Патоморфологическая диагностика висцеральных микозов

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Патоморфологическая диагностика висцеральных микозов

16.00.02 - Патология, онкология и морфология животных

Домницкий Иван Юрьевич

Саратов – 2009

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Грибковые заболевания были известны человечеству во времена глубокой древности, начало их изучения относят к античной эпохе.

Среди большого количества разновидностей микозов особую группу представляют висцеральные микозы. М.А. Спесивцева отнесла к ним кандидоз, актиномикоз, криптококкоз, гистоплазмоз, кокцидиомикоз, мукороз, риноспоридиоз.

Широко распространенным является такое заболевание, как кандидоз, которым болеют животные и люди с поражением слизистых оболочек пищеварительного тракта, кожи и, иногда, с образованием гранулем во внутренних органах.

Грибы рода Candida, по данным Н.А. Бородулиной и Т.А. Быстровой, могут поражать не только взрослых животных, но и молодняк.

Н.А. Спесивцева и П.Н. Кашкин обобщают материалы о кандидозах животных и человека. О.К. Хмельницкий делает глубокий анализ литературного материала и результатов собственных исследований по кандидозу человека.

По информации А.С. Логинова и Н.И.Парфенова кандидоз кишечника на современном этапе относят к его обычной патологии. Кроме клинически выраженного кандидоза, нередко встречается кандидоносительство, а также новая форма кандидоза кишечника, которую описавший ее О.К. Хмельницкий назвал «кандидопатией».

Если лечебные мероприятия при кандидозе не проводятся или помощь оказана несвоевременно, летальность может достигать 85%, причем 50% из них приходится на первую неделю возникновения грибковой инфекции.

Другим важным заболеванием животных и людей является нокардиоз. Он характеризуется гнойным воспалением лимфатических сосудов, молочной железы, органов дыхания, кожи и подкожной клетчатки. У человека чаще поражаются легкие.

Значительную роль в изучении нокардиоза имели исследования Н.М. Берестнева. Он по этиологии и клинической картине различал два заболевания: типичный актиномикоз и нетипичный актиномикоз или нокардиоз, при котором друзы не образуются и лишь иногда наблюдаются хлопья, а в гное нити гриба.

А.И. Абрикосов указал, что патоморфологическая картина при актиномикозе и нокардиозе различна и что это отдельные заболевания.

Сравнительно более изученным патогенным видом является Nocardia asteroides - возбудитель нокардиоза крупного рогатого скота, овец, коз, собак, кошек, сумчатых животных и человека. Реже нокардиоз животных и человека вызывает N. Brasiliensis. В тропиках крупный рогатый скот поражается N. Farcinica, по данным F. I. Awad, и G. Curasson.

Значительный интерес для ветеринарных и медицинских специалистов представляет аспергиллез – респираторное, нередко генерализованное заболевание птиц, других животных и человека, вызываемое грибами рода Aspergillus. Имеют место поражения яиц при инкубации, воздухоносных мешков и легких у птиц.

Аспергиллезные поражения в легких у людей встречаются довольно часто, а летальность составляет от 50% до 87% по сообщениям S. Lin.

Аспергиллез у молодняка сельскохозяйственной птицы (индюшата, утята, цыплята) был изучен B. Hauptman. Развитие птицеводства сформировало устойчивый интерес отечественных ученных: М.А. Артемичев, Н.С. Акулова и многие другие.

Среди широкого спектра грибковых осложнений все чаще стал встречаться мукоромикоз, по данным V.Krcmery достигающий 15% инвазивных микозов на фоне неопластических процессов. Мукоровые грибы вызывают заболевания сельскохозяйственных животных, поражая легкие, мозг и другие органы, вызывая гематурию и микотические аборты у свиней и рогатого скота. Кроме гранулем, постепенно формирующих наружную капсулу, в наиболее острых случаях наблюдались микроабсцессы (SpeareR., BergerL., O, SheaP., 1997).

У больных острым лейкозом людей H. Funada отметил клинико-морфологические проявления легочного мукормикоза, сходные с таковым у животных

Большинство ученых, исследующих мукорозы, считают, что степень их опасности по сравнению с другими глубокими микозами весьма значительна, хотя встречаются они реже.

Нередко в очагах поражений микотического характера обнаруживают несколько видов патогенных грибов, что позволяет говорить о смешанных микозах и, в настоящее время таких заболеваний насчитывается несколько сотен. При этом степень изученности смешанных микотических инфекций до сих пор недостаточно высока, что вызвано, в том числе, не характерными изменениями в сравнении с мономикозами. Исследованиям смешанных микозов следует уделять существенное внимание, в связи с достаточно сложными мерами борьбы с ними.

Необходимо отметить, что смешанные микозы, как и мономикозы, регистрируются и у животных и у людей.

