План
- Введение
- Геномика и медицина
- Структура вирусного генома
- Другие геномы
- Структура генома прокариот
- Что удается узнать о бактериях по их геному?
- Ориентация генов (направление транскрипции)
- Гомологичные гены и копийность генов
- Изменение функции гена в процессе эволюции
- Исследования генома человека
- Проект "Геном человека" (Human Genome Project)
Введение
Генетика представляет собой одну из основных, наиболее увлекательных и вместе с тем сложных дисциплин современного естествознания. Место генетики среди биологических наук и особый интерес к ней определяются тем, что она изучает основные свойства организмов, а именно наследственность и изменчивость.
В результате многочисленных – блестящих по своему замыслу и тончайших по исполнению – экспериментов в области молекулярной генетики современная биология обогатилась двумя фундаментальными открытиями, которые уже нашли широкое отражение в генетике человека, а частично и выполнены на клетках человека. Это показывает неразрывную связь успехов генетики человека с успехами современной биологии, которая все больше и больше становится связана с генетикой.
Первое – это возможность работать с изолированными генами. Она получена благодаря выделению гена в чистом виде и синтезу его. Значение этого открытия трудно переоценить. Важно подчеркнуть, что для синтеза гена применяют разные методы, т.е. уже имеется выбор, когда речь пойдет о таком сложном механизме как человек.
Второе достижение – это доказательство включения чужеродной информации в геном, а также функционирования его в клетках высших животных и человека. Материалы для этого открытия накапливались из разных экспериментальных подходов. Прежде всего, это многочисленные исследования в области вирусогенетической теории возникновения злокачественных опухолей, включая обнаружение синтеза ДНК на РНК-матрице. Кроме того, стимулированные идеей генетической инженерии опыты с профаговой трансдукцией подтвердили возможность функционирования генов простых организмов в клетках млекопитающих, включая клетки человека.
Без преувеличения можно сказать, что, наряду с молекулярной генетикой, генетика человека относится к наиболее прогрессирующим разделам генетики в целом. Ее исследования простираются от биохимического до популяционного, с включением клеточного и организменного уровней.
XX век стал веком величайших открытий во всех областях естествознания, веком научно-технической революции, которая изменила и облик Земли, и облик ее обитателей. Возможно, одной из основных отраслей знания, которые будут определять облик нашего мира в следующем веке, является генетика. С этой сравнительно молодой наукой всегда было связано немало споров и противоречий, но последние достижения генетики и генной инженерии, которая вполне может считаться самостоятельной дисциплиной, в таких областях, как исследование генома человека и клонирование, хотя и открыли широкие перспективы развития биотехнологий и лечения различных заболеваний, сделали возможным изменение самой сущности человека, породив тем самым множество вопросов этического, даже, скорее, философского, характера. Имеет ли человек право изменять то, что создано природой? Имеет ли право исправлять ее ошибки и, если да, то где та грань, которую нельзя переступать? Не обернутся ли научные знания катастрофой для всего человечества, как это случилось, когда была открыта энергия атома, уничтожившая Хиросиму, Нагасаки и Чернобыль? На эти вопросы все отвечают по-разному, поэтому в своей работе я попытаюсь не только рассказать о самих проблемах научной этики, связанных с генетикой, но и по возможности отразить различные точки зрения на эти проблемы.
Геномика и медицина
В системе современных биотехнологий лидирующую (можно сказать, парадигмальную) роль играет «геномика». Английское слово «genomics», переводится на русский язык калькой «геномика». используется для обозначения многопланового, не имеющего устойчивых границ феномена. Центральную часть феномена занимают фундаментальные исследования, объединенные в рамках Международного проекта «Геном человека», который ставит своей задачей к 2003 году завершить первый этап на пути исчерпывающего описания последовательностей нуклеотидов в ДНК человека(сиквенирование) и подготовки полной карты человеческих генов с их точной локализацией в хромосомах (картирование). К лету 2000 года завершено в черновом варианте сиквенирование практически всего генома человека. О чем поспешили известить мировую общественность американский президент и британский премьер министр.
Однако геномика — не только область биотехнологий, но и специфический социальный феномен. Вокруг геномных исследований происходит агглютинация многообразия медико-генетических практик (сращение фундаментальных и прикладных исследований весьма характерно), языков, социальных конфликтов, политических кампаний, мифов и знаний, новых надежд и неизвестных ранее угроз существу человека, вожделений и способов их удовлетворения. Этот конгломерат, складывающийся вокруг геномных исследований, и получил название «геномика». В некотором смысле, близком к предложенному В.Розиным, геномику можно назвать особым биотехнологическим дискурсом.
