100 мг печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. Центрифугированный гомогенат помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столб раствора NaCl, находящийся над сефадексом. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя, снова дают впитаться. Затем заполняют колонку раствором NaCl, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. С момента нанесения образца на колонку собирают 10 фракций объемом 1 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 7, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
– | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
Преинкубация 8 минут при 37°С | |
50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
Инкубация 30 мин при 37°С | |
50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури.
Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
Активность | |||||||
Степень очистки |
100% |
Работа 9. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на карбоксиметилцеллюлозе)
Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH3,5 и 6,0; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH3,5, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию КМЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию КМЦ прибавляют до тех пор, пока его высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH3,5.
2 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 200 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 3,8 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH3,5, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 0,05 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH6,0. С момента нанесения этого буфера на колонку собирают 10 фракций объемом 3 мл.
Во 2, 3, 4, 5, 6, 9 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
– | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
Преинкубация 8 минут при 37 °С | |
50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
Инкубация 30 мин при 37 °С | |
50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП
Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
Активность | |||||||
Степень очистки |
100 % |
Работа 10. Частичная очистка ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы из печени методом ионообменной хроматографии (на диэтиламиноэтилцеллюлозе)
Оборудование и реактивы: пробирки; автоматическая пипетка; гомогенизатор; стеклянные стаканы на 50 и 100 мл; колонка для ионно-обменной хроматографии высотой 15 см; шприц; набор для определения фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ‑КП): откалиброванная по спирту пипетка на 10 мкл, пипетка на 2 мл, стеклянная воронка, цилиндр на 250 мл с притертой пробкой; гомогенизатор; 50 мМ натрий-ацетатный буфер с 50 мМ NaCl(рН 5,6); 0,05 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH6,0; 1 М натрий-ацетатный буфер, содержащий 0,05 М NaCl, pH3,7; спиртовой раствор ФМСФ, раствор дансил-фен-лей-арг (DNS-FLR); 1 н HCl, хлороформ; диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭЦ); набор растворов для определения белка по Лоури, печень животного.
Колонку для хроматографии закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижний конец пробкой со вставленным фитингом, помещают в основание колонки кружок фильтровальной бумаги, размер которого должен точно соответствовать внутреннему размеру колонки. Заливают примерно 2 мл раствора 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH6,0, дают заполниться фитингу и через воронку по стенке заливают густую суспензию ДЭАЭЦ. Открывают зажим колонки и дают раствору свободно вытекать, следя за тем, чтобы колонка не обсохла. Суспензию ДЭАЭЦ прибавляют до тех пор, пока ее высота в колонке не достигнет нужного уровня, верхняя поверхность геля (стартовая зона) должна быть строго горизонтальной. Затем на поверхность геля помещают кружок фильтровальной бумаги. Колонку промывают (уравновешивают) 20 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH6,0.
4 г печени животного гомогенизируют на льду в 10 мл буфера. Гомогенат центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин для удаления пленок. В пробирку отбирают 100 мкл центрифугированного гомогената и добавляют 4,9 мл буфера. Перешивают и помещают на лед, в дальнейшем используя для определения активности и количества белка в гомогенате.
Открывают зажим колонки и сливают столбик буфера, находящийся над гелем. Когда нижний мениск раствора коснется поверхности кружка фильтровальной бумаги, на колонку осторожно с помощью шприца наносят 1 мл центрифугированного гомогената. Дают образцу впитаться и затем быстро смывают остатки образца со стенок колонки тем же объёмом растворителя. Затем заполняют колонку раствором 0,05 М натрий-ацетатного буфера, содержащего 0,05 М NaCl, pH6,0, закрывают верхней пробкой с иглой и подсоединяют фитингом к сосуду, из которого поступает элюирующий раствор. Для удаления несвязавшихся белков колонку промывают 50 мл буфера.
Затем фермент элюируют 1 М натрий-ацетатным буфером с 0,05 М NaCl, pH3,7. С момента этого буфера на колонку собирают 12 фракций объемом 2 мл.
Во 2, 4, 5, 6, 9, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 фракциях и в разведенном гомогенате измеряют активность ФМСФ-КП по следующей схеме.
Опыт ( – ) | Контроль ( + ) |
150 мкл буфера | 140 мкл буфера |
50 мкл гомогената | 50 мкл гомогената |
– | 10 мкл раствора ФМСФ (добавляют специально откалиброванной стеклянной пипеткой) |
Преинкубация 8 минут при 37°С | |
50 мкл раствора DNS-FLR | 50 мкл раствора DNS-FLR |
Инкубация 30 мин при 37°С | |
50 мкл 1 н HCl | 50 мкл 1 н HCl |
После окончания реакции в каждую пробирку добавляют 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивают штатив в течение 60 сек. Затем пробирки помещают в центрифуги и центрифугируют их 10 мин при 1000 об/мин для разделения фаз. Отбирают хлороформную фракцию и измеряют величину флюоресценции на флюориметре (λех =360 нм, λем =530 нм). Количество белка в пробе определяют по Лоури. Активность ФМСФ-КН рассчитывают как разность флюоресценции проб, не содержащих ФМСФ и проб, содержащих ФМСФ, и выражают в нМ продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка. Формула для расчета активности:
а =
Содержание отчета
1. Определите степень очистки ФМСФ-КП.