В связи со всем выше перечисленным возникла необходимость в изучении висцеральных микозов, разработки методов дифференциальной диагностики, научно-обоснованной системы ветеринарно-санитарных, профилактических и зоогигиенических мероприятий применительно к конкретному заболеванию с учётом клинико-эпизоотологической обстановки.

Цель работы: выявить особенности клинико-эпизоотологической, патоморфологической диагностики висцеральных микозов животных (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) в Поволжском регионе.

Объект исследований: Спонтанно заболевшие и экспериментально зараженные животные различных видов и возрастных групп.

Предмет исследований: Патоморфологические изменения в органах у животных и птиц при спонтанном и экспериментальном поражении грибами Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia и воздействие грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на хромосомный аппарат подопытных животных

Задачи исследований:

1. Изучить эпизоотологическую ситуацию по висцеральным микозам животных (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) в Поволжском регионе в современных экономических и экологических условиях хозяйствования.

2. Определить клинико-морфологические изменения у разных видов и возрастных групп, спонтанно заболевших животных при висцеральных микозах (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia).

3. Определить клинико-морфологические изменения при висцеральных микозах (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) у животных при экспериментальном заражении.

4. Сформулировать принципы дифференциальной патоморфологической диагностики висцеральных микозов животных (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) в регионах Поволжья в современных экономических и экологических условиях хозяйствования.

5. Изучить возможность мутагенной активности грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia при проведении кариологических исследований.

Научная новизна:

· подробно изучены патоморфологические особенности висцеральных микозов (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) в Поволжском регионе, этиопатогенез;

· изучены клинико-эпизоотологические особенности висцеральных микозов (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) в Поволжском регионе;

· изучена динамика патогистологических изменений в органах и тканях спонтанно заболевших животных разных видов и возрастных групп и их взаимосвязь с основными симптомами при висцеральных микозах;

· изучена динамика патогистологических изменений в органах и тканях экспериментально зараженных животных разных видов и возрастных групп и их взаимосвязь с основными симптомами при висцеральных микозах;

· на микроскопическом уровне выявлена связь между патогномоничными признаками заболеваний и структурными изменениями в органах;

· проведены кариологические исследования при висцеральных микозах (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) у животных;

Теоретическая и практическая значимость. Полученные новые данные по патоморфологическим и клинико-эпизоотологическим особенностям висцеральных микозов в Поволжском регионе, по динамике патогистологических изменений в органах и тканях животных разных видов и возрастных групп и их взаимосвязи с основными симптомами при висцеральных микозах могут быть использованы практическими ветеринарными врачами для постановки более точного диагноза на висцеральные микозы, в учебном процессе при подготовке соответствующих специалистов очной и заочной форм обучения, а так же повышения квалификации ветеринарных врачей и зооинженеров.

Реализация результатов исследований.

Внедрение материалов диссертационной работы осуществлялось

- в диагностической работе ФГУ «Саратовская межобластная ветеринарная лаборатория»;

- в диагностической работе Управления ветеринарии Правительства Саратовской области;

А так же в форме выпуска методических и учебных пособий, карт обратной связи, а именно:

- при издании монографии «Нозологические основы висцеральных микозов» Саратов, 2007 – 242 с. (Рекомендовано Учебно-методическим объединением высших учебных заведений Российской Федерации по образованию в области зоотехнии и ветеринарии в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 110400 – Зоотехния и 111201 – Ветеринария);

- при издании раздела в справочнике ветеринарного врача – Москва, 2006 – 31 с. (Допущено Министерством сельского хозяйства Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальности 111201 – «Ветеринария»);

- в учебных и научных целях на кафедрах анатомии и патанатомии, гистологии, физиологии, патофизиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов животноводства Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Ставропольского ГАУ, Самарской ГСА, Омского ГАУ, Алтайского ГАУ, Уральской ГСХА, Ивановской ГСХА, Ижевской ГСХА, Саратовского ГАУ.

Апробация работы Основные материалы НИР доложены, обсуждены и одобрены на: I Международной научной практической конференции, Витебск, 1996; Ветеринария и зоотехния: Юбилейный сборник научных работ, посвященный 150-летию ИВМиБ, 1999; В сб. проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе, Москва, 1999; Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины, Омск, 2000; научно-практических конференциях ИВМиБ, Саратов 2001-2007; Всероссийской научно-методической конференции патологоанатомов ветеринарной медицины, Уфа, 2003; 2-4 Региональных научно-практических конференциях 2002-2004, Саратов, 2004; Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития. VI Всероссийской научно-практической конференции, Саратов, 2006.; Международной научно-производственной конференции, посвященной 100 – летию со дня рождения профессора Авророва А.А. Воронеж, 2006.; международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях», посвящённой 60-летию ГНУ Краснодарского НИВИ, Краснодар,2006.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», Саратов, 2007; 7-й Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», Саратов, 2007; 16-й Всероссийской научно-практической конференции патологоанатомов, Ставрополь, 2007; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных. Современные технологии переработки сельскохозяйственной продукции», Саратов, 2008; 8-й Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», Саратов, 2008; Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Зыкина Л.Ф.

