Сбор и хранение материала, количественное определение 17 – КС по реакции Циммермана

Сбор и хранение материала, количественное определение 17 – КС по реакции Циммермана

1. Надпочечники

Надпочечники - небольшие парные органы внутренней секреции, расположенные в забрюшинном пространстве над верхними полюсами почек, представляют собой эндокринную железу. Различаются по форме: правый треугольный, а левый в форме – полумесяца. Средний вес одной железы 3,5 – 5 г. Каждый надпочечник состоит из внутреннего мозгового слоя и наружного коркового вещества, каждый из которых является в свою очередь самостоятельной эндокринной железой. Они отличаются друг от друга строением, секрецией различных групп гормонов и происхождением.

Гормоны, продуцируемые в корковом веществе, относятся к кортикостероидам. Сама кора надпочечников морфо–функционально состоит из трех слоев:

клубочковая зона

сетчатая зона

пучковая зона

В клубочковой зоне образуются минералокортикоиды: альдостерон, кортикостерон, дезоксикортикостерон. Они повышают реабсорбцию натрия и выделение калия в почках.

В пучковой зоне образуются глюкокортикоиды: кортизол, кортикостерон.

Глюкокортикоиды оказывают важное действие практически на все процессы обмена веществ. Они стимулируют образование глюкозы из жиров и аминокислот (глюконеогенез), угнетают воспалительные, иммунные и аллергические реакции, уменьшают разрастание соединительной ткани, повышают чувствительность органов чувств и возбудимость нервной системы. В сетчатой зоне производятся половые гормоны – андрогены, являющимися веществами - предшественниками эстрогенов. Их роль: они активны до полового созревания и после созревания половых желез, в том числе влияют на развитие вторичных половых признаков. Клетки мозгового вещества надпочечников вырабатывают катехоламины - адреналин и норадреналин. В состоянии покоя они постоянно выделяют небольшое количество катехоламинов. Под влиянием стрессовой ситуации продукция катехоламинов значительно возрастает. Кроме катехоламинов клетки мозгового слоя надпочечников вырабатывают пептиды, выполняющие регуляторную функцию в ЦНС и ЖКТ. Среди этих веществ: вещество Р, интестинальный вазоактивный пептид, соматостатин, бета – энкефалин.

2. 17 – кетостероиды (17 – КС)

Вызвав биологический эффект, кортикостероиды, подвергаются катаболическим превращениям в печени. При этом происходит окисление боковой цепи, располагающейся в структуре молекулы гормона у 17 – го атома углерода, в результате чего образуются 17 – КС. У женщин 17 – КС имеют надпочечниковое происхождение, у мужчин – 2/3 образуются за счет гормонов коры надпочечников, 1/3 – за счет – стероидов семенников (тестостерона), синтезирующихся в интерстициальных клетках мужских половых желез. Период полураспада тестостерона составляет несколько десятков минут. У взрослых мужчин с мочой экскретируется не более 1% неизмененного тестостерона, что свидетельствует о его распаде в печени до конечных продуктов обмена.

Небольшая часть 17 – КС (около 15%) является метаболитами в реакциях образования глюкокортикоидных гормонов (кортизол, кортизон, 11 –дезоксикортизол). Основную фракцию 17 - КС в моче представляет дегидроэпиандростерон – сульфат и эпиандростерон из надпочечников, а также метаболиты тестостерона (его предшественники и производные – андростендион, андростерон, этиохоланолон, эпиандростерон), образующиеся в яичках. Они выводятся с мочой в качестве продуктов обмена.

Цели исследования 17 – КС в моче:

1.оценка функционального состояния коркового вещества надпочечников

2.диагностика синдрома Кушинга, болезни Аддисона, адреногенитального синдрома, опухоли яичка и яичника.

