Производство антибиотиков

Содержание

1. Общая характеристика антибиотиков

2. Особенности получения антибиотиков

3. Производство пенициллина

3.1 Технологическая схема производства пенициллина

3.2 Изложение технологического процесса

3.2.1 Подготовка инокулята

3.2.2 Процесс ферментации

3.2.3 Фильтрация

3.2.4 Предварительная обработка нативного раствора

3.2.5 Экстракция и очистка пенициллина

3.2.5 Выделение кристаллических солей пенициллина

3.3 Отходы производства

3.4 Охрана окружающей среды

1. Общая характеристика антибиотиков

Термин «антибиотик» был предложен в 1942 г. С. А. Ваксманом для обозначения веществ, образуемых микроорганизмами и обладающих антимикробным действием. Впоследствии многие исследователи предлагали свои формулировки, вкладывая в них подчас слишком ограниченное содержание либо чрезмерно расширяя это понятие.

В настоящее время под антибиотиками понимают химиотерапевтические вещества, полученные из микроорганизмов или иных природных источников, а также их полусинтетические аналоги и производные, обладающие способностью избирательно подавлять в организме больного возбудителей заболеваний и (или) задерживать развитие злокачественных новообразований.

Антибиотики природного происхождения продуцируются различными группами микроорганизмов (чаще всего актиномицетами, реже бактериями), низшими растениями (дрожжами, водорослями, плесневыми грибами, высшими грибами), высшими растениями и животными организмами.

Например, представители родов Micrococcus, Streptococcus, Diplocoooccus, Chromobacterium, Escherichia, Proteus синтезируют низин, дипломицин, продигиозин, колиформин. Бактерии рода Bacillus образуют грамицидины, субтилин, полимиксины.

Антибиотики, образуемые микроорганизмами, принадлежащими к ряду Actinomycetales, - стрептомицин, тетрациклины, новобиоцин, актиномицины и др.

Антибиотики, образуемые несовершенными грибами: пенициллин - Penic. Chrysogenum; гризеофульвин - Penic. Griseofulnum; трихоцетин - Tricholecium roseum.

Антибиотики, образуемые грибами, относящимися к классам базидиомицетов и аскомицетов: термофиллин, лензитин, хетомин.

Лишайники, водоросли и низшие растения способны образовывать усниновую кислоту и хлореллин, высшие растения – алмицин, рафанин.

Антибиотики животного происхождения: лизоцим, экмолин, круцин, интерферон.

Классификация антибиотиков. По характеру воздействия на бактериальную клетку антибиотики можно разделить на три группы:

- бактериостатические (бактерии живы, но не в состоянии размножаться),

- бактерициды (бактерии умертвляются, но физически продолжают присутствовать в среде),

- бактериолитические (бактерии умертвляются, и бактериальные клеточные стенки разрушаются).

По механизму биологического действия антибиотики делятся:

1. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной стенки (пенициллины, цефалоспорины, бацитрацин, ванкомицин).

2. Антибиотики, нарушающие функционирование цитоплазматической мембраны (полипептиды, полиены, грамицидин).

3. Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, хлормицетины, аминогликозиды, макролиды).

4. Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот:

- ингибиторы синтеза РНК (актиномицин, гризеофульвин, канамицин, неомицин, новобиоцин и др.);

- ингибиторы синтеза ДНК (брунеомицин, саркомицин).

Антибиотики обладают избирательным действием, т.е. активны только в отношении микроорганизмов при сохранении жизнеспособности клеток хозяина и действуют не на все, а на определенные роды и виды микроорганизмов. С избирательностью тесно связано понятие о широте спектра активности антибиотиков. Традиционно по спектру антимикробного воздействия антибиотики делятся на препараты узкого спектра действия и широкого:

1. Антибиотики узкого спектра действия действуют только определенный вид бактерий. К ним относятся пенициллин, оксациллин, эритромицин.

2. Антибиотики с широким спектром действия эффективны в уничтожении не исключительно грамположительных и грамотрицательных бактерий, но также спирохет, лептоспир, риккетсий, крупных вирусов (трахомы, пситтакоза и других). К ним относят группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин, глициклин, метациклин, морфоциклин, доксициклин) и левомицетина.

Выражение величин биологической активности антибиотиков обычно производят в условных единицах, содержащихся в 1 мл раствора (ед/мл) или в 1 мг препарата (ед/мг). За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост стандартного штамма тест-микроба в определенном объеме питательной среды.

Применение антибиотиков. Антибиотики представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Они используются для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. Сейчас существуют сотни лекарственных средств, избирательно действующих на возбудителей различных заболеваний. Сфера антибиотиков - это быстро прогрессирующие инфекции или бактериальное заражение жизненно важных органов, с которыми иммунная система не может справиться сама. Антибиотики незаменимы при остром развитии болезни - ангины и пневмонии, а также при инфекционном воспалении, которое локализуется в закрытых полостях (отит, гайморит, остеомиелит, абсцесс, флегмона).