Есть серьезные основания полагать, что геномика — не просто грандиозное научное предприятие, не просто «проект века», но скорее всего — первое заявление о себе во весь голос феномена новой науки («другой науки»), хотя и сохраняющей преемственность с наукой XX века, но одновременно вносящей в нее ряд новых системообразующих качеств. Программа «Геном человека» существует и финансируется в России с 1989 года. Несмотря на серьезные экономические трудности, работы в этой области продолжаются и поныне. В США, которые осуществляют большую часть проводимых исследований по проекту «Геном человека», финансирование началось с 1990 года. Помимо США и России в реализации проекта участвуют ведущие научные центры Западной Европы, Японии и некоторых других стран. Задача проекта заключается в том, чтобы картировать около 80000 генов и установить последовательность примерно трех миллиардов нуклеотидов, из которых состоит ДНК человека.
Следует также отметить, что осуществление проекта «Геном человека» сопряжено с революционизацией молекулярно-биологическихтехнологий, которые впоследствии могут найти применение в диагностике и коррекции генетически детерминированных заболеваний, атак-же в промышленных биотехнологиях. Уже сейчас растет число частных фирм, которые вкладывают значительные ресурсы в развитие геномных исследований, предполагая получить грандиозные прибыли. Лучше технически оснащенные и богаче финансируемые биотехнологические компании составляют мощную конкуренцию университетским лабораториям — традиционным лидерам молекулярно-биологических исследований.
Геномика сформировалась как особое направление в 1980—1990-х гг. вместе с возникновением первых проектов по секвенированию геномов некоторых видов живых организмов. Первым был полностью секвенирован геном бактериофага Φ-X174; (5 368 kb) в 1980 г. Следующим этапным событием было секвенирование генома бактерии Haemophilus influenzae (1.8 Mb) (1995). После этого были полностью секвенированы геномы еще нескольких видов, включая геном человека (2001 — первый черновой вариант, 2003 — завершение проекта). Её развитие стало возможно не только благодаря совершенствованию биохимических методик, но и благодаря появлению более мощной вычислительной техники, которая позволила работать с огромными массивами данных. Протяженность геномов у живых организмов подчас измеряется миллиардами пар оснований. Например, объем генома человека составляет порядка 3 млрд. пар оснований, или 3 000 Mb, а самые крупный из известных геномов (у одного из видов амёб) — 6.7×1011 пар оснований.
Получение полных последовательностей геномов позволило пролить свет на степень различий между геномами разных живых организмов. Ниже в таблице представлены предварительные данные о сходстве геномов разных организмов с геномом человека. Сходство дано в процентах (отражает долю пар оснований, идентичных у двух сравниваемых видов).
Структура вирусного генома
На примере папилловирусов. Вирусы папиллом относятся к семейству паповавирусов (Papovaviridae) и представляют собой группу вирусов, поражающих крупный рогатый скот, птиц и человека, которые способны инфицировать базальные клетки кожи и плоского эпителия. Папилломавирусы - одна из наиболее гетерогенных групп вирусов, критерием дифференцировки которой является степень генетического родства вирусов по данным молекулярной гибридизации: она может колебаться от 10 до 85%. Диаметр вирусных частиц 55 нм. Вирус не имеет внешней оболочки. Капсид вируса состоит из 72 капсомеров. Детальный анализ молекулы ДНК ВПЧ стал возможен после разработки методики расщепления ДНК с использованием эндонуклеаз и анализа этих фрагментов с помощью гель-электрофореза. Данный метод позволил определить характерные картины расщепления ДНК и создать физическую карту расположения точек расщепления в геноме различных папилломавирусов [.
Известные типы папилломавирусов человека сходны по своей генетической структуре. Генетический материал вируса представлен кольцевой двухцепочечной молекулой ДНК длиной около 8000 пар оснований, что соответствует массе около 5 млн Д. Одна из нитей ДНК содержит 9 открытых рамок считывания (open reading frames, ORF), которые потенциально кодируют до 10 протеинов, и регуляторный участок генома (upstream regulatory region, URR). Другая нить ДНК некодирующая.