Подготовка к исследованию : Объяснить пациенту цели исследования. Каких – либо ограничений в диете и режиме питания не требуется, однако пациенту следует избегать чрезмерных физических нагрузок и эмоциональных стрессов во время сбора мочи. Пациенту сообщают, что для анализа используют суточную мочу, и объясняют, как ее собрать. Сотрудники лаборатории и лечащий врач должны знать, принимает ли пациент препараты, которые могут повлиять на результат анализа (в некоторых случаях от их применения необходимо воздержаться).

Процедуры:

Мочу собирают в специальный контейнер в течение 24 часов, при этом первую (утреннюю) порцию мочи сливают, а последнюю сохраняют для анализа. Для поддержания рН 4,0 – 4,5 в контейнер добавляют консервант. Во время всего периода сбора моча хранится в холодильнике на нижней полке. После окончания сбора, тщательно перемешивается, в другой контейнер наливают 100 -200 мл перемешанной мочи и доставляют в лабораторию.

Ход исследования

1.Экстракция. Для экстракции используют несмешивающиеся с водой растворители, в которые переходят экстрагируемые вещества. В целом чем больше в экстрагируемом веществе полярных групп (оксо - , окси - , альдегидных …), тем лучше оно переходит в несмешивающиеся с водой полярные растворители – высшие спирты, этилацетат. Чем меньше полярных групп, тем больше подходят неполярные растворители – гексан, хлороформ. Эфир занимает промежуточное положение. Эффективность экстракции зависит от рН водного раствора и содержания солей. Эффективнее всего экстракция происходит, если первоначально образуется одна фаза, которая затем разделяется на две при добавлении избытка одного из ингредиентов, но такие условия удается подобрать не всегда, значительно чаще просто встряхивают две несмешивающиеся жидкости. Объемы фаз после экстракции очень часто не соответствуют объемам взятых растворов и растворителей, т к вместе с экстрагируемым веществом в другую фазу часто переходит и часть растворителя и наоборот; это очень затрудняет точный отбор аликвоты из какой – либо фазы. Если вещество плохо экстрагируется, часто используют повторную экстракцию тем же растворителем, а затем оба экстракта смешивают. Важно при проведении экстракции следить, чтобы не образовалась стойкая эмульсия, которая мешает разделению фаз. Это зависит от примесей, поэтому нужно встряхивать осторожно, в то же время достаточно энергично, чтобы наступило равновесие. Образованию эмульсии препятствует увеличение образования соли в растворе, эмульсию можно попытаться разделить центрифугированием. Можно проводить экстракцию в делительных воронках, конических колбах или в пробирках с пришлифованными стеклянными или полиэтиленовыми крышками. Если работают с колбами, надо использовать магнитные мешалки. При работе с пробирками их встряхивают вручную или на встряхивателе (шюттель), пробирки удобны тем, что если образуется эмульсия, ее можно разрешить центрифугированием. После экстракции один слой отделяют от другого, обычно значительно легче отсосать верхний слой и количественно перенести его в чистую посуду, чем нижний. Удобно отсасывать пастеровскими пипетками с грушей, перенося верхний слой небольшими порциями, при этом, если по ошибке будет захвачена небольшая порция нижнего слоя, ее легко вернуть на место.

3. Очистка этанола

Абсолютный этанол готовят из 90 – 96 % этилового спирта кипячением с СаО или ВаО на водяной бане с электроподогревом с обратным холодильником до тех пор, пока точка кипения не станет 78,3 С при нормальном барометрическом давлении.

Обнаружение альдегидов: к 5 мл этанола добавляют 0,2 мл раствора калия перманганата, содержащего 200 мг в 1 л (1 : 5000), раствор не должен обесцвечиваться на протяжении 20 минут. Изменение окраски указывает на присутствие альдегидов. Пищевой спирт содержит больше альдегидов, чем гидролизный.

Способы удаления альдегидов:

1. С 2, 4 динитрофинилгидрозином. К 1 л этанола добавить 2 г гидрохлорида 2, 4 динитрофинилгидрозина и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, закрывают пробкой и оставляют стоять 2суток в темноте, затем перегоняют.

