и типирования выделенных изолятов лептоспир. Они позволяют поставить диагноз на лептоспироз в вариабельные сроки после начала болезни, определяемые динамикой антител, выявляеых используемым тестом. Специфические агглютинины и лизины обычно появляются в крови не ранее 7–8 дн после начала болезни.
Наличие противолептоспирозных антител в крови ранее прививавшихся и переболевших лептоспирозом собак не позволяет интерпретировать однократно полученные положительные результаты серологического исследования. Поэтому требуется повторное серологическое исследование больного животного через 3–5 дн и более отдаленные сроки. Диагностическим считается установление 4-кратного изменения титра сывороточных антител при тестировании парных проб сыворотки крови. Необходимо иметь в виду, что у подвергавшихся антибиотикотерапии собак процесс образования антител к лептоспирам может быть заторможен по времени и интенсивности. Антитела к лептоспирам персистируют в крови собак в течение многих месяцев, а порой даже лет. У хронически инфицированных лептоспирозом животных титры специфических антител могут снижаться ниже уровня, выявляемого рутинными методами серологической диагностики.
Для серологической диагностики лептоспироза применяют различные варианты РА (РАЛ, макроагглютинации, микроскопической аггглютинации, РЛА), РСК и ЭЛИЗА.
Реакция Агглютинации (РА)
Для постановки РА необходим набор живых культур патогенных для животных сероваров лептоспир, циркулирующих на данной территории. Важнейшими факторами, определяющими специфичность РА, являются чистота и идентичность антигенов. Последнюю контролируют в лабораториях не реже 2 раз в год с применением гипериммунных кроличьих антисывороток или моноклональных антител. Чистоту антигенов лептоспир регулярно проверяют посевами на кровяной агар или тиогликолевый бульон.
Музейные культуры лептоспир можно хранить в жидком азоте при -70 °C или в лиофилизированном виде. Частые пересевы на жидких средах нередко ведут к потере ими антигенности. В таком случае вновь возвращаются к работе с музейным штаммом.
Основными недостатками РА при лептоспирозе являются значительные затраты времени и труда на ее постановку, необходимость применения большого количества антигенов лептоспир разных серогрупп, вариабельность качества используемых живых лептоспирозных антигенов, потенциальную опасность заражения проводящих серологическое исследование специалистов (при использовании в качестве антигена живых культур лептоспир), субъективность оценки результатов, возможность перекрестных реакций сероваров, относящихся к разным серогруппам и недостаточно высокую чувствительность (например, при исследовании животных, выделяющих возбудителя с мочой, но не имеющих выраженного антительного ответа). Последнее связано с динамикой IgM-агглютининов (IgG в РА не выявляют). Разработано несколько описанных ниже вариантов теста.
1. РАЛ
Со времени разработки Мартином и Петтитом в 1918 г. этот тест остается «золотым стандартом» серологической диагностики лептоспироза (ПРЛ 10:3.1). Для получения антигена для РАЛ используют 7–10-дневные культуры лептоспир, выращенные на жидких питательных средах и имеющие пышный рост (не менее 50 лептоспир в поле зрения без спонтанной агглютинации и примесей).
Агглютинация проявляется склеиванием лептоспир в агломераты, размер которых может варьировать от 3–5 бактерий до огромных шаров, занимающих несколько полей зрения микроскопа. Лизис сначала проявляется образованием зернистости у одиночных и агглютинированных лептоспир. Затем бактерии постепенно теряют подвижность и фрагментируются, превращаясь в скопление аморфных зернистых образований. Агглютинация и лизис протекают в первых разведениях сыворотки одновременно, но по мере увеличения разведения сыворотки начинает преобладать агглютинация так, что в конечных разведениях лизис отсутствует).
Специфические агглютинины появляются в крови через 7–10 дн после заражения. У непривитых животных в этот период титр агглютининов обычно невысок (1:100 – 1:200), но в последующем он быстро возрастает до 1:400 и выше, что считают диагностическим уровнем. Обычно к концу второй недели болезни титр антител повышается в 15–40 раз и выше. На этом уровне он сохраняется несколько недель. В последующем отмечают тенденцию постепенного его снижения. На острой стадии инфекции отмечают 4-кратное повышение титра агглютинирующих антител к лептоспир при тестировании парных проб сывороток. Однако при исследовании этим тестом сыворотки хронически больных животных могут быть получены отрицательные результаты из-за низкого титра специфических агглютининов.