«Актуальные проблемы ветеринарной патологии сельскохозяйственных животных и птиц», Саратов, 2008; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии и морфологии», посвященной 90-летию факультета(института) ветеринарной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

- особенность эпизоотологии микотической инфекции у животных и птицы и ее связь с эпидемическим процессом;

- характеристика клинико-морфологических особенностей висцеральных микозов (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) спонтанно заболевших и экспериментально зараженных животных и птиц с целью разработки и дачи рекомендаций по диагностике и профилактике висцеральных микозов в хозяйствах;

- оценка критериев клинико-морфологической дифференциальной диагностики висцеральных микозов (Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia) животных и птиц от сходных болезней.

изучение возможного воздействия грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на хромосомный аппарат подопытных животных.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числе 7 из них в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ, в которых изложены основные положения и выводы проведенных исследований, а также в учебных пособиях с грифом Министерства сельского хозяйства и УМО РФ.

Структура и объём диссертации Общий объём диссертации составляет 336 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 147 фотографиями с макро- и микропрепаратов. Список литературы включает 325 работ, в том числе 110 иностранных авторов.

Собственные исследования

Материалы, методы и объемы исследований

Работа выполнялась в период с 1993 - 2008 года в ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И.Вавилова». Исследования проводили с использованием материала, поступавшего из хозяйств Поволжского региона, неблагополучных по висцеральным микозам и от лабораторных животных в ходе экспериментов. Изучали клинико-эпизоотологические данные, характерные для висцеральных микозов, осуществляли отбор проб для гистологических, гистохимических и кариологических исследований.

В ходе работы было подвергнуто патологоанатомическому вскрытию и патоморфологическому исследованию 508 трупов спонтанно заболевших животных различных видов и возрастных групп, а так же 45 кроликов и 114 цыплят экспериментально зараженных.

Для патогистологических исследований проводили полное патологоанатомическое вскрытие по Шору (Жаров А.В. и др., 2000) с подробным протоколированием и извлечением органов. Кусочки тканей и органов немедленно помещали в фиксирующие растворы: жидкость Карнуа, 10% водный нейтральный раствор формалина. С парафиновых блоков на санном микротоме модели 2712 (ReichertWien) получали гистосрезы толщиной 5 – 7 мкм. Из материала, фиксированного 10%-ным водным раствором нейтрального формалина, на замораживающем микротоме модели 2515 (ReichertWien) готовили гистосрезы толщиной 15 мкм. Для обзорных целей гистологические срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином, по Цилю-Нильсену, Грамм-Вейгерту (Пирс Э., 1962; Лилли Р. 1969; Меркулов Г.А. 1969; Дудка И.А., 1982).

Гистохимическими исследованиями выделяли гликоген постановкой ШИК – реакции, липиды Суданом черным В, железо окраской по Перлсу. Кроме того, проводили окраску хроматофильного вещества и ядер нервных клеток по Нисслю. Выполняли гистологическое исследование изготовленных препаратов с подробным протоколированием и фотографированием участков с отклонениями от нормы.

Кроме того, изучали патоморфологические изменения в органах при экспериментальном заражении животных и возможность возникновения изменений в хромосомном аппарате кроликов, под влиянием грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на хромосомный аппарат подопытных животных путем кариологического анализа клеток красного костного мозга, находящихся в стадии метафазы.

В эксперименте было использовано 45 кроликов породы советская шиншилла в возрасте 5 месяцев, отобранных по методу аналогов, учитывая такие показатели, как порода, пол, возраст, масса тела, условия кормления и содержания.

Было проведено четыре опыта по изучению влияния воздействия грибов Aspergillus, Candida, Mucor и Nocardia на животных.

Контролем служили взрослые кролики того же возраста.

Заражение проходило при введении в ушную вену суспензии конидий гриба, выделенных из пораженных органов спонтанно заболевших и павших животных.

Костный мозг получали из трубчатых костей бедра и голени непосредственно перед убоем.

Приготовление препарата для хромосомного анализа осуществляли по методу С.С. Бирбина (1970).

1. В 10 мл раствора Хенкса (без бикарбоната), подогретого до 38°С, содержащего 0,1 мг колхицина, 300 ЕД гепарина, 0,6 мл буферного двухосновного фосфата натрия, вносили 0,5 – 1,0 мл костного мозга, приготавливали суспензию, инкубировали ее 30 – 60 минут при температуре 38°С. Затем центрифугировали 10 минут при 1000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость осторожно удаляли.