2. С нитратом серебра. В 100 мл горячего этанола растворяют 7 г нитрата серебра и добавляют туда 15 г едкого калия, раствор выливают в 4 л подлежащего очистке этанола. Выпадает темный осадок, который постепенно оседает на дно. Через сутки его отделяют фильтрованием, этанол перегоняют, отбрасывают первую и последнюю порции.

3.Очистка хлороформа и дихлорметана.

Для определения гормонов лучше всего использовать хлороформ марки «для наркоза», содержащий небольшое количество спирта, что делает его белее стабильным. Для очистки хлороформа других марок, а также для регенерации тех порций растворителя, которые уже один раз использовались для экстракции гормонов, их взбалтывают с концентрированной серной кислотой на протяжении 1 – 2 рабочих дней, при этом серная кислота темнеет тем скорее, чем белее загрязнен растворитель. Встряхивание проводится в темноте, удобно пользоваться магнитной мешалкой, закрывая колбу светонепроницаемым колпаком. После этого кислоту отсасывают, хлороформ промывают водой, а затем на протяжении нескольких часов концентрированным раствором аммиака, 1 н гидроксидом натрия или насыщенным раствором натрия карбоната, затем опять промывают водой и осушают безводным натрия сульфатом или натрия карбонатом. После осушения растворитель перегоняют, используя стеклянный перегонный аппарат на шлифах, нагреватель – электрический с водяной баней. Конкретный режим очистки зависит от качества исходного растворителя. Об эффективности очистки лучше всего судить, поставив холостой или калибровочный опыт.

4. Очистка эфира

Для удаления перекисей эфир взбалтывают с 10 % раствором сульфида железа (2) в 1 н серной кислоте, затем промывают водой. Проверка наличия перекисей: 200 мл эфира выпаривают, остаток растворяют в 2 мл абсолютного этанола. Из этого количества отбирают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 % спиртового раствора метадинитробензола и 0,2 мл 5 н раствора едкого калия в метаноле. Окраска не должна превышать той, которая развивается при добавлении к тем же реактивам 5 мкг кристаллического кетостероида.

5. Определение содержания 17 – КС в моче по реакции с метадинитробензолом (реакция Циммермана в модификации Креховой).

Принцип метода : количественное установление содержания специфически окрашенных в фиолетовый цвет экстрагированных хромогенов, образующихся в результате реакции17 – КС с метадинитробензолом в щелочной среде.

Реактивы:

1.диэтиловый (медицинский) эфир, свободный от перекисей

2.абсолютный этанол, очищенный от альдегидов и кетонов - см выше

3.концентрированная соляная кислота, 1,19 кг/л

4.ледяная уксусная кислота

5.раствор едкого натра, 100 г/л

6.5 н. раствор едкого калия в метаноле (применяемый в качестве растворителя метанол делает реактив более устойчивым, увеличивая срок его хранения). 28 г едкого калия доводят до 100 мл метанолом, после чего раствор немедленно фильтруют (в спиртовом растворе щелочи образуются желто-окрашенные продукты, которые обусловливают высокие значения абсорбции контрольной пробы). После фильтрования раствор щелочи титруют 0,1 н. соляной кислотой с индикатором метилоранжем. Реактив хранят в темной запарафинированной склянке в холодильнике. Он годен до 1,5 мес.

7.спиртовой раствор метадинитробензола, 20 г/л.

Перед использованием проверить чистоту метадинитробензола: 400 мг реагента растворяют в 20 мл абсолютного этанола, он не должен давать окраски в течение 1 часа после прибавления к нему равного объема 3 н. раствора едкого калия. В противном случае реактив перекристаллизовывают.