В настоящее время ведутся активные работы по изысканию антибиотиков нового поколения, эффективных при лечении вирусных и раковых заболеваний.

Антибиотики находят применение в сельском хозяйстве, прежде всего как лечебные препараты в животноводстве, птицеводстве, пчеловодстве и растениеводстве, а отдельные антибиотические вещества - как стимуляторы роста животных.

Некоторые из антибиотиков с успехом применяются в пищевой и консервной промышленности в качестве консервантов скоропортящихся продуктов (свежей рыбы, мяса, сыра, различных овощей).

2. Особенности получения антибиотиков

Процесс получения антибиотика включает в себя следующие основные стадии (рис. 1):

1. получение соответствующего штамма — продуцента антибиотика, пригодного для промышленного производства;

2. биосинтез антибиотика;

3. выделение и очистка антибиотика;

4. концентрирование, стабилизация антибиотика и получение готового продукта.

Первая задача при поиске продуцентов антибиотиков - выделение их из природных источников. Биосинтез антибиотиков - наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый вид (штамм) способен образовывать один или несколько вполне определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ.

Выявление потенциальной возможности образовывать в процессе жизнедеятельности антибиотики связано с условиями культивирования организмов. В одних условиях организм образует антибиотик, в других условиях тот же организм при хорошем росте не будет обладать способностью синтезировать антибиотическое вещество. Образование антибиотиков будет происходить только при развитии организма в специфической среде и при наличии особых внешних условий. Путем изменения условий культивирования можно получить больший или меньший выход антибиотика, или создать условия, при которых антибиотик вообще не будет образовываться. Можно также путем изменения условий культивирования продуцента добиться преимущественного биосинтеза одного из антибиотиков, при условии образования изучаемым организмом нескольких антибиотических веществ, или же получить новые формы антибиотиков, но только в пределах тех соединений, которые способны синтезироваться этим организмом.

К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, относятся состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные условия, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа микроорганизмов и другие факторы.

Среды для культивирования микроорганизмов. Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д.), содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:

- мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике.

- картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;

- среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция, фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким выходом антибиотиков.

Рис. 1 - Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза

Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально.

Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений. При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы.

Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной (реже азотистой) кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза.

Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C/N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.

Источниками минерального питания служат фосфор, сера и другие макро- и микроэлементы.

Продуценты антибиотиков по отношению к концентрации фосфора в среде можно разделить на три группы:

- высокочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора в среде составляет менее 0,01 % (продуценты нистатина, тетрациклинов, флоримицина, ванкомицина);

- продуценты средней чувствительности, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,010–0,015 % (продуценты стрептомицина, эритромицина, циклосерина, неомицина);

- малочувствительные продуценты, для которых оптимальная концентрация фосфора составляет 0,018–0,020 % (продуценты новобиоцина, грамицидина, олеандомицина).

Сера входит в состав некоторых антибиотиков, образуемых грибами (пенициллин, цефалоспорин, глиотоксин и др.), бактериями (бацитрацины, субтилины, низины) и актиномицетами (эхиномицины, группа тиострептона). Обычно источником серы в среде служат сульфаты. Однако при биосинтезе пенициллина лучшим источником серы для продуцента служит тиосульфат натрия.

Кроме того, для биосинтеза антибиотиков необходимы и отдельные микроэлементы. Так, продуцент альбомицина S. subtropicus образует антибиотик при значительной концентрации железа в среде. Железо необходимо для образования хлорамфеникола и других антибиотиков.

Биосинтезу ряда антибиотических веществ (хлорамфеникола, стрептомицина, пенициллина и др.) способствуют ионы цинка.

Стимулирующее влияние на биосинтез гентамицина, курамицина А, фософономицина оказывают ионы кобальта.

Ионы галогенов входят в состав некоторых тетрациклиновых антибиотиков и хлорамфеникола.

Влияние рН среды. Многие бактериальные организмы, синтезирующие антибиотики, лучше развиваются при рН около 7,0, хотя некоторые, например молочнокислые стрептококки, продуцирующие низин, лучше развиваются в среде при рН = 5,5÷6,0.

Большинство актиномицетов хорошо развиваются при начальных значениях рН среды в пределах от 6,7 до 7,8; в большинстве случаев жизнеспособность актиномицетов при рН ниже 4,0–4,5 подавлена.

Температура. Для большинства бактериальных организмов температурный оптимум развития лежит в диапазоне 30–37 °С. Для продуцента грамицидина С оптимальная температура для развития и биосинтеза равна 40 °С.