При оценке результатов теста необходимо принимать во внимание большую продолжительность персистенции агглютининов у многих переболевших и привитых, а также возможность отсутствия сероконверсии у части инфицированных животных. Стабильные титры антител 1:200 -1:400 выявленные в крови с интервалом в 1–2 нед скорее свидетельствуют о ранее перенесенном заболевании или лептоспироносительстве, чем о текущей инфекции. 4-кратное повышение титра антител считают доказательством последней.
Поскольку на динамику антительного ответа большое влияние оказывает интенсивность репродукции ЛС в организме животного, то первое серологическое исследование необходимо проводить до начала антибиотикотерапии и введения противолептоспирозных антисыворотки /Ig. В случаях неспецифической реактивности пробы сыворотки крови исследуют повторно после обработки 2-меркаптоэтанолом.
В РАЛ может быть тестирована также моча подозреваемых в заболевании лептоспирозомживотных. Однако результаты такого исследования носят ориентировочный характер, поскольку титр специфических антител в моче обычно не превышает 10% титра сывороточных антител.
2. Микроскопическая реакция агглютинации (МРА)
В рутинной лабораторной практике и полевых условиях в настоящее время пользуются не РАЛ, а ее модифицированным вариантом – МРА. Тест проводят в плашках аналогично классической РАЛ, но при учете результатов оценивают лишь степень агглютинации лептоспир (ПРЛ 10:3.1).
С целью снижения риска заражения лабораторных работников разработан также вариант реакции, при постановке которого вместо живых культур лептоспир применяют инактивированные 0,2–0,5% формалина бактерины. При оценке результатов МРА учитывают только агглютинацию, поскольку формалинизированные лептоспир не лизируются сывороткой. Из-за недостаточно высокой чувствительности эта модификация теста не нашла широкого применения.
Вместо набора антигенов разных сероваров патогенных лептоспир при постановке теста может быть использован единственный антиген, которым служит штамм Patoc 1 непатогенного вида L.biflexa. Реакция позволяет лишь установить принадлежность тестируемого изолята к лептоспир.
Испытуемую сыворотку исследуют в разведениях 1:100, 1:500 и 1:2500 (при необходимости разведение готовят 1:100, 1:200, 1:400). Реакцию ставят в пластинах с лунками. Предварительно разведенную ИХН сыворотку разливают по 0,1 мл мерной пипеткой в каждую лунку, начиная с наибольшего разведения сыворотка (ее наименьшей концентрации). Для разлива можно воспользоваться пипеткой Флоринского. Каждое разведение сыворотки вносят в отдельный ряд из 6 или более лунок в зависимости от числа антигенов, используемых для постановки РМА. Каждую из 6 культур лептоспир (антиген) вносят по 0,1 мл в 3 лунки с разведенной сывороткой. В результате конечное разведение сыворотки получается 1:100, 1:500, 1:2500. Пластины осторожно встряхивают, помещают в термостат при температуре 30 С, на 1 час. Одновременно ставят контроли: 0,1 мл культуры + 0,1 мл ИХН (для исключения самоагглютинации лептоспир). Учет реакции проводят микрокопированием в темном поле. Агглютинация проявляется в склеивание лептоспир и образование «паучков», состоящих из нескольких десятков или сотен бактерий. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность. Оценка результатов – по 4-крестовой системе. Диагностически положительной считается агглютинирование лептоспир 4, 3 и 2 креста (при отсутствии агглютинации в контроле) в любом разведении сыворотки. ++++ (четыре креста) – полная агглютинация лептоспир – склеивание лептоспир с образованием скоплений в виде «паучков», состоящего из разного количества лептоспир, +++ (три креста) – 50%, ++ – 25%, (–) минус – агглютинация отсутствует.
3. Реакция макроагглютинации (РМА)
Этот вариант РА проводят с жидкими культурами референтных сероваров лептоспир, в которых рост бактерий проявляется видимой при встряхивании пробирки мутью. После добавления в них разведения (1:10) гомологичной антисыворотки в соотношении 1:5 из агглютинировавших лептоспир быстро образуются хлопья, сохраняющиеся несколько суток и полностью не распадающиеся даже при энергичном встряхивании пробирок.
В модификации Смита-Тулоша (1937 г.) реакцию проводят 3 ч при температуре 37◦С, а затем 30 мин при 55◦С и учитывают результаты с помощью лупы при непрямом освещении.
