Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CL сегменты разделены примерно 0,5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al., 1994).
В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в зародышевом геноме (Б).
Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma cirratum) (Greenberg et al., 1993) и разнозубой акулы (Rast et al., 1994). В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в кластерах первого типа, примерно 0,5 и 4 тпн соответственно. V и J генные сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и 23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной последовательности составляет около 60%).
Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии:40-50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по последовательности V сегментов (Hohman et al., 1993).
Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества кластеров.
Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие соматического мутагенеза (Rast et al., 1994).
Костистые рыбы.
Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus) показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26, 24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом 3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22 кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26 кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G (Lobb et al.,1984).
Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис. 5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена. Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and Lobb, 1993; Bengten, 1994).
Хотя гены L-цепей сомика имеют низкую гомологию с генами других позвоночных (40-50% по нуклеотидной последовательности), их можно отнести к каппа типу высших позвоночных, так как сходство по первичной структуре с лямбда типом ниже. Кроме того, конфигурация спейсеров имеет характер каппа типа: 12 пн спейсер ассоциирован с V, 23 пн спейсер с J сегментом (Ghaffari and Lobb, 1993).
У радужной форели (Oncorhynchus mykiss), представителя другого семейства костистых рыб, также обнаружены два типа L цепей (Daggfeldt et al., 1993). Один из них (L1) высокогомологичен G типу сомика по структуре V и C областей и соответствующий локус имеет сходную организацию.
По-видимому, у этих видов объединение V и J сегментов происходит только за счет инверсий с восстановлением единой полярности транскрипции. Разнообразие вариабельных доменов образуется в результате комбинативного сочетания V и J сегментов в пределах одного кластера. Не исключается, что в перестройки могут вовлекаться и соседние кластеры.
Интересной особенностью костистых рыб является очень высокая пропорция мРНК, представляющей так называемые стерильные транскрипты (Ghaffari and Lobb, 1993). Эти транскрипты включают в себя только С-сегменты и фланкирующие их 5’и 3’-нетранслируемые участки. Количество стерильных транскриптов у сомика и форели в 5 раз превышает количество полных VJC-транскриптов.
Рис. 5. Геномная организация локуса генов L-цепей ИГ у пещерного сомика.
Генные сегменты организованы в кластеры. Каждый кластер содержит два VL и по одному JL и CL сегменту и имеет размер около 5 тпн. Расстояние между JL и CL около 1000 пн, VL сегменты удалены от 5' конца JL сегмента на 3 тпн. VL сегменты всегда расположены в противоположной транскрипционной полярности по отношению JL и CL сегментам (Ghaffari and Lobb, 1993).
Амфибии.
У шпорцевой лягушки (Xenopus laevis) выявлено три семейства генов L-цепей ИГ, кодирующих три различных изотипа: L1 (ро), L2 (сигма) и L3 (рис. 6).
Все три локуса имеют сегментарный характер организации. L1 локус содержит множественные VL1 сегменты, разделенные в геноме 2.1 - 3.6 тпн, пять JL1 сегментов, три из которых идентичны, и один CL1 генный сегмент (Stewart et al., 1993). JL1 и VL1 сегменты фланкируются каноническими гепта- и нонамерными сигнальными последовательностями, разделенными 12 пн у VL1 и 23 пн у JL1 сегментов (Sakano et al., 1980).
Локус генов второго типа разделяется на два семейства, s1 и s2, которые в геноме располагаются отдельно. Геном лягушки содержит множественные Vs1 и несколько Vs2 геных сегментов, одну пару Js1-Cs1 и пару Js2-Cs2 (Schwager et al., 1991). Расположение генов этого типа друг относительно друга точно не определено.
Недавно был обнаружен третий тип генов L-цепей у лягушки. В геноме лягушки содержится шесть семейств V сегментов этого типа. Общее количество VL3 элементов составляет по меньшей мере 30 копий. Каждый VL3 элемент может рекомбинировать с одной из двух пар JCL3 генных сегментов (Haire et al., 1996).
