Виробництво бензилпеніциліну

РЕФЕРАТ

Пояснювальна записка до курсової роботи “Виробництво бензилпеніциліну”: 29 с., 7 рис., 1 таблиця, 9 літературних джерел, 2 додатка.

Об’єкт дослідження – технологія отримання бензилпеніциліну шляхом мікробіологічного синтезу.

Мета роботи – аналіз процесу отримання бензилпеніциліну шляхом мікробіологічного синтезу, опис основних стадій технології виробництва антибіотиків.

Метод дослідження – аналіз літературних джерел, графічне проектування.

антибіотики, бензилпеніцилін (пеніцилін G), 6-апк, Penicillium chrisogenum, безперервний метод стерилізації, Кукурудзяний екстракт, фенілоцтова кислота, фенілацетамід, феноксиоцтова кислота, електролітична коагуляція, йонообмінні смоли, ліофілізація.

ЗМІСТ

ВСТУП

1. Основні теоретичні відомості про антибіотики

2. Теорія біосинтезу антибіотиків

3. Технологія біосинтезу бензилпеніциліну

3.1 Характеристика об’єкту біосинтезу

3.2 Характеристика продуцента

3.3 Підготовка посівного матеріалу

3.4 Характеристика поживного середовища

3.5 Стерилізація поживного середовища

3.6 Особливості перебігу процесу ферментації

3.7 Особливості процесу виділення і очистки пеніциліну

3.8 Контроль якості отриманого антибіотика

ВИСНОВКИ

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

ДОДАТКИ

ВСТУП

Одним із ключових відкриттів ХХ століття по праву можна вважати з’ясування противомікробних властивостей пліснявих грибів, зокрема роду Penicillium. Проте історія пошуку препарату, що міг би врятувати людину від багатьох інфекційних захворювань почалась ще задовго до ХХ століття. В 1871 р. В.А. Манасеїним було встановлено, що зелена цвіль Penicillium glaucum знищує бактерії, що потрапляють у культуральне середовище. Ця властивість Penicillium була тоді ж використана лікарем А. Г. Полотебневим, що використовував змочені цієї цвіллю пов'язки для лікування гнійних ран і виразок.

Видатне відкриття російських учених не одержало широкого розповсюдження, і в 1928 р. англієць Олександр Флемінг удруге виявив здатність цвілевого грибка Penicillium пригнічувати ріст мікроорганізмів. Було показано, що загибель мікробів обумовлена невідомою органічною речовиною, названою пеніциліном. Однак виділення пеніциліну в чистому вигляді в той же час не було здійснене, у зв’язку із його термолабільністю, і недосконалістю методів виділення та очищення.

У роки Другої Світової Війни величезна практична потреба в ефективних антибактеріальних препаратах привернула до пеніциліну увагу широкого кола фахівців, і приблизно з 1939 р. почався період інтенсивних досліджень. Завдяки цьому у відносно короткий термін (3 – 5 років) англійцями Х. Флорі й А. Четтеном (1940) були розроблені способи промислового одержання й очищення пеніциліну, вивчені його лікувальні властивості й методи клінічного застосування, а також встановлена його хімічна структура.

Технологія виготовлення антибіотиків на початку своєї історії була дуже примітивною, іноді навіть кустарною. Культивування велося поверхневим способом, технологія очищення була недостатньою щоб отримати препарат високого ступення чистоти. Проте на сьогоднішній день досягнення науки та техніки дозволяють отримувати надзвичайно чисті препарати антибіотиків, зокрема, за рахунок хроматографічних, йонообмінних та мембранних методів очищення. Значний внесок в підвищення якості препаратів принесло впровадження технології напівсинтеничних антибіотиків.

Важливо зазначити, що попри велику кількість створених антибіотиків, тільки невелика кількість знайшла практичне застосування. Пеніцилін, незважаючи на свою майже столітню історію, виготовляється в достатньо великих кількостях і на сьогоднішній день.

1. Основні теоретичні відомості про антибіотики

бензилпеніцилін мікробіологічний антибіотик

Антибіотики – специфічні продукти життєдіяльності різних груп мікроорганізмів, нижчих та вищих рослин і тварин або їх модифікації, що володіють високою фізіологічною активністю по відношенню до певних груп мікроорганізмів або злоякісних пухлин, вибірково затримують їх ріст або пригнічують розвиток.