Старбук и Уорд (1942 г.) предложили проводить тест с формалинизированными культурами ЛС. Обработанные формалином лептоспиры осаждают центрифугированием и окрашивают генцианвиолетом. При постановке реакции смешивают по 1 капле антигенов и тестируемой сыворотки на стеклянной пластинке белого цвета. Ее осторожно покачивают в течение 10 мин и проводят учет результатов. Положительной реакцией считают появление в смеси рыхлых, окрашенных в синий цвет агрегатов.
4. РЛА
По чувствительности РЛА несколько уступает РАЛ, но проще в постановке и позволяет получить результат в более короткий срок. Проводится с помощью латексных частиц, на которых сорбируется антиген лептоспир.
5. РА полимерных частиц с лептоспирозным антигеном .
Этот современный вариант РА пока еще не нашел широкого применения, хотя получил положительные отклики, как медицинских, так и ветеринарных специалистов. В качестве носителя наружных мембранных антигенов лептоспир использованы частицы поли-DL-лактид-полиэтиленгликоля, покрытые антигеном лептоспир. Тест по специфичности соответствует, но несколько уступает по чувствительности РАЛ. Он проще в постановке и позволяет получить результат серологического исследования в течение 3 ч. Кроме того, агглютинины выявляются им в более ранние сроки и в более высоком титре, чем в РА.
6. Реакция Связывания Комплемента (РСК)
РСК редко используют для серологической диагностики лептоспироза собак. Комплементсвязывающие антитела появляются у инфицированных сероварами icterohaemorrhagiaee и canicola животных этого вида через 4 дн после заражения, а через 9–10 нед они исчезают. Тест не позволяет дифференцировать серовары лептоспир.
При постановке РСК большое значение имеет концентрация лептоспир в антигене. Поэтому для приготовления последнего отбирают только те культуры лептоспир, в которых при темнопольном микроскопировании в 1 поле зрения видно не менее 50–100 бактерий. Для получения ориентировочного результата РСК проводят с пулом антигенов разных сероваров (полиантигеном), но при необходимости установления серотипа / серовара лептоспир, вызвавшего инфекцию у животного, для постановки теста пользуются моновалентными антигенами, приготовленными из референтных штаммов, относящихся к определенным серогруппам / сероварам
8.5 Дифференциальный диагноз
При постановке диагноза на лептоспироз необходимо проводить дифференциальную диагностику и учитывать, что животные, имеющие в крови антитела, могут погибать от различных инфекционных и неинфекционных болезней.
Лептоспироз крупного и мелкого рогатого скота следует дифференцировать от бруцеллеза, гемоспоридиозов, злокачественной катаральной горячки, кампилобактериоза, трихомоноза, сальмонеллеза, пневмоэнтеритов вирусной этиологии, микотоксикозов и листериоза; нужно также исключить диспепсию, анемию, желтуху, белковый перекорм, гепатит, цистит, гипотонию и атонию преджелудков, гемоглобинурию новорожденных, нефрозы и нефриты незаразной этиологии.
У свиней, кроме бруцеллеза и сальмонеллеза, следует дифференцировать рожу, чуму, дизентерию, белковое, витаминное и минеральное голодания, микозы и микотоксикозы.
У лошадей – инфекционный энцефаломиелит, инфекционную анемию; у собак и пушных зверей – чуму, инфекционный гепатит, сальмонеллез. Дифференциация указанных болезней и патологических состояний проводится на основании комплекса данных.
При микроскопической диагностике лептоспиры необходимо отличать от нитей фибрина, обломков хвостовых частей спермиев, разрушенных эритроцитов, спирилло- и вибрионо-подобных микроорганизмов и особенно интерспир у хряков.
Чтобы поставить окончательный диагноз такого заболевания как лептоспироз, следует исключить заболевание собаки чумкой. Известно, что в отличие от чумы, лептоспироз не обладает высокой контагиозностью (не происходит заражение при непосредственном общении). Чуме подвержены щенки и молодые животные, лептоспирозом в основном болеют собаки, завершившие половые созревание. При лептоспирозе температура тела повышается в начале заболевания, а потом снижается до нормы и ниже. Чума характеризуется высокой температурой на протяжении всего периода заболевания. При чуме не наблюдается язвенный стоматит и желтуха. Дифференцируя лептоспироз от алиментарного отравления, необходимо учитывать, что отравления – явления спорадические, которые исчезают при смене корма и обычном лечении.
