Этот эксперимент дал, кроме того, один неожиданный результат, который до сих пор полностью не объяснен. Человеческий ген CD4 был введен в мышиные Т-клетки, которые тем самым приобрели способность производить соответствующий белок. Частицы HIV связывались с этими измененными клетками, однако признаков инфекции не было: не образовывался ни синцитий, ни инфекционные вирусные частицы. Это было удивительно, так как мышиные клетки вообще-то способны поддерживать размножение HIV при некоторых условиях. По всей видимости, мышиные клетки не могут быть заражены частицами HIV даже в присутствии рецепторов HIV. К заражению мышиных клеток оказались также неспособны некоторые родственные вирусы. Эти факты позволяют предполагать, что необходим еще какой-то компонент клеточной поверхности для того, чтобы вирус, прикрепившийся к клеточной мембране смог проникнуть внутрь клетки. Природа такого дополнительного фактора пока не ясна.
Связывание вирусного gp120 с клеточным CD4 - это только первый этап проникновения вируса в клетку. Последующие этапы пока менее понятны. Например, как попадает в клетку вирусный генетический материал? Простейшая и наиболее вероятная возможность состоит в том, что оболочка вириона сливается с клеточной мембраной и содержимое вирусной частицы (включая генетический материал) оказывается внутри клетки. Другой возможный путь - эндоцитоз, т.е. образование небольшого впячивания клеточной мембраны, которое затем отпочковывается внутрь, превращаясь в замкнутый мембранный пузырек. Пузырек полностью окружает вирусную частицу и переносит ее внутрь клетки. Там мембрана, образующая пузырек (теперь он называется эндосомой), закисляется. Это приводит к конформационным изменениям, слиянию ее с вирусной мембраной и освобождению содержимого вирусной частицы во внутриклеточное пространство.
Независимо от того, что на самом деле происходит - прямое слияние или эндоцитоз - вирусная мембрана должна претерпеть слияние с клеточной. Как же это осуществляется? Согласно одной из гипотез, представляющейся вполне правдоподобной, связывание gp120 с CD4 вызывает изменение конформации белка gp120, вследствие чего обнажается часть другого белка оболочки, gp41, в норме скрытого под молекулой gp120. Эта область gp41 гидрофобна и потому должна внедряться в мембрану, а не оставаться снаружи, в водной среде, окружающей клетку. Оказавшись открытой, гидрофобная область gp41 взаимодействует с близлежащей частью клеточной мембраны и индуцирует ее слияние с вирусной мембраной. Пока не ясно, нужен ли для связывания с gp41 еще какой-то рецептор клеточной поверхности, помимо CD4, или же gp41 сам внедряется прямо в клеточную мембрану.
После того, как HIV проник в клеточную среду и его генетический материал интегрировался в клеточный геном, он может оставаться неактивным и никак себя не обнаруживать, а может и проявиться одним из трех способов.
Во-первых, вирусный геном может вызвать персистирующую инфекцию; при этом образуется некоторое количество вирусных частиц, но клеток погибает немного. Во-вторых, инфекция может привести к образованию синцития, который вскоре гибнет. Появление синцитиев - главный результат воздействия HIV на культуру клеток. В организме зараженного человека синцитии иногда можно наблюдать на поздних стадиях инфекции *особенно в мозге). Неясно, однако, играют ли они какую-то роль в раннем патогенезе СПИДа.
Третий вероятный результат заражения HIV - быстрая гибель клеток без образования синцитиев. Каким образом HIV убивает клетки пока не ясно. Возможно, какие-то из продуктов, кодируемых генами HIV, обладают прямым токсическим действием. Возможно, также разрушение клеточной мембранной системы из-за того, что внедрившийся в нее gp120, синтезированный в результате инфекции, взаимодействует с имеющимся в мембране CD4. Судьба зараженной клетки зависит и от иммунного ответа, поскольку иммунная система способна узнавать вирусные белки на поверхности зараженных клеток и убивать эти клетки.
Распределение зараженных HIV клеток в организме обусловлено главным образом тем, как распределены клетки, несущие CD4. Изначально этот антиген был идентифицирован по его присутствию на определенных Т-лимфоцитах. И действительно, его нормальные функции, по-видимому, в основном связаны со сложной сетью взаимодействий между клетками иммунной системы.
Т-лимфоциты, несущие CD4, способны взаимодействовать с клетками, представляющими антигены. Эти последние находят чужеродные антигены и экспонируют их на своей клеточной мембране вместе со специфическими белками - гликопротеинами MHC класса II (от англ. Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Когда Т4-хелперы узнают комбинацию антигена и гликопротеина MHC класса II, они инициируют иммунный ответ против чужеродных или зараженных клеток, несущих этот антиген. Считается, что взаимодействие между антигенами CD4 на Т-клетках и гликопротеинами MHC класса II на клетках, представляющих антиген, важный элемент контакта этих клеток.