Актиномицеты, как правило, культивируются при температуре 26–30°С, хотя некоторые виды стрептомицетов могут развиваться как при пониженных (от 0 до 18 °С), так и при повышенных (55–60 °С) температурах.

Для большинства мицелиальных грибов оптимальная температура составляет 25–28 °С.

Аэрация. Большинство изученных продуцентов антибиотиков являются аэробами. Для биосинтеза многих антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и др.) максимальное их накопление происходит при степени аэрации, равной единице, при которой через определенный объем среды за 1 мин продувается такой же объем воздуха.

В процессе развития продуцента антибиотика в промышленных условиях потребность организма в кислороде меняется в зависимости от стадии развития, вязкости культуральной жидкости и других факторов. На определенных стадиях могут возникнуть ситуации, связанные с кислородным голоданием продуцента. В этих условиях следует принимать дополнительные меры, например, повышение концентрации окислителя добавлением пероксида водорода.

Наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов - продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования с использованием периодических процессов. В условиях глубинной культуры процесс развития организма и синтеза антибиотика проходит в две фазы.

В первой фазе развития культуры или, как ее иногда называют, тропофазе (фаза сбалансированного роста микроорганизма), наблюдается интенсивное накопление биомассы продуцента, связанное с быстрым потреблением основных компонентов среды и с высоким уровнем поглощения кислорода.

Во второй фазе развития, именуемой идиофазой (фаза несбалансированного роста микроорганизма), накопление биомассы замедлено или даже уменьшено. В этот период продукты метаболизма микроорганизма лишь частично используются на построение клеточного материала, они в основном направляются на биосинтез антибиотика. Обычно максимум продукции антибиотика в среде наступает после максимума накопления биомассы. Подробное описание технологического процесса на примере производства пенициллина приведено в следующей главе.

3. Производство пенициллина

Пенициллин был открыт в 1929 г. Александром Флемингом и был выделен в кристаллическом виде 1940 году. Установлено, что пенициллин оказывает антимикробное действие в отношении некоторых грамположительных бактерий (стафиллококков, стрептококков, диплококков и некоторых других) и практически неактивен в отношении грамотрицательных видов и дрожжей.

Способность образовывать пенициллин широко распространена среди многих плесневых грибов, относящихся к родам Penicillium и Aspergillus. Однако это свойство более характерно для группы Penicillium notatum-chrysogenum. Первые выделенные из естественных субстратов штаммы как наиболее активные продуценты пенициллина образовывали не более 20 единиц (12 мкг) антибиотика на 1 мл культуральной жидкости. В результате широкой научной работы по селекции новых активных штаммов продуцентов пенициллина получены различные штаммы Penicilliumchrysogenum, которые, в отличие от исходных штаммов, обладают высокой продуктивностью и используются в промышленности. В настоящее время в промышленных условиях получают культуральные жидкости с содержанием пенициллина более 15000 ед/мл, а отдельные штаммы способны синтезировать антибиотик в количестве до 25 тыс. ед/мл.

Под названием «пенициллин» объединена обширная группа веществ, которые являются N-ацильными производными гетероциклической аминокислоты. Из природных пенициллинов применяются бензилпенициллин и феноксиметилпенициллин.

3.1 Технологическая схема производства пенициллина

3.2 Изложение технологического процесса

3.2.1 Подготовка инокулята

Подготовка посевного материала включает следующие стадии:

1) выращивание посевного мицелия 1-й генерации в аппаратах малой емкости (инокуляторах);

2) выращивание посевного мицелия 2-й генерации в аппаратах большой емкости.

Споровая культура, используемая для засева инокулятора, выращивается на пшене в стеклянных флаконах, высушивается и в таком виде хранится при комнатной температуре. Засев производят сухими спорами из 2-3 флаконов.

Основной задачей при культивировании продуцента пенициллина в посевных аппаратах на стадии подготовки инокулята является быстрое получение большой массы мицелия, способного обеспечить при пересеве в ферментер интенсивный рост и высокий выход антибиотика. Для осуществления этой задачи продуцент необходимо выращивать на средах, богатых легкоусвояемыми питательными веществами, в условиях хорошей аэрации, при оптимальной для роста микроорганизма температуре.

В качестве легкоусвояемого углерода выступает глюкоза, сахароза и т.д. В качестве второго источника углерода применяют в небольших количествах лактозу, присутствие которой в среде для выращивания посевного мицелия желательно по следующей причине: ее потребление начинается не сразу, а после некоторого периода адаптации (привыкания), в течение которого происходит образование фермента, расщепляющего лактозу. Посевной мицелий, выращенный на среде, содержащей лактозу, обладает более высокой ферментативной активностью по отношению к трудноусвояемой лактозе и быстрее потребляет ее, что положительно сказывается на ходе ферментации.