Регуляторная область вирусного генома (upstream regulatory region, URR) располагается между концом области поздних генов и началом области ранних генов. Открытые рамки считывания ORF генома вируса разделены на ранний (early, Е) и поздний (late, L) участки. Ранний фрагмент включает гены Е1-Е7, кодирующие синтез белков, ответственных за различные функции в процессе репликации вируса и трансформации клеток. Гены Е1 и Е2 ответственны за репликацию вируса, а также участвуют в регуляции транскрипции вирусного генома. Продукт гена Е1 отвечает за поддержание персистенции вирусного генома в эписомальной форме. Ген Е2 кодирует продукты, которые могут как транс-активировать, так и подавлять экспрессию ранних генов и энхенсерных участков URR. Трансактивирующий фактор идентифицирован в предраковых изменениях шейки матки, репрессирующий фактор in vivo не идентифицирован. Ген Е4 участвует в процессе созревания вирусных частиц, гены Е5-Е7 обладают трансформирующим потенциалом. Гены Е6 и Е7 всегда определяются и экспрессируются в опухолях шейки матки и полученных из опухолей шейки матки клеточных линиях. Биологический эффект трансформирующего потенциала генов Е6 и Е7 будет рассмотрен ниже. Поздний фрагмент генома состоит из генов L1 и L2, кодирующих структурные белки вириона.
Другие геномы
Секвенированием геномов (т.е. определением нуклеотидной последовательности суммарного набора молекул ДНК клетки какого-либо организма), их картированием (т.е. идентификацией генов и локализацией места их расположения на хромосоме) и сравнительным анализом структур геномов разных организмов занимается направление современной молекулярной биологии под названием геномика. Первым полностью секвенированным геномом стал расшифрованный в 1977 г. геном бактериофага ?X174, состоящий всего из 5386 пар нуклеотидов (или пар оснований - п.о.). В дальнейшем были получены нуклеотидные последовательности геномов ряда вирусов. Первыми свободно живущими организмами, чьи геномы были полностью прочитаны, стали микоплазма Micoplasma genitalium и бактерия Haemophilus influenzae . Эти микроорганизмы оказались выбраны, т.к. являются патогенами (т.е. вызывают заболевания) человека. Всего на начальном этапе реализации геномных проектов были изучены 8 разных представителей мира микроорганизмов, а к концу 1998 г. - уже 18 организмов с размерами генома от 1 до 20 Мb (Мb - миллион пар оснований). В их числе представители многих родов бактерий: спирохеты, хламидобактерии, кишечная палочка, возбудители пневмоний, сифилиса, гемофилии, метанобразующие бактерии, микоплазмы, цианобактерии. К настоящему времени определена полная структура геномов более чем 100 микроорганизмов, основную часть которых составляют патогены. Таким образом, уже с первых шагов геномика дала развитие двум своим направлениям: медицинской и сравнительной геномике. Сейчас расшифровка геномов ведется с все возрастающей скоростью. Помимо исследования геномов простых организмов, установлена нуклеотидная последовательность ДНК архебактерии, находящихся в лестнице эволюционного развития как бы между эукариотами (клеточными организмам) и прокариотами (бактериями). Кроме того, определено полное строение генома пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae , первого одноклеточного эукариотического организма). Первым многоклеточным организмом с полностью секвенированным геномом стал круглый червь Caenorhabditis elegans (нематода). Следующими в списке стали плодовая мушка дрозофила (первого насекомое) и арабидопсис (первое растение), чьи ДНК были сравнительно недавно "расшифрованы". Вершиной достижений современной геномики можно назвать определение последовательности нуклеотидов ДНК мыши и человека (см. страницу "Уже сделано" ). Все это позволило перейти от сравнения структуры отдельных генов или их групп к сравнению строения полных геномов организмов, находящихся на разных уровнях эволюционного развития - эволюционной геномике.
Структура генома прокариот
Все, что бактерия умеет делать кодируется ее генетическим аппаратом. То есть восприятие сигналов из внешней среды зависит от того, какие рецепторы находятся на мембране клетки, а рецепторы кодируются бактериальной ДНК. На примере кишечной палочки рассмотрим, как устроен геном бактерии. Геном – это совокупность всей наследственной информации. У кишечной палочки дуцепочечная ДНК замкнута в кольцо. Это кольцевая молекула состоящит из 4,6 млн пар нуклеотидов, что соответствует молекулярной массе 3 х 106 Да. Длина молекулы составляет порядка 1.5 мм. Время репликации этой молекулы 20 мин. Есть бактерии, которые размножаются медленнее, чем кишечная палочка.
Структура бактериальной ДНК как кольцевой была предложена в 1956 году Жакобом и Вольманом. Это было революционное предположение, так как до этого считалась, что ДНК линейная. Но революция во взглядах произошла еще раз, когда выяснилось, что геном бактерии может быть представлен как кольцевой, так и линейной молекулой ДНК. Кроме основной молекулы ДНК у нее могут встречаться (а могут и отсутствовать) плазмиды – небольшие (3-5 тысяч нуклеотидов) кольцевые или линейные ДНК, часто несущие гены устойчивости к антибиотикам и другие необязательные системы. Именно из-за наличия плазмид (а они способны передаваться горизонтально от клетки к клетке, даже между бактериями разных видов), распространение устойчивости к антибиотикам происходит очень быстро между всеми бактериями, живущими в одном месте.
