В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин
ПРАКТИКУМ ПО ЭНЗИМОЛОГИИ
Учебно-методическое пособие
ПЕНЗА
2007
Печатается по решению редакционно-издательского совета Пензенского государственного педагогического университета им. В. Г. Белинского
УДК 577.1
Соловьев В. Б. Практикум по энзимологии: учебно-методическое пособие / В. Б. Соловьев, М. Т. Генгин. – Пенза, 2007. – 52 с.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия».
© Соловьев В. Б., 2007
© Генгин М. Т., 2007
© ПГПУ им. В. Г. Белинского, 2007
Введение
Настоящее пособие предназначено для ознакомления студентов как с классическими методами исследования ферментов, так и с современными, высокочувствительными аналитическими методами, использующими ферменты как инструменты исследований. Пособие состоит из пяти разделов:
1. Методы определения активности ферментов.
2. Изучение кинетических параметров ферментативных реакций.
3. Методы выделения и очистки ферментов.
4. Изучение субклеточной локализации ферментов.
5. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов.
Все разделы «Практикума» имеют самостоятельные задачи, однако требования, предъявляемые к студентам, остаются одинаковыми. Каждая предлагаемая работа представляет собой небольшое экспериментальное исследование. При выполнении любой из них студент должен самостоятельно подготовить все нужные растворы, освоить необходимые методы исследования, провести эксперимент и оформить результаты в виде отчета, иллюстрируя полученные данные таблицами и графиками.
Уровень используемых методических приемов соответствует требованиям современной науки. При необходимости в описании работы приводятся краткие теоретические сведения. Все работы, включенные в «Практикум», неоднократно выполнялись студентами.
Все замечания и пожелания будут приняты авторами с благодарностью.
Работа 1. Титрометрическое определение активности каталазы
Оборудование и реактивы: кипящая водяная баня; пипетки на 5, 10, 20 и 25 мл; цилиндры измерительные с носиком на 10 и 25 мл; колба мерная на 100 мл; колбы конические на 200 мл; ступка с пестиком фарфоровые; перманганат калия (0,1 н); серная кислота (10 %); карбонат натрия; пероксид водорода (0,1 н); свежий растительный материал (картофель или морковь).
2 г сырого картофеля (или моркови) растирают в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат натрия до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до объема 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30 минут, после чего ее фильтруют. Далее определяют активность по схеме (2 опытных пробы и 2 контрольных):
| опыт | контроль |
| 20 мл вытяжки фермента | 20 мл вытяжки фермента |
| – | Нагревание 10 мин на кипящей водяной бане |
| 25 мл 0,1 н перекиси водорода | 25 мл 0,1 н перекиси водорода |
| Инкубация 30 минут при комнатной температуре | |
| 5 мл 10 % H2 SO4 | 5 мл 10 % H2 SO4 |
Опыт и контроль титруют 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин бледно-розового окрашивания). Отмечают количество раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося (после ферментативного разложения) пероксида водорода в опытной колбе и на титрование всего пероксида водорода в контрольной. По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.
Расчет ведут в соответствии с уравнением реакции:
5H2 O2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 → 2MnSO4 + K2 SO4 + 5O2 + 8H2 O,
согласно которому 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода.
Пример расчета: из 1,25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл: на титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл, контрольной 30,2 мл 0,1 н раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно (30,2 – 15,5) 14,7 мл 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно (14,7∙1,7) 24,99 мг. Значит, в 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное разложить 
= 99, 96 мг пероксида водорода, а за 1 мин – (99,96:30) 3,33 мг. Так как 1 мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 1 г моркови присутствует (3,33:0,034) 100 Е каталазы.
Содержание отчета
1. Рассчитайте содержание каталазы в исследуемом материале.
2. Напишите систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.
Работа 2. Фотометрическое определение активности трипсина
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, паранитроанилин, 100 мкМ раствор бензоил-аргинин-пара-нитроанилида (БАПНА) в фосфатном буфере *, раствор трипсина (10 мкг/мл) *, 1 н HCl, 0,0025 н HCl, ацетон.