Как сейчас известно, Т-лимфоциты не единственные клетки со встроенным в мембрану антигеном CD4. Не менее 40% моноцитов периферической крови (эти клетки являются предшественниками макрофагов - клеток-“мусорщиков”) и некоторые клетки, представляющие антиген в лимфатических узлах, коже и других органах, а также примерно 5% всех В-клеток организма (эти клетки производят антитела) несут CD4 и могут быть заражены HIV.
Но некоторые виды клеток заражаются HIV в культуре, а прямо выделить в них CD4 не удается. К ним относятся глиальные клетки головного мозга, клетки ряда злокачественных опухолей мозга, а также определенные линии клеток из раковых опухолей кишечника. Однако, хотя эти клетки и не производят CD4 в экспериментально определимых количествах, они содержат немного информационной РНК, кодирующей белок CD4, а значит, способны синтезировать и сам CD4. По-видимому, для заражения HIV достаточно даже очень малого количества CD4.
4. Препараты, противостоящие СПИДу
Всякое терапевтическое средство против инфекции независимо от природы патогена - будь то вирус, бактерия, грибок или простейшее - должно либо вызывать гибель патогена, либо прекращать его размножение. При этом препарат не должен причинять существенного вреда зараженному организму. Как правило, такие лекарства выполняют свою задачу, действуя на биохимические процессы, характерные только для патогена. В случае бактерий это достигается сравнительно просто, так как по структуре и метаболизму клетки бактерий и клетки организма млекопитающего сильно различаются. Например, пенициллин нарушает синтез клеточной стенки бактерий, а на клетки млекопитающих, у которых нет такой стенки, он не действует.
С вирусами ситуация гораздо сложнее. Вирусы представляют собой просто генетический материал, одетый в оболочку из гликопротеинов и липидов. Они не способны размножаться самостоятельно и вместо этого заражают клетки другого организма и узурпируют их аппарат биосинтеза, который и обеспечивает воспроизведение вируса. Когда происходит активная репликация вируса, часто бывает трудно различить вирусные белки, взаимодействующие с клеткой и белки самой клетки. Тесная связь многих этапов жизненного цикла вируса с метаболизмом клетки-хозяина затрудняет создание препаратов, которые избирательно подавляют репликацию вируса и в тоже время минимально воздействуют на клетку.
Существенно также, что практически любой препарат (в том числе и пенициллин) обладает в той или иной степени побочным действием и токсичностью. Поэтому всегда необходимо учитывать не только эффект воздействия на патоген, но и вред, причиняемый организму человека. Важнейшей характеристикой потенциального терапевтического препарата является его “терапевтический индекс”: отношение токсичной дозы к эффективной дозе. Однако в случае болезней , представляющих угрозу для жизни, таких как СПИД, допустимо использовать и препараты со сравнительно низкими значениями терапевтического индекса по меньшей мере, пока не созданы более совершенные.
Сложный жизненный цикл позволяет HIV заражать клетки иммунной системы и ускользать от их действия. Но для борьбы с инфекцией такая сложность может быть не только бедствием, но и благом, поскольку она предоставляет много возможностей для воздействия противовирусных средств.
Первая стадия - связывание вируса с клеткой (см. выше). Существует несколько возможностей подавлять этот процесс. Можно получить антитела, которые взаимодействуют с соответствующей частью оболочки вируса и тем самым нейтрализуют способность gp120 связываться с CD4. Можно соединить такие антитела с молекулами какого-либо токсина, тогда они, связываясь с зараженными клетками, например с макрофагами, содержащими вирус и производящими его белки, будут убивать их. Можно получить и антитела к CD4, но этот подход потенциально опасен, потому что такие антитела будут атаковать и здоровые клетки иммунной системы организма. Поэтому исследования направлены главным образом на получение антител к gp120.
Получить эффективные антитела, нейтрализующие gp120, по ряду причин трудно. Не все антитела против gp120 будут блокировать ключевой участок связывания с CD4. У больных, в организме которых в процессе нормальной реакции на инфекцию HIV образуются нейтрализующие антитела (обычно лишь в малом количестве), СПИД тем не менее развивается. Определенного разрешения этой проблемы пока нет. Возможно одна из причин - высокая скорость мутирования HIV. У некоторых возникающих в организме вариантов вируса может быть изменен гликопротеин оболочки, и он не будет нейтрализовываться имеющимися антителами. Вторая возможная причина заключается в том, что молекулы сахаров. Входящие в состав гликопротеина оболочки HIV, сходны с аналогичными структурами на поверхности клеток человека, поэтому на оболочке вируса недостаточно уникальных участков, которые будут распознаваться иммунной системой как “чужие” и с которыми могли бы связываться антитела. В-третьих, в молекулах gp120 участок связывания CD4 расположен в углублении и потому мало доступен. Наконец, не исключено, что важные для связывания участки gp120 открыты только в момент связывания, а большую часть времени недоступны для иммунной системы.