Потребность гриба в азоте легко удовлетворяется минеральным азотом - аммонийным или нитратным. Помимо неорганического азота, в состав посевных сред, применяемых в промышленности, входит богатое органическим азотом растительное сырье типа кукурузного экстракта.Растительное сырье характеризуется не только наличием органического азота, оно содержит дополнительный углерод, входящий в состав аминокислот, полипептидов и белков, а также минеральные элементы, витамины и ростовые вещества.

Кроме углерода и азота, для роста микроорганизма необходимы фосфор, сера, магний, калий и микроэлементы – марганец, цинк, железо, медь. Большинство известных посевных сред содержит почти все вышеуказанные элементы, но в различных соотношениях. В таблице 1 приведен пример среды, применяемой для выращивания посевного материала.

Таблица 1 – Состав одной из сред для выращивания посевного материала.

Существенное влияние на рост мицелия оказывает рН среды. Наиболее благоприятное значение рН для роста мицелия лежит между 6,0-6,5. При более кислом или более щелочном рН рост и развитие микроорганизма замедляются.

Выращивание посевного мицелия продолжается 36-50 часов до получения биомассы средней густоты. Мицелий, выращенный в инокуляторах, передается в количестве 10% по объему в посевные аппараты, где культивируется в течение 12-18 часов, а затем передается в большие ферментеры в количестве 15-20%. Процесс выращивания посевного мицелия 1-й и 2-й генерации осуществляется при температуре 24-26°.

Пенициллы - продуценты пенициллина являются типичными аэробами и требуют для своего роста и развития наличия кислорода. Для получения высокопродуктивного посевного мицелия наряду с оптимальной питательной средой необходимо обеспечить и достаточное снабжение гриба. В процессе производства пенициллина выращивание посевного мицелия осуществляют при непрерывном перемешивании и бесперебойной подаче воздуха в аппараты в количестве 1,2-1,5 объема воздуха на 1 объем среды в минуту.

3.2.2 Процесс ферментации

Ферментация является основной стадией в производстве пенициллина, на которой формируется целевой продукт. В промышленности применяется метод глубинной ферментации, при котором культура микроорганизма выращивается в питательной среде, заполняя весь ее объем. У различных штаммов потребность в источниках питания неодинакова. В связи с этим состав сред не является постоянным и универсальным для всех продуцентов, образующих пенициллин, и меняется с появлением новых штаммов.

Ферментационная среда должна быть составлена таким образом, чтобы развивающаяся культура, потребляя питательные вещества и выделяя продукты обмена, сама создавала необходимые условия и осуществляла переход от фазы роста мицелия к фазе пенициллинообразования. Желательно, чтобы вторая фаза была более продолжительной и чтобы процесс ферментации прекращался до наступления автолиза.

Для этого, как и при выращивании посевного материала необходимо одновременное присутствие в среде как легко-, так и трудноусвояемого углевода. Легкоусвояемый углевод обеспечивает быстрый рост и образование обильной биомассы; трудноусвояемый углевод создает условия, благоприятные для биосинтеза антибиотика.

При промышленном биосинтезе пенициллина наибольшее распространение в качестве легкоусвояемого углевода получила глюкоза или гидрол. Трудноусвояемым углеводом является лактоза. Лактоза является единственным углеводом, обеспечивающим полноценное протекание фазы пенициллинообразования. Высокий выход антитибиотика получают только при наличии в среде лактозыв качестве основного источника углевода. Лактоза находится в культуральной жидкости на протяжении всего процесса ферментации, благодаря чему мицелий обеспечен сахаром, биомасса в течение пенициллинообразования медленно растет, и накопление антибиотика достигает максимального уровня.

В состав ферментационных сред входит органический и минеральный азот. Отличным источником органического азота считается кукурузный экстракт, но он может быть с успехом заменен пшеничным экстрактом, различными жмыхами, соевой мукой, глютеном и другим растительным сырьем, богатым азотом.

Источником минерального азота обычно служат нитрат аммония, сернокислый аммоний и некоторые другие соли. При ассимиляции грибом аммонийного азота этих солей освобождаются анионы кислот, которые способствуют некоторому закислению среды.

Исключительно важную роль в обмене веществ клетки играет фосфор, который необходим не только для нормального роста и развития гриба, но и для осуществления самого процесса биосинтеза пенициллина. Для образования пенициллина требуется значительно более высокая концентрация фосфора в среде, чем для роста гриба.

Обязательным компонентом ферментационной среды является сера, входящая в состав важнейших аминокислот и ферментов. Сера необходима


8-09-2015, 20:07