Перекристаллизация метадинитробензола: 10 г его препарата растворяют в 375 мл 96 % этанола и нагревают до 40 С. К раствору доливают 50 мл 2 н. едкого натра и смесь оставляют на 5 минут. Затем ее охлаждают и прибавляют к ней при помешивании 1,25 л дистиллированной воды. Раствор фильтруют через воронку Бюхнера и промывают метадинитробензол на фильтре абсолютным этанолом (1 раз – 60 мл и 2 раза – по 40 мл). Кристаллизацию следует осуществлять очень быстро, чтобы образовывались мелкие кристаллы, т. к. большие плохо растворяются в спирте. Полученные мелкие игловидные кристаллы должны иметь указанную температуру плавления. Спиртовой раствор метадинитробензола держат в темной склянке с притертой пробкой 8.метанол 9.хлороформ («для наркоза») 10.раствор формальдегида, 400 г/л (формалин). Раствор разводят в соотношении 1 : 5 дистиллированной водой. 11.стандартныерастворы кетостероидов, получаемые из кристаллических дегидроэпи андростерона и андростерона. Стандартные растворы готовят в концентрации 100 мкг/мл , для чего 5 мг дигидроэпиандростерона или андростерона растворяют в 50 мл абсолютного этанола. Хранят в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой, эталон устойчив в течение нескольких месяцев. Ход определения: включает в себя несколько этапов.

1 этап . Гидролиз мочи. К помещенным в коническую (на 100 мл) колбу 20 мл мочи, взятой из ее суточного количества, прибавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида. Содержимое колбы перемешивают, накрывают ее воронкой и ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. После этого колбу охлаждают под струей холодной водопроводной воды и содержимое ее переносят в делительную воронку.

2 этап . Экстракция и очистка экстракта (осуществляется в делительной воронке). Экстракцию производят диэтиловым эфиром (2 раза по 10 мл) в течение 1 – 1,5 минут. Нижний слой мочи удаляют. Эфирные экстракты объединяют, промывают тремя порциями по 10 мл раствора едкого натра (по 3 минуты). Водную, содержащую эстрогены и другие вещества кислого характера, щелочную фазу убирают и экстракт промывают 1 раз 10 мл дистиллированной воды. Воду тщательно отделяют, эфирный экстракт порциями переносят в центрифужную пробирку и выпаривают на теплой (с температурой не выше 50 С) водяной бане. Сухие экстракты (при формальдегидном способе они должны быть бесцветны) на этом этапе можно оставить до следующего дня в холодильнике.

3 этап. Количественное определение по Циммерману в модификации Креховой.

К сухому остатку приливают 0,2 мл абсолютного этанола, 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют для развития окраски на 1 ч (в темноте!! !) при комнатной температуре. По окончании инкубации добавляют 3 мл водного раствора этанола (500 г/л) и 2 мл хлороформа, смесь энергично встряхивают. Окрашенные в фиолетовый (лиловый) цвет продукты переходят в нижний, хлороформенный слой, а продукты с неспецифической окраской – желто – коричневой или коричневой – остаются в верхнем спиртоводном слое. Через пару минут верхний слой удаляют отсасыванием (пастеровской пипеткой). Делать это нужно аккуратно, тщательно собирая капли водного слоя со стенок пробирки, не засасывать хлороформенный слой.

В хлороформенный слой добавляют 1 мл абсолютного этанола. После перемешивания интенсивность окраски раствора измеряют на фотометре с зеленым (500 – 560нм) светофильтром в кювете на на 5 мм. Результаты сравнивают с аналогичными данными контрольной пробы. Окраска стабильна в течение часа, а затем интенсивность ее снижается: через 1 ч она оказывается слабее уже на 10 – 15%. В связи с этим на одно определение допустимо брать не более 10 – 15 проб.

Приготовление контрольной пробы: в две пробирки прилить по 0,2 мл абсолютного этанола, по 0,2 мл метанольного раствора едкого калия и по 0,2 мл спиртового раствора метадинитробензола. Содержимое пробирки перемешивают и деле обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику. Для получения данных к расчету по формуле параллельно опытным пробам через процедуру анализа пропускают 0,5 мл основного стандартного раствора, содержащего 50 мкг андростерона или дигидроэпиандростерона.

