Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................5

СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ...................................................................................5

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ....................................................................7

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ

ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ.......................................................................................19

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...........................................................................................24

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК............................................................................................................24

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ.................................................................................................24

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ......................................................................25

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК......................................................................................26

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl........................................26

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК...................................................27

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ.................................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28

ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК

ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК.....................................................................................28

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК......................................................................29

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ...............................................................................33

СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК...................................................................................................34

СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК........................................................................................34

ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК.............................35

САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ.....................................................................................36

РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................................................38

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ.....................................38

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ......................................................................40

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ..............................................40

АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ..............................................................................41

ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................................46

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................48

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................49

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИГ иммуноглобулины

пн пар нуклеотидов

тпн тысяч пар нуклеотидов

е.а. единица активности

ИПТГ изопропилтиогалактозид

ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-диамин

трис трис(гидроксиметил)аминометан

дНTФ дезоксиаденозинтрифосфат

ддНТФ дидезоксинеклеотидтрифосфат

дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат

рATФ рибоаденозинтрифосфат

ДТТ дитиотрейтол

Na₂ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

SDS додецилсульфат натрия

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-галактозид

ВВЕДЕНИЕ

В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают с появлением хрящевых рыб.

На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.

Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus), представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.

Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110 аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей: g, m, a, d, и e. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких (трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).

Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи (Roitt et al., 1993).

Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C области кодируются разными генами (генными сегментами), физически разнесенными в зародышевой ДНК.

В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента: вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент (от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993).

Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.

Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L) и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (V_L) и одного константного (С_L) домена. Н-цепь состоит из одного V_H и нескольких C_Н доменов.

В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен. На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами, расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит из большого количества V_k генных сегментов, собраных в группы, пяти J_k и одного С_k сегмента.. Такой тип организации называется сегментарным (рис. 2). Лямбда локус состоит из группы V_l сегментов, точное количество которых неизвестно, и семи пар J_l-C_l сегментов. Три из них (JC_l4 - JC_l6) являются псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3' стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12 пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).

л

Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ человека.

Лямбда локус содержит много V_l сегментов и семь пар близкорасположенных J_l-C_l. Три из них яляюся псевдогенами (Y). Каппа локус содержит много V_k пять J_k и один C_k генный сегмент (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей, задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны V_L сегмент и с 5’ стороны J_L сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из V_L сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из J_L сегмента. Это делает возможным соединение V_L и J_L сегментов без нарушения рамки трансляции (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).

Обозначения: - сигнальные олигомеры.

Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной, тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в 0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако установлено, что необходимым условием для него является транскрипция продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом. Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).

В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах, участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al., 1993).

ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ

Хрящевые рыбы.

Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы. Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется (Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали, что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные особенности.

У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры, имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии 12-15 тпн друг от друга (Rast et al., 1994).

Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci) (Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et al., 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J сегменты слиты в зародышевой ДНК.

Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei) (Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al., 1992; Hohman et al., 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн.

Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.

Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет размер 3 - 6 тпн и содержит по одному V_L, J_L и C_L генному


8-09-2015, 20:52