То есть в состав генома бактерий могут входить как кольцевые, так и линейные молекулы ДНК. И геном может состоять из одной или из нескольких молекул ДНК, называемых хромосомами или плазмидами. Если гены, которые содержаться на дополнительной молекуле, необходимы клетке, то эта молекула называется минихромосомой, а если без них клетка может обойтись – то плазмидой.
Размеры молекул ДНК указывают в парах оснований, п.н. или bp (base pairs)
Для больших фрагментов используют т.п.н. или kb (kilo base)=103 bp и Mb (mega base)= 106 bp
Геномы бактерий - от 0.58 Mb у Micoplasma genitalium до 9.5 Mb у Myxococcus xanthus
Как изучали геном бактерии . В середине двадцатого века был описан половой процесс у бактерий. Это процесс, при котором бактерии обмениваются своей генетической информации. На рисунке представлена схема этого процесса. Он называется конъюгацией. Во время конъюгации образуется цитоплазматический мостик, по которому происходит перенос молекулы ДНК из одной клетки в другую. У кишечной палочки имеется молекула ДНК, которая называется F-фактор (fertility factor - фактор плодовитости). Молекула F-фактора способна встроиться в геномную ДНК. В F-факторе кодируется специальный белок, который образует половые ворсинки, они называются F-пили. Эти самые ворсинки прикрепляются к другой клетке, которые F-фактор не содержат, и F-фактор инициирует репликацию. В процессе репликации образуется две копии молекулы ДНК, причем одна копия остается в исходной клетке, а вторая копия переносится в другую клетку. То есть, генетическая информация из одной клетки попадает в другую.
С ДНК, которая попала во вторую клетку происходит следующее. Хозяйская хромосома содержит такие же гены, как и тот кусок ДНК, который был перенесен в клетку. Однако варианты генов в исходной, донорной клетке, и в клетке-реципиенте могут отличаться. Например, в исходной клетке ген кодировал синтез фермента лактазы (расщепляет молочный сахар лактозу), а в рецепиенте такой же ген испорчен, то есть лактазу не кодирует из-за какой-то мутации. При этом бактерия не способна использовать сахар лактозу в среде.
Вновьприбывашая ДНК и хозяйская ДНК обмениваются гомологичными (то есть содержащими одинаковые гены) кусками. Образуется новое сочетание генов в хозяйской клетки. Среди ее старых генов оказывается встроен кусок с новым геном, прибывшим из клетки-донора. Этот процесс обмена кусками ДНК называется рекомбинацией. Та ДНК, которая в процессе рекомбинации оказалась не включенной в хромосому, деградирует и исчезает. Новый ген проявляет себя, клетка оказывается способной расщеплять тот сахар, который раньше использовать не могла. Это все детектируется исследователем. В такой ситуации ген лактазы называют генетическим «маркером», он маркирует участок хромосомы, связанный с определенным свойством бактерии (способностью расщеплять сахар, которую может детектировать исследователь).
Процесс репликации у кишечной палочки продолжается 20 минут, а процесс конъюгации длится 3-5 минут. За это время успевает перейти не вся хромосома, а только ее кусочек. Чем дольше длится конъюгация, тем больший кусочек успевает перейти из одной клетки в другую. Этот процесс позволяет определит какие маркеры поступили в клетку, если исходно клетки различались по нескольким генам. F-фактор способен встраиваться в разные участки хромосомы, и когда начинается передача, разные маркеры попадают в другую клетку. Проводили эксперимент. После конъюгации клетки встряхивали, и мостики между ними разрывались. Это встряхивание проводили через 2, 3, 5 минут, и смотрели, какие маркеры (и, соответственно, какой фрагмент хромосомы) за это время войдут.
По этим данным строили генетическую карту (расположение друг относительно друга генетических маркеров). Генетическая карта кишечной палочки была построена в 60-х годах. На этой карте были гены-маркеры, расположенные по всей кольцевой хромосоме, а координаты генов на карте обозначались в минутах. Итоговая карта, построенная в 60-х годах, имела координаты в промежутке от 0 до 90 минут. Поэтому один известный микробиолог шутил, что кишечная палочка – это удивительный организм, у которой жизнь длится 20 минут, а половой процесс – 90 минут.
Построение такой карты было большим достижением, так как для кишечной палочки она была построена впервые; для других организмов существуют другие методы построения генетических карт, но все они основаны на рекомбинации. В начале 20-ого века были построены рекомбинационные карты для изучения генома мухи, а затем подобные карты
8-09-2015, 19:54