Утворення антибіотиків – спадково закріплена особливість метаболізму організмів. Це проявляється в тому, що кожний вид (або навіть штам) здатний утворювати один або декілька визначених, строго специфічних для нього антибіотичних речовин. Метаболіти являються проміжними продуктами обміну речовин, результатом катаболічних і анаболічних реакцій, кінцевий продукт обміну – антибіотики – синтезуються із первинних метаболітів. Разом з тим, один вид антибіотиків може синтезуватися декількома видами організмів. Утворення антибіотиків зумовлено визначеним характером обміну речовин, що виник та закріпився в процесі еволюції організму.

Утворення антибіотиків – біологічний фактор, що має адаптаційне значення. Для продуцента здатність до продукції антибіотиків важлива не постійно, а лише в несприятливих умовах, наприклад, у разі нестачі поживних речовин, або у випадку контакту із специфічними продуктами життєдіяльності іншого організму.

Специфічність антибіотиків характеризується:

– високою біологічною активністю по відношенню до чутливих до них організмів, тобто здатність проявляти ефект навіть за низьких концентрацій;

– вибірковістю дії, тобто здатністю конкретного антибіотику проявляти свою дію лише по відношенню до визначених організмів або їх груп, не впливаючи на інші форми живих істот.

Величину біологічної активності антибіотиків виражають в умовних одиницях, що містяться в 1 мл (од/мл) або в 1 мг (од/мг) препарату. За одиницю антибіотичної активності приймають мінімальну кількість антибіотику, що здатна пригнітити або зупинити ріст визначеного числа клітин стандартного штаму тест-організма в одиниці об'єму поживного середовища. За одиницю активності пеніциліну прийнято мінімальну кількість препарату, здатного затримати ріст золотистого стафілококу (штам 209) в 50 мл живильного бульйону.

Пригнічення росту мікроорганізмів антибіотиками може здійснюватися тільки за наявності трьох умов:

– біологічно-важлива для життєдіяльності бактерій система повинна реагувати на дію низьких концентрацій препарату через визначену точку впливу;

– препарати повинні володіти властивістю проникати в бактеріальну клітину і впливати на точку впливу;

– препарат не повинний інактивовуватися раніше, ніж вступить у взаємодію з біологічно активною системою бактерій [1].

Класифікація антибіотиків може проходити за різними критеріями:

1. Класифікація антибіотиків за біологічним походженням:

а) антибіотики, продуковані мікроорганізмами, що належать до еубактерій;

б) антибіотики, продуковані мікроорганізмами, що належать до порядку Actinomycetales;

в) антибіотики, утворені ціанобактеріями;

г) антибіотики, утворені недосконалими грибами;

д) антибіотики, утворені грибами, що належать до класів базидоміцетів і аскоміцетів;

е) антибіотики, утворені лишайниками, водоростями і нижчими рослинами;

є) антибіотики, утворені вищими рослинами;

ж) антибіотики тваринного походження.

2. Класифікація за спектром біологічної дії:

а) протибактеріальні антибіотики вузького спектра дії, активні переважно по відношенню до грампозитивних мікроорганізмів;

б) протибактеріальні антибіотики широкого спектра дії;

в) протитуберкульозні антибіотики;

г) протигрибкові антибіотики;

д) протипухлинні антибіотики.

3. Класифікація антибіотиків за хімічною будовою:

а) антибіотики ациклічної будови;

б) антибіотики аліциклічної будови;

в) тетрацикліни;

г) ароматичні антибіотики;

д) антибіотики-хінони;

е) антибіотики-кисневмісні гетероциклічні сполуки;

є) антибіотики-азотовмісні гетероциклічні сполуки;

ж) антибіотики-аміноглікозиди;

з) металовмісні антибіотики [2].

Тип дії антибіотиків може бути цидним (бактеріоцидним, фунгіцидним, віріоцидним, протозоацидним), під цим розуміється невідворотне порушення життєдіяльності інфекційного агенту, і статичним (бактеріостатичним, фунгістатичним, віріостатичним, протозоастатичним), що спричиняє призупинення життєдіяльності і розмноження збудника.