При инфекционном гепатите температура тела в начале заболевания нормальная, а затем повышается до 40–41 °С. Носовое зеркало сухое, собаки испытывают сильную жажду. Болеют, в основном, животные, не достигшие годовалого возраста, большинство из них погибает. При гистоисследовании печени обнаруживаются тельца Рубарта. Парвовирусный энтерит также нельзя спутать с лептоспирозом. Им болеют в основном щенки и молодые животные. Наблюдается рвота и понос на протяжении всего заболевания. Даже глоток простой воды может вызвать неукротимую рвоту. Собаки, больные энтеритом, обезвожены, резко худеют. Слизистые рта, склеры глаз сухие, язык обложен серым налетом. Фекалии имеют характерный зловонный запах. Наблюдаются серьезные изменения в миокарде. Нет желтушности.
Диагноз на лептоспироз считают установленным в любом из следующих случаев:
1. Культура лептоспир выделена из патологического материала или органов лабораторного животного, зараженного исследуемым материалом;
2. Лептоспиры обнаружены при микроскопическом исследовании в крови, или суспензии из органов животных, абортированном плоде, моче, или органах лабораторного животного, павшего после заражения исследуемым материалом;
3. Антитела обнаружены в сыворотке крови более чем у 20% обследованных животных в титре 1:80 у невакцинироваиных – 1:100 и более у вакцинированных в РМА. При выявлении меньшего числа положительных, реакций проводят микроскопию мочи. Пои отрицательных результатах микроскопии мочи повторное исследование сыворотки крови и мочи у ранее исследованных животных проводят через 15–30 дней. Обнаружение лептоспир или антител при повторном исследовании у животных, не имевших их при предыдущем исследовании или нарастании титра антител в пять и более раз. Лептоспироз считают причиной абортов (мертворождения) при обнаружении:
1. Лептоспир в органах (тканях, жидкостях) плода или околоплодных водах.
2. Антител к лептоспирам в сыворотке крови плода в РМА в разведении 1:5 (с антигеном 1:10) и более.
Лептоспироз считают причиной гибели животных при наличии кливических признаков и паталогоанатомических изменений, характерных для лептоспироза, подтвержденных обнаружением лептоспир в крови или паренхиматозных органах (кроме почек).
9. Иммунитет, специфическая профилактика
Переболевшие лептоспирозом животные приобретают стойкий и напряженный иммунитет, длящийся годами. Но после переболевания у части животных с мочей долгое время выделяются лептоспиры, т.е. иммунитет нестерильный. У другой части животных – иммунитет стерильный.
При лептоспирозе развивается как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Макрофаги первыми обезвреживают лептоспир, затем вырабатываются и накапливаются антитела – агглютинины, лизины, преципитины, комплемент связывающие. Поэтому сыворотка крови гипериммунизированных животных и реконвалесцентов обладают высокими терапевтическими свойствами.
Еще в 1934 году профессором С.Я. Любашенко была предложена поливалентная гипериммунная сыворотка против лептоспироза. Наиболее хороший терапевтический эффект сыворотка дает при ее применении в начале заболевания. Кроме того, гипериммунная сыворотка и получаемый из нее гамаглобулин, не предотвращают лептоспироносительства и не профилактируют аборты. Пассивный иммунитет, создаваемый данной сывороткой, кратковременный.
В настоящее время для производства гипериммунной сыворотки используют лептоспиры 8-ми серологических вариантов.
Для специфической профилактики (активной иммунизации) лептоспироза в 1939 году С.Я. Любашенко впервые предложил инактивированную карболовой кислотой вакцину. С 1946 по 1958 гг. в нашей стране применяли хинозолевую вакцину, которая содержала антигены трех серологических вариантов лептоспир Pomona, Grippotyphosa и Icterohaemorrhagiae.
Позднее, когда от больных животных были выделены новые серовары лептоспир, вакцину начали готовить из пяти серотипов, добавив к предыдущим серовары Canicola и Tarassovi.
Сейчас готовят несколько видов вакцин с различным набором серотипов. В различных регионах вакцину подбирают исходя из из циркулируемых здесь серотипов лептоспир.
10. Профилактика и меры борьбы
Согласно действующей инструкции о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных профилактика болезни осуществляется путем проведения комплекса организационно-хозяйственных, ветеринарно-санитарных и специфических мероприятий.
Этот комплект включает в себя:
1. Меры, направленные на недопущение заноса лептоспироза в благополучные хозяйства;
2. Меры, направленные на выявление природных очагов лептоспироза, и контроль благополучия стад;
3. Меры, направленные
8-09-2015, 20:09