2. К полученному осадку добавляли 10 мл 0,9% раствора лимоннокислого натра подогретого до 38°С, осадок собирали пипеткой и помещали в термостат при температуре 2 градуса по Цельсию. Затем пробирки ставили в центрифугу на 15 минут при 1000 оборотах в минуту. Надосадочную жидкость удаляли.

3. К осадку по стенке осторожно добавляли 1,5 – 3,0 мл свежеприготовленного охлажденного до 4°С фиксатора, состоящего из трех частей метанола и одной части ледяной уксусной кислоты. Осадок, не встряхивая, выдерживали в фиксаторе 10 минут, жидкость осторожно удаляли, а осадок суспензировали новой порцией фиксатора. Пробирки помещали в холодильник на 30 – 60 минут, после чего суспензию центрифугировали 3 минуты при 800 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляли, пробирки опрокидывали для лучшего стекания фиксатора. Со стенок пробирок остатки жидкости снимали ватным тампоном.

4. Осадок суспензировали в новой порции фиксатора, центрифугировали 3 минуты при 800 оборотов в минуту и надосадочную жидкость удаляли. Аналогичную манипуляцию повторили дважды.

5. К осадку добавили новую порцию фиксатора, равномерно суспензировали и готовили препараты путем выжигания фиксатора. Для этого на предметное стекло наносили 2 – 3 капли суспензии и после незначительного растекания ее поджигали от пламени спиртовки.

Препараты окрашивали азур - эозином по Нохту.

В рабочий раствор на 100 мл дистиллированной воды добавляли 1 мл буферного раствора двухосновного фосфата натрия (18,814 г фосфата на 100 мл воды). Препараты проводили через ксилол и заключали в канадский бальзам.

Для просмотра метафазных пластинок из делящихся клеток костного мозга использовали малое увеличение микроскопа. Их анализ проводили под иммерсией: учитывали размеры, форму хромосом, расположение центромер, подсчитывали количество хромосом. Всего проанализировано 100 метафазных пластинок от контрольных и подопытных животных.

Для изучения чувствительности цыплят к грибам Candida, выделенным из пораженных органов и фекалий больных кандидозом телят, было поставлено несколько опытов на 114 цыплятах.

Опыт № 1. Заражение культурой Candida albicans, выделенной из пораженного рубца теленка в возрасте 14 дней.

Культуру в виде суспензии выпаивали 2-х дневным цыплятам 1 раз в сутки 5 дней подряд. Часть цыплят убивали через каждые 2 дня.

Опыт № 2. Заражение несколькими штаммами грибов Candida, из которых были: C. albicans, C. krusei, C. parakrusei, C. рseudotropicalis, C. tenuis, выделенные из фекалий телят.

Заражали 5 групп цыплят отдельно каждым штаммом, скармливали зараженный корм в отдельных кормушках, но кормили и содержали в одном месте.

Опыт № 3. Заражение сочетанием грибов Candida albicans и Aspergillus fumigatus, выделенных из пораженного рубца (Candida) и легких (Aspergillus fumigatus) павшего теленка.

Заражали 3 группы цыплят. Одной группе выпаивали суспензию Candida albicans, второй - Aspergillus fumigatus и третьей - сочетание этих двух видов грибов.

При подозрении на кандидоз высевы фекалий делали с помощью шпателя, растирая материал по поверхности пластинчатого агара. Но этот метод не оказался приемлемым при высевах фекалий телят с подозрением на поражение плесневыми грибами. Эти виды грибов обычно быстро покрывают поверхность агара, вследствие чего не представляется возможным исключить загрязнение в момент высева, тем более, если колонии бывают единичными. При подозрении, по результатам бактериоскопии, на смешанный микоз, высевы фекалий мы делали также капельным методом, который позволял не только исключать загрязнение, но и более четко идентифицировать вырастающие колонии грибов. Если рост колоний грибов появлялся на агаре между нанесенными каплями материала, то эти колонии расценивались как загрязнение. Если же колонии грибов появлялись на капле нанесённых фекалий, то они принимались во внимание, а данный гриб расценивался как возбудитель заболевания только при условии, что бактериоскопия фекалий покажет мицелиальные формы гриба.

Для изучения влияния сыворотки молозива коров, содержащей и не содержащей противогрибковые антитела, на возникновение и развитие висцерального кандидоза, получали сыворотку, выдаивая молозиво коров в колбу, куда предварительно насыпали 0,5 г порошка химозина или наливали 1% раствор пепсина из расчета 10 мл на 100 мл молозива. Смесь выдерживали в теплом месте или в термостате при 37°С 6-12 часов. Появившуюся сыворотку отделяли фильтрованием через бумажный фильтр и затем

Страницы: 1 2 3 4 5 6