Антибіотики повинні володіти високою вибірковою токсичністю, тобто вони повинні бути токсичними по відношенню до мікробних клітин і нешкідливими до клітин організму хворого.

Залежно від точки впливу і механізму біологічної дії, антибіотики поділяють на:

1. Специфічні інгібітори біосинтезу клітинної стінки: пеніциліни, цефалоспорини, цефаміцини, ванкоміцин, ристоміцин, циклосерин.

2. Препарати, що порушують молекулярну організацію та функціонування біологічних мембран: поліміксини, полієни.

3. Препарати, що пригнічують синтез білку на рівні рибосом: макроліди, лінкоіцини, аміноглікозиди, тетрацикліни, левоміцетин, фузидин.

4. Інгібітори синтезу РНК на рівні РНК-полімерази та інгібітори, що діють на метаболізм фолієвої кислоти: рифампіцини.

5. Інгібітори синтезу РНК на рівні ДНК-матриці: актиноміцини, антибіотики групи аурелової кислоти.

6. Інгібітори синтезу ДНК на рівні ДНК-матриці: мітоміцин С, антрацикліни [1].

2. Теорія біосинтезу антибіотиків

Промисловий процес виготовлення антибіотиків проходить за наступними етапами:

1. Стадії біосинтезу (утворення) антибіотика. Це основна біологічна стадія складного процесу одержання антибіотичної речовини. Головне завдання на цій стадії – створення оптимальних умов для розвитку продуцента й максимально можливого біосинтезу антибіотика. Висока результативність стадії залежить від рівня біосинтетичної активності продуцента антибіотика, часу його максимального накопичення, складу поживних середовищ для культивування організму, у тому числі вмісту застосовуваних попередників, а також загальних енергетичних витрат на процеси, пов'язані з розвитком продуцента антибіотичної речовини.

2. Стадії попередньої обробки культуральної рідини, клітин (міцелію) мікроорганізму й фільтрації (відділення культуральної рідини від біомаси продуцента). Ефективність стадії багато в чому визначається складом середовища для вирощування продуцента антибіотика, характером його росту, місцем основного нагромадження біологічно активної речовини (у культуральній рідини або всередині клітини).

3. Стадія виділення й очищення антибіотика. На цій стадії, залежно від властивостей антибіотика, його хімічної будови й основного місця нагромадження антибіотичної речовини, застосовують різні методи виділення й очищення. У якості основних методів використовуються екстракція, осадження, сорбція на йонообмінних матеріалах, розпарювання, сушіння.

Особливість цієї технологічної стадії визначається тим, що на першій стадії мають справу з невеликою концентрацією (~1 %) антибіотика в оброблюваному розчині, тоді як на наступних етапах його концентрація збільшується до 20-30 %. Усе це вимагає застосування різних місткостей і об'ємів використовуваних реагентів.

4. Стадії одержання готової продукції, виготовлення лікарських форм, розфасовки. Особливість стадії обумовлюється дуже високим вимогам до якості кінцевого продукту. У випадку випуску антибіотиків, призначених для ін'єкцій, препарати повинні бути стерильними; одержання таких антибіотичних препаратів, готування різних лікарських форм, дозування (розфасовка) і пакування повинні здійснюватися в асептичних умовах. Для максимального виходу антибіотика при культивуванні продуцента використовують комплекс заходів, що включають підбір найбільш сприятливих для цих цілей поживних середовищ, режимів культивування організму. Весь цей комплекс заходів включається в поняття «керований біосинтез».

У промислових умовах керований біосинтез вимагає суворого дотримання технологічного процесу як на стадії підготовки інокуляту, так і на стадії біосинтезу. На стадії підготовки інокуляту особливу увагу звертають на склад середовища, на якому вирощується організм, на вік клітин або міцелію. На стадії біосинтезу, крім складу середовища, велику роль відіграють швидкість споживання тих або інших компонентів, вміст попередників, регуляція процесу аерації культури, підтримка відповідних температури й рН середовища й інших показників режиму культивування.

У сучасних умовах виробництва вживають заходів для максимального зниження собівартості препаратів шляхом інтенсифікації всіх стадій технологічного процесу й, насамперед, підвищенням ефективності першої стадії – біосинтезу антибіотичної речовини.