* Приготовление раствора БАПНА. 43,5 мг препарата суспендируют в 1 мл ацетона, после этого прибавляют примерно 80 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,6). Смесь нагревают в водяной бане при температуре 75-80°С до полного растворения препарата, затем доводят объем до 100 мл. Раствор можно хранить в течение месяца в темном месте.
** Приготовление раствора трипсина. 3 мг фермента растворяют в 3 мл 0,0025 н HCl, получается маточный раствор. Рабочий раствор готовят путем стократного разведения маточного раствора дистиллированной водой (500 мкл маточного раствора трипсина помещают в мерную колбу на 50 мл, доводят дистиллированной водой до метки).
1. Для расчета удельной активности препарата фермента строят калибровочный график по пара-нитроанилину (п-НА). Для этого в 11 пробирках готовят растворы п-НА разных концентраций путем смешивания 100 мкМ раствора п-НА и дистиллированной воды по следующей схеме.
| № пробирки | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 |
| 100 мкМ п‑НА, мл | 0 | 0,5 | 1 | 1,5 | 2 | 2,5 | 3 | 3,5 | 4 | 4,5 | 5 |
| Дист. Вода, мл | 5 | 4,5 | 4 | 3,5 | 3 | 2,5 | 2 | 1,5 | 1 | 0,5 | 0 |
В пробах определяют величину оптической плотности на фотоэлектроколориметре КФК-3 (или КФК-2) при 364 нм и строят график зависимости величины оптической плотности от концентрации п-НА.
2. Для определения активности препарата трипсина берут 6 пробирок – 3 опытных и 3 контрольных. Активность фермента определяют по следующей схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37°С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37°С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Реакционную смесь переливают в кюветы и измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п‑НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой.
Содержание отчета
1. Калибровочный график по пара-нитроанилину:
Конц. п-НА |
Опт. плотность |
2. Рассчитайте активность фермента.
3. Напишите рекомендуемое систематическое название данного фермента, его код по систематическому каталогу и опишите его биологическую роль.
Работа 3. Флюориметрическое определение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ*, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR)**, 1 н HCl, хлороформ, печень животного, реактив Фолина, реактивы А и В для метода Лоури.
* Приготовление раствора ФМСФ (25 мМ): 22 мг ФМСФ растворяют в 5 мл дважды перегнанного этилового спирта.
** Приготовление раствора DNS-FLR: К 1 мг DNS-FLRдозатором прибавляют 50 мкл метанола, а затем – 7,5 мл натрий-ацетатного буфера рН=5,6.
200 мг печени гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат хранят на льду. Пробирки каждой параллели (3 опытных и 3 контрольных) помещают, предварительно подписав, в один штатив. Раскапывают реактивы по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37 °С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37 °С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течении 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури (см. примечание 1) Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а = 
Содержание отчета
1. Рассчитайте активность фермента в исследуемом материале.
2. Опишите фермент и его предполагаемую биологическую роль. Напишите предполагаемый систематический код фермента.
Работа 4. Определение кинетических параметров реакции гидролиза трипсином бензоил-аргинин-пара-нитроанилида методами Лайнуйвера-Бэрка и Эйзенталя-Корниш-Боудена. Определение типа ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, растворы БАПНА следующих концентраций: 1 мМ, 0,75 мМ, 0,5 мМ, 0,25 мМ, 0,125 мМ, раствор трипсина (10 мкг/мл), раствор ингибитора трипсина* (10 мкг/мл), 1 н HCl.
* Приготовление раствора ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Рабочий раствор готовят непосредственно перед опытом путем стократного разведения исходного раствора дистиллированной водой.
Для определения Vmax и Км данной реакции, а также типа ингибирования трипсина строят график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата без ингибитора и в присутствии ингибитора (в системах координат Лайнуйвера-Берка и Эйзенталя-Корниш-Боудена). Для каждой концентрации субстрата выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Активность фермента в присутствии ингибитора определяют по схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| 100 мкл раствора ингибитора трипсина (10 мкг/мл) | 100 мкл буфера |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37°С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37°С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости строят на миллиметровой бумаге.
Содержание отчета
1. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Лайнуйвера-Бэрка.
2. Рассчитайте кинетические параметры и определите тип ингибирования способом Эйзенталя и Корниш-Боудена.
Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.
1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами БАПНА с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.
2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:
а) при комнатной температуре;
б) при 4 °С (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);
в) на водяной бане при t=55 °С;
г) на водяной бане при t=75 °С.
Содержание отчета
1. График зависимости активности трипсина от рН среды.
2. График зависимости активности трипсина от температуры.
Работа 6. Определение константы ингибирования трипсина высокомолекулярным ингибитором трипсина из бычьего легкого методом Диксона
Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, 1 мМ раствор БАПНА, раствор трипсина (10 мкг/мл), растворы ингибитора трипсина следующих концентраций:10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1 мкг/мл*, 1 н HCl.
* Приготовление растворов ингибитора: 1 мг ингибитора растворяют в 1 мл 0,0025 н HCl. Получают маточный раствор с концентрацией 1 мг/мл. Рабочие растворы готовят непосредственно перед опытом путем разведения маточного раствора в необходимом соотношении дистиллированной водой.
Определяют активность трипсина при различных концентрациях субстрата и ингибитора. Для каждой концентрации ингибитора выставляют по 4 пробирки: 2 опытных и 2 контрольных. Схема определения активности трипсина.
| опыт | контроль |
| 1,6 мл раствора БАПНА | 1,6 мл раствора БАПНА |
| 100 мкл раствора ингибитора трипсина | 100 мкл буфера |
| – | 0,7 мл 1 н HCl |
| Преинкубация в термостате при 37 °С в течении 10 минут | |
| 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) | 0,5 мл раствора трипсина (10 мкг/мл) |
| Инкубация в термостате при 37 °С в течении 30 минут | |
| 0,7 мл 1 н HCl | – |
Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Графики зависимости обратной скорости от концентрации ингибитора и зависимости s/vот концентрации ингибитора строят на миллиметровой бумаге.
Содержание отчета
1. Определите константу ингибирования методом Диксона.
Работа 7. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс фракционированием сульфатом аммония
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, кристаллический сульфат аммония, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
4 г печени животного гомогенизируют на льду в 20 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Все дальнейшие операции производят на льду. Измеряют объем оставшегося центрифугированного гомогената. Добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 10 % концентрации и тщательно перемешивают. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 4000 об/мин в течении 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают и измеряют объем. К осадку добавляют исходный буфер до полного растворения, затем разводят этим же буфером в 10 раз и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка.
К надосадочной жидкости добавляют кристаллический сульфат аммония до достижения 20 % концентрации, центрифугируют, отделяют осадок, растворяют его в буфере, разводят в два раза буфером и помещают на лед. Повторяют операцию по высаливанию, добавляя сульфат аммония к надосадочной жидкости до достижения 60 % концентрации. Осадок, отделенный центрифугированием ресуспендируют в исходном буфере и разбавляют в десять раз. Во всех фракциях, гомогенате и конечном супернатанте определяют активность по следующей схеме.
| Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
| 150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
| 50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
| – | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
| Преинкубация 8 минут при 37°С | |
| 50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
| Инкубация 30 мин при 37°С | |
| 50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют методом Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ, и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
| Фракция | Гомогенат | 10% | 20% | 30% | 40% | 50% | 60% |
| Активность | |||||||
Степень очистки |
100% |
Работа 8. Частичная очистка ФМСФ-КП из печени крыс методом гель-фильтрации
Оборудование и реактивы: пробирки, автоматическая пипетка, гомогенизатор, стеклянные стаканы на 50 и 100 мл, колонка для гель-фильтрации высотой 15 см, шприц, набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой, гомогенизатор, 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6), спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR), 1 н HCl, хлороформ, сефадекс G‑75,0,9% раствор NaCl, набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Сефадекс G-75 суспендируют в 5-10 кратном объеме дистиллированной воды и оставляют для набухания на 3 часа. Затем перемешивают до однородной массы, дают отстояться. После оседания основной массы геля осторожно декантируют надосадочную жидкость с неосевшими обломками гранул. Суспендирование и последующую декантацию (отмучивание) повторяют 3-4 раза.
Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора NaCl, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию геля. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию геля прибавляют до тех пор, пока его высота
8-09-2015, 22:51