Для получения данных к построению калибровочного графика через все этапы анализа проводят стандартный раствор андростерона (дигдроэпиандростерона) в количестве от 0,1 до 1,0 мл основного раствора. Линейная зависимость сохраняется до концентрации стандартного раствора 100 мкг/мл (100 мг/л). Экскрецию 17 – КС с мочой рассчитывают по формуле:

Х (мг/сут) = А _оп * d * 50 /А _ст * 20 * 1000 = А _оп * d /А _ст * 400

50 – содержание (мкг) андростерона или дигидроэпиандростерона в стандартной пробе

d – диурез (мл/сут)

20 – количество взятой в опыт мочи (мл)

1000 – коэффициент перерасчета, используемый для перевода мкг в мг.

Расчет по калибровочному графику проводится с использованием формулы:

Х = С * d/ 20 * 1000

С – найденное по калибровочному графику содержание 17 – КС в пробе (мкг стандартного вещества андростерона или дегидроэпиандростерона). Для перевода полученного по формуле значения из мг в мкмоль его умножают на коэффициент 3,467.

При больших концентрациях 17 – КС в моче (свыше 100 мкг в пробе) дальнейшее исследование сводится к:

1.использование кюветы на 10 – достигается разведение мочи в 5раз

2.развести мочу физиологическим раствором

В формулу ввести поправку на разведение.

Референтные значения:

Максимальная величина экскреции у мужчин и женщин наблюдается в возрасте25 лет, после чего начинается ее медленное снижение. Выделение 17 – КС выше в часы бодрствования, чем в часы сна. При любых состояниях напряжения экскреция 17 – КС возрастает.

4. Клинико–диагностическое значение определения 17 – КС в моче

1.Выделение 17 – КС с мочой значительно увеличивается при:

1.интерстициально – клеточной опухоли яичка

2.арренобластоме

3.лютеоцитароной опухоли яичника

2. Выделение 17 – КС умеренно увеличивается при:

1.опухоли надпочечников

2.врожденной и приобретенной гиперплазии надпочечников

При раке коры надпочечников уровень 17 – КС в моче возрастает в 2 – 10 раз, достигая иногда 300 мг/сут. Метастазирующая раковая опухоль надпочечников – до 1000 мг /сут.

3.Выделение 17 – КС с мочой снижается при:

1.аддисоновой болезни (составляет не более 1/5 – 1/3 от нормальной величины)

2.диэнцефально – гипофизарной кахексии

3.гипофизарном карликовом росте

4.гипотериозе

5.синдроме остаточных гонад

6.анорхии

7.циррозе печени

8.нефротическом синдроме

9.истощении

Факторы, влияющие на результат исследования:

1.Искажающие результат:

1.несоблюдение требований, предъявляемых к исследованию

2.неправильное хранение контейнера

3.невозможность собрать всю мочу за время исследования

4.несвоевременная отправка мочи в лабораторию

2.Повышающие результат:

1.цефалотин

2.дигитоксин

3.мепробамат

4.напроксен

5.пенециллин

6.фенотиазин

7.АКТГ

8.кортизон ацетат

9.гидрокортизон

3.Понижающие результат:

1.хлордиазепоксид

2.глюкоза

3.меглумин

4.ампициллин

5.дексаметазон

6.эстрогены

7.пероральные контрацептивы

8.преднизолон

Библиография

1.Камышников В.С. «Клинико – биохимическая лабораторная диагностика», том 2, Минск «Интерпрессервис», 2003 г , стр 350 – 366

2.Меньшиков В.В. «Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике», Москва «Медицина», 1987 г , стр 250 – 253

3.Елесеев Ю.Ю. «Анализы. Полный справочник», Москва «Эксмо», 2006 г стр 187 – 190.

4.Земцов В.К. «Диагностика по основным показателям лабораторных исследований», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 15 – 16

5.Баулин С.И. «Справочник медсестры – лаборантки», Ростов – на - Дону, «Феникс», 2008 г, стр 175 – 177

6.Покровский В.М. «Физиология», Москва, «Медицина», 2006г, том 3, стр 234 – 256.