Для цього необхідно:

а) впровадження у виробництво найбільш високопродуктивних штамів мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків;

б) створення й забезпечення найсприятливіших умов розвитку продуцента антибіотика на відносно дешевих середовищах;

в) широке використання математичних методів планування процесу розвитку організму й електронно-обчислювальної техніки з метою оптимізації й моделювання умов його культивування, що забезпечують максимальний вихід антибіотика;

г) застосування сучасного обладнання на всіх стадіях технологічного процесу з автоматизованими системами, що контролюють основні параметри розвитку організму і стадій біосинтезу антибіотика.

Біотехнологічний процес одержання антибіотиків можна зобразити у вигляді наступної схеми (рис. 1) [2].

Рис. 1. Схема виробництва антибіотиків в процесі мікробіологічного синтезу.

3. Технологія біосинтезу бензилпеніциліну

3.1 Характеристика об’єкту біосинтезу

В 1871 р. В.А. Манасеїним було встановлено, що зелена цвіль Penicillium glaucum знищує бактерії, що потрапляють у культуральне середовище. Ця властивість Penicillium була тоді ж використана лікарем А. Г. Полотебневим, що використовував змочені цієї цвіллю пов'язки для лікування гнійних ран і виразок.

Рис. 2. Структурна формула пеніциліну.

В пеніцилінах R може бути представлений різними структурами. Найбільш відомий і широко використовуваним є бензилпеніцилін, або пеніцилін G, в якому радикал представляє собою бензильний залишок (C₆ H₆ – CH₂ – ), в пеніциліні V радикалом є феноксиметил (C₆ H₆ – О – CH₂ – ) [3].

Спочатку його отримували методом поверхневого культивування. Технологія була досить примітивною – продуцент культивували в колбах або пляшках. Потреба в пеніцилі була дуже велика і об’єм його виробництва, хоч і в примітивних умовах, швидко збільшувався. Для культивування продуцента використовувались навіть пляшки з-під молока, оскільки були в наявності машини для їх миття та обробки. В кожну пляшку наливали поживне середовище шаром 1 – 4 см, що забезпечувало необхідні умови аерації. Пляши поміщали в спеціальні кошики, стерилізували, а потім охолоджували. Сухі спори або їх водну суспензію вносили в пляшки пульверизаторами або піпетками і ферментували протягом 5 – 10 діб за температури 24 °С.

На сьогоднішній день у всьому світі пеніцилін отримують так, як і решту антибіотиків, методом глибинного культивування [4].

Більшість пеніцилінів виготовляють у вигляді натрієвих або калієвих солей. Новокаїнові і бензатинові солі є основою пролонгованих препаратів пеніциліну для внутрішньо-м’язового введення.

В сухій кристалічній формі пеніцилінові солі досить стабільні протягом тривалого терміну за температури 4 °С.

На сьогоднішній день бензилпеніцилін необхідний не тільки як медичний препарат, але і як речовина, що є вихідним продуктом для отримання 6-АПК і в подальшому напівсинтетичних пеніцилінів. Із загальної кількості природних пеніцилінів приблизно 35 % використовуються як медичні препарати, а 65 % – для отримання 6-АПК [1].

3.2 Характеристика продуцента

В якості продуцента широко використовують культури Penicillium chrisogenum, види Penicillium утворюють спори (конідії).

До роду Penicillium входять гіфальні мікроорганізми із септованим міцелієм, що утворює конідіальні китиці на септованих конідієносцях. Конідії одноклітинні, круглі або овальні і переважно зеленого кольору (див. додаток 2).

Рід Penicillium нараховує близько 900 описаних видів, систематика яких значною мірою базується на особливостях формування китиць (одномутовчасті, двохмутовчасті, неправильні). Рід поділяється на підроди: Eupenicillium, Gliocladium, Scopulariopsis, Paecilomyces, Citromyces.

Penicillium chrysogenum належить до секції Asymmetrica, підсекції Asymmetrica-Velutina. Колонії на агаризованому середовищі плоскі, бархатисті. Розвинутий повітряний міцелій. З верхньої сторони колонії синьо-зелені, іноді з краплинами жовтого екссудату, з нижньої – безбарвні або жовтуваті. Конідії від еліптичних (3,3 × 4 мкм) до округлих (4 мкм), часто зібрані в тісні колонки. Конідієносці гладенькі [5].