Фракция | Гомогенат | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
Активность | |||||||
Степень очистки |
100% |
Фракция | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 | 22 | 24 |
Активность | |||||||
Степень очистки |
Работа 11. Изучение субклеточного распределения ДНКазы (фермента-маркера ядерной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга с охлаждением; ФЭК; гомогенизатор; печень животного; пипетки; ДНК; 0,1 М NaOH; 0,01% раствор крезолового красного; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2 ∙6H2 OрН 5,0 (среда Б); набор растворов для определения белка по Лоури.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по следующей схеме.
Ресуспендирование проводят гомогенизированием полученных осадков в 4-6 мл среды гомогенизации (б), затем полученную суспензию переносят количественно в мерный цилиндр на 20 мл и объем суспензии доводят до 18 мл; таким образом, концентрация субклеточных структур достигает исходной (как в гомогенате) концентрации.
Активность ДНКазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
1 мл раствора ДНК (1 мг/мл) |
1 мл 0,01% раствора крезолового красного |
1 мл буфера А |
Преинкубация 8 минут при 37 °С |
1 мл нагретого раствора фракции |
Смесь быстро переливают в фотометрическую кювету (L=1 см) и измеряют оптическую плотность на ФЭК при 590 нм против буфера А. После измерения смесь немедленно переливают в исходную пробирку и инкубируют 20 мин при 37°С. Измеряют оптическую плотность системы после инкубации. Количество белка определяют по Лоури.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее |
||||||||||||
Аоп – Акн | ||||||||||||
Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
Активность фракции в % от гомогената | 100 % | |||||||||||
Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
Белок в % от белка гомогената | 100 % | |||||||||||
Относительная удельная активность фракций |
Работа 12. Изучение субклеточного распределения кислых протеаз (ферментов-маркеров лизосом) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,01 М фосфатный буфер, содержащий 0,32 М сахарозы, рН 7,55; 100 мМ натрий-ацетатный буфер рН 3,3; 8% раствор гемоглобина; 5% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); тирозин кристаллический; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2 ∙6H2 OрН 5,0 (среда Б).
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность кислых протеаз определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
опыт | контроль |
200 мкл фракции | 200 мкл фракции |
600 мкл NaAc буфера, рН 3,3 | 800 мкл NaAc буфера, рН 3,3 |
Преинкубация 8 минут при 37°С | |
200 мкл 8% раствора гемоглобина | – |
Инкубация 40 минут при 37°С | |
1 мл 5 % ТХУ | 1 мл 5 % ТХУ |
Пробы центрифугируют 30 мин при 4000 об/мин. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и определяют количество образовавшегося тирозина спектрофотометрически при 280 нм. Количество белка в супернатанте определяют спектрофотометрически при 280 нм. Активность фермента определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Готовят рабочий раствор тирозина с концентрацией 100 мкг/мл. Затем производят его разведение в соответствии со схемой.
№ пробирки | Vр-ра тир | Vр-ра воды | Конц, мкг/мл | Dср |
1 | 0,5 | 4,5 | ||
2 | 1 | 4 | ||
3 | 1,5 | 3,5 | ||
4 | 2,0 | 3 | ||
5 | 2,5 | 2,5 | ||
6 | 3,0 | 2,0 | ||
7 | 3,5 | 1,5 | ||
8 | 4,0 | 1,0 | ||
9 | 4,5 | 0,5 | ||
10 | 5,0 | 0,0 |
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее |
||||||||||||
Аоп – Акн | ||||||||||||
Количество тирозина по калибровочной кривой |
||||||||||||
Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
Относительная удельная активность фракций |
Работа 13. Изучение субклеточного распределения сукцинатдегидрогеназы (маркера митохондрий) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; буфер фосфатный 0,067 М (субстратный), рН 7,55; 0,5 М раствор сукцината натрия в субстратном буфере; 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 М трис-буфер рН 7,4 (среда А); 0,32 М р-р сахарозы, содержащий 0,01 μМ MgCl2 ∙6H2 OрН 5,0 (среда Б); 0,02 М раствор феназинметасульфата*; 0,001 М раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ)**.
* Приготовление раствора феназинметасульфата. 12 мг вещества переносят в стеклянную пробирку, добавляют 2 мл дистиллированной воды, закрывают пробкой и перемешивают. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
** Приготовление раствора ДХФИФ. 17 мг вещества растворяют в колбе на 50 мл. РЕАКТИВ ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность сукцинатдегидрогеназы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по одной из следующих схем:
а) кинетическая схема определения активности.
опыт | контроль |
400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере |
– |
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
Смесь быстро перемешивают и немедленно переливают в кювету (l= 1 см), на секундомере отмечают время начала реакции. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм каждые 20 сек в течении 3 мин. Аналогичным образом измеряют снижение оптической плотности в контрольных пробах, не содержащих сукцината. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
опыт | контроль |
400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
200 мкл сукцината натрия на субстратном буфере |
– |
200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
200 мкл 0,001 М ДХФИФ НЕПОСРЕДСТВЕННО ПЕРЕД ОПЫТОМ |
Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
3 мл фракции, НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С | |
1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl |
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
Оптическая плотность, в каждой параллели и среднее |
||||||||||||
Аоп – Акн | ||||||||||||
Количество сукцината | ||||||||||||
Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
Относительная удельная активность фракций |
Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1
8-09-2015, 22:51