Гены трех типов значительно различаются: гомология на аминокислотном уровне составляет приблизительно 30% (Zezza et al., 1991). В то же время, ряд признаков позволяет соотнести гены L1 и L3 типа с каппа и лямбда типами млекопитающих.
Семейство генов первого типа можно отнести к каппа типу по нескольким причинам (Zezza et al., 1992): а) высокая гомология первичной структуры (более 50%); б) существенное сходство геномной организации локуса (много VL1 и один CL1 генный сегмент); в) кофигурация спейсеров между гепта- и нонамерыми соответствует каппа типу; г) JL1 и CL1 генные сегменты разделены примерно 3.5 тпн, что приблизительно равно расстоянию между JLk и CLk элементами человека (Sakano et al., 1979; Hieter et al., 1982) и значительно больше чем расстояние между JLl и CLl млекопитающих (Blomberg et al., 1982; Udey, 1987).
Рис. 6. Геномная организация локуса первого и третьего типов генов L-цепей ИГ у шпорцевой лягушки.
Локус семейства L1 содержит множественные VL1 сегменты, пять JL1 сегментов один CL1 генный сегмент. Расстояние между VL1 равно 2.1 - 3.6 тпн. Локус семейства L3 имеет около 30 VL3 сегментов, располагающихся группами, JL3 и CL3 сегменты располагаются парами: JCL31 и JCL32 (Stewart et al., 1993; Haire et al., 1996).
Третий тип генов L-цепей лягушки более близок к лямбда типу млекопитающих: а) более высокая гомология с генами лямбда типа млекопитающих (около 50% с l- и 30-40% с k-типом по аминокислотной последовательности); б) JL3 и CL3 генные сементы экспрессируются всегда парами JL31-CL31 и JL32-CL32, что напоминает ситуацию в лямбда локусе человека и мыши (Haire et al., 1996).
Гены второго типа L-цепей лягушки незначительное и приблизительно одинаковое сходство с генами каппа и лямбда типов млекопитающих (30-40% и 25-40% по нуклеотидной последовательности, соответствено) (Schwager et al., 1991).
Генетическое разнообразие у лягушки достаточно велико и сравнимо с разнообразием генов у млекопитающих. Однако репертуар антительных специфичностей в сыворотке крови значительно уступает репертуару высших позвоночных (Hsu et al., 1991). Этот парадокс можно объяснить наличием механизма соматической селекции клонов В-лимфоцитов, который элиминирует клетки, несущие антитела, специфичные к собственным антигенам организма, а также те клетки, которые продуцируют несколько типов антител (Wilson et al., 1992).
Основной вклад в формирование разнообразия L-цепей антител у лягушки дают первое и третье семейства генов, имеющие высокий комбинативный потенциал и большое разнообразие зародышевых V генных (Haire et al., 1996). Второе семейство имеет несколько слабо отличающихся друг от друга VL2 элементов и не играет существенной роли в формировании разнообразия (Stewart et al., 1993). Таким образом, разнообразие генов L-цепей у лягушки а создается посредством: а) комбинативного соединения V и J генных сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al., 1992).
ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ
Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций (рис. 7).
В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.
1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов, кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al., 1995).
2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).
Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов, что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и структуре кДНК (Litman et al., 1993).
3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов. Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых, увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается размер локуса за счет
Рис. 7. Гипотетическая схема эволюции структурной организации локусов генов L-цепей ИГ позвоночных. (Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).
Обозначения:
- сигнальные
олигомеры,
фланкирующие
V и J сегменты.
резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.
Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem, 1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип “одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.
Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов). По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью (Gilbert, 1990).
У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.
Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис. 8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).
В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих (предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941), очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и амфибиями.
Рис. 8. Эволюционное древо низших позвоночных ( по Северцеву А. Н., 1939).
Обозначения:
- таксоны, имеющие
ныне живущих
представителей,
- таксоны,
существование
которых доказано
палеонтологическими
исследованиями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК
В агарозном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др., 1984).
В полиакриламидном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2 мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10% раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ
Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК (2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).
Адсорбция на кремниевой пудре.
Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300 мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).
Замораживание - оттаивание.
Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при 12000 g в течение 10 мин.
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ
500
нг
8-09-2015, 20:52