В розвитку міцелію спостерігається ряд різних фаз. На початку і в середині розвитку міцелію у клітинах накопичуються жири. Згодом їх кількість зменшується, з’являються вакуолі з гранулами рибонуклеополіфосфатів, потім починається автоліз. Інтенсивний синтез пеніциліну починається за наявності великої кількості біомаси міцелію, за повного виснаження глюкози і молочної кислоти в середовищі і за рН, близького до нейтрального.

Під час вивчення пеніциліну встановлено, що серед продуктів його кислотного гідролізу завжди присутня β-диметилцистеїн. Введенням в поживне середовище речовин із міченими атомами C¹⁴ , N¹⁵ , S³² було вивчено механізм біосинтезу пеніциліну.

Прийнято вважати, що бензилпеніцилінова кислота синтезується із L-цистина, фенілоцтової кислоти і диметилпіровиноградної кислоти.

Для отримання пеніциліну спочатку розмножують спори. Їх можна вирощувати на агаризованих середовищах, в складі яких входить 0,5 % меляси, 0,5 % пептону, 0,4 % повареної солі, 0,01 % однозаміщеного фосфату калію і 0,005 % сульфату магнію. Спори вирощують за температури 25 – 27 °С протягом 4 – 5 діб.

В промисловості спори часто отримують, вирощуючи міцелій в скляних флаконах на просяному середовищі. Висушений споровий матеріал можна зберігати навіть за кімнатної температури.

Отриманий споровий матеріал використовують для засіву інокуляторів (1 – 3 флакони на апарат, де міцелій розмножують до кількості 5 – 10 % від об’єму посівних ферментерів) [4].

Промислові штами під час селекції дають невелику кількість варіантів, із яких відбирають найбільш активні і стабільні для подальшого використання. Культури зберігаються в ліофілізованому стані протягом 3 років. Пеніциліни також можуть синтезувати Penicillium notatum, P. brevicompactum, P. nigricans, P. turbatum, P. steckii, P. corylophylum, Aspergillus flavus, A. janus, A. nidulans [5].

3.3 Підготовка посівного матеріалу

Підготовка посівного матеріалу – одна з найвідповідальніших операцій у циклі біотехнологічного способу одержання антибіотиків. Від кількості і якості посівного матеріалу залежить як розвиток культури у ферментері, так і біосинтез антибіотика. Продуцент зазвичай вирощують на багатих по складу натуральних середовищах, здатних забезпечити найвищу фізіологічну активність мікроорганізмів. Підготовка посівного матеріалу – процес багатоступеневий (мал. 3).

Рис. 3. Схема багатоступеневого приготування посівного матеріалу А – вирощування у флаконах, Б – вирощування у колбах на качалках: 1 – законсервований вихідний матеріал; 2 – спорова генерація на скошеному агарі в пробірці; 3 – II спорова генерація на твердому середовищі; 3а і 3б – I і III генерації на рідкому середовищі в колбі; 4 – ферментер попереднього інокулювання; 5 – ферментер інокулювання; 6 – основний ферментер.

Мікроорганізм попередньо вирощують на агаризованому середовищі в пробірці (1, 2), потім із пробірки роблять висів у колби з рідким поживним середовищем, проводять дві генерації методом глибинного вирощування на качалках протягом двох-трьох діб для кожної генерації (3а й 3б). Із другої генерації культури в колбі роблять посів у невеликий (10 л) інокулятор 4, після чого добре розвинену культуру переносять у більший інокулятор 5 (100 – 500 л), звідки й роблять посів в основний ферментер 6. Для посіву в основний ферментер використовують від 5 до 10 % посівного матеріалу (інокуляту) [2].

3.4 Характеристика поживного середовища

Для промислового виробництва антибіотика використовують середовище, що містить кукурудзяний екстракт, гідрол, лактозу і мінеральні солі. Замість кукурудзяного екстракту можуть використовуватися арахісове борошно, вичавки, борошно із бавовняного насіння та інші джерела поживних речовин. Можливість широкого використання продуктів рослинного походження обумовлена тим, що продуцент має сильні протеолітичні ферменти. В якості вуглеводів часто використовують цукрозу або

8-09-2015, 20:11

Страницы: 1 2 3

Виробництво бензилпеніциліну

Разделы сайта