Чтобы преодолеть эти трудности применяется несколько подходов. Один состоит в получении моноклональных антител. Для этого нужно идентифицировать антитела, которые действительно связываются с ключевым участком вирусного белка, клонировать производящие их лимфоциты и выращивать эти клетки in vitro.
Второй подход использует антиидиотипические антитела, т.е. “антитела против идиотипа”; в данном случае это антитела против антител к CD4. Идея заключается в том, что молекула моноклонального тела против CD4 по структуре может имитировать участок связывания CD4 в молекуле gp120, и поэтому антитело (антиидиотип) к этому участку должно связываться с gp120.
Третий подход заключается в создании растворимой, т.е. не связанной с клетками формы CD4, которая способна взаимодействовать с HIV, занимая его участки связывания и тем самым препятствуя его связыванию с CD4 на поверхности Т4-хелперов. В настоящее время растворимый CD4 был получен методами генной инженерии. Этот препарат действительно блокирует участки связывания CD4 на оболочке HIV и подавляет заражение Т-клеток. Вероятно, вирусу трудно будет измениться таким образом, чтобы потерять сродство к CD4, сохраняя при этом способность заражать другие клетки.
В будущем, возможно, удастся создать “химерные” молекулы, в которых объединятся участок молекулы CD4, взаимодействующий с HIV, и константная часть молекулы иммуноглобулина человека. Такие антитела “на заказ” должны обладать рядом преимуществ. Определенные участки тяжелых цепей иммуноглобулина способны активировать другие компоненты иммунной системы, приводя к разрушению вируса. Химерная молекула действовала бы подобно полицейскому с ищейкой: часть CD4 будет выслеживать вирус, а часть иммуноглобулина - вызывать подмогу для нападения. Кроме того, химерные молекулы могут дольше находиться в кровяном русле, чем просто растворимый CD4, потому что определенные иммуноглобулины обладают большим временем жизни в кровотоке.
В основе рассмотренных подходов лежит использование сложных биологических молекул, которые связываются с поверхностным гликопротеином вируса. Однако сходным образом могут действовать и другие молекулы. Было показано, что некоторые крупные отрицательно заряженные соединения, содержащие сульфатные группы, подавляют репликацию HIV. Прототипом может послужить декстрансульфат, молекулы которого с молекулярной массой в пределах 7000 - 8000 дальтон подавляют репликацию HIV in vitro. Один из механизмов действия декстрансульфата, вероятно, является подавление связывания вируса. Установлено также, что это соединение in vitro мешает образованию синцитиев, чего вполне можно ожидать для агента, блокирующего связывание вируса. Однако, токсичные и эффективные дозы этого препарата пока недостаточно изучены.
Когда HIV связался с клеткой, вирусная мембрана сливается с клеточной мембраной, и содержимое вириона попадает в цитоплазму. Здесь его сердцевинные белки частично удаляются, обнажая РНК. Антитела к gp41 могли бы предотвращать проникновение вируса в клетку. Возможны также реагента, препятствующие процессу “раздевания” РНК.
Однако в качестве мишени для воздействия на вирус наибольшее внимание привлек к себе следующий этап жизненного цикла вируса - синтез вирусной ДНК обратной транскриптазой. Здесь видятся особые преимущества, поскольку этот этап характерен только для ретро вирусов и не имеет отношения к клетке-хозяину. В поисках средств против ретровирусов с самого начала уделялось первостепенное внимание этой задаче. В частности исследовались соединения, называемые дидезоксинуклеозидами, которые являются ингибиторами обратной транскриптазы. Это аналоги нуклеозидов, т.е. по структуре они очень близки к нуклеотидам, служащим мономерами ДНК и РНК.
Одно из таких соединений - 3`-азидо-2`,3`- дидезокситимидин, или азидотимидин. Он был синтезирован в 1964 г. и первоначально предназначался в качестве противоракового препарата. В 1985 г. было обнаружено, что он является мощным ингибитором размножения HIV в культуре Т-лимфоцитов в концентрациях 1 - 5 мкМ (0,25 - 1,25 мкг/мл). При этом не наблюдалось заметной токсичности азидотимидина при концентрациях 20 - 50 мкМ или менее. Вскоре было показано, что азидотимидин эффективно действует у больных СПИДом при концентрации в организме 1 - 5 мкМ, как и предсказывалось на основании исследования в культуре Т-клеток.
Каким образом это соединение защищает клетки от HIV? Суть состоит в том, что оно близко по структуре к нуклеозиду тимидину, входящему в состав ДНК. В клетке азидотимидин подвергается ферментативному фосфорилированию: к нему присоединяется цепочка из трех фосфатных групп. Азидотимидин трифосфат и есть активная форма препарата. (Вводить в организм непосредственно азидотимидинтрифосфат нельзя, так как клетки не способны его поглощать.) Азидотимидинтрифосфат является аналогом тимидинтрифосфата - одного из мономеров ДНК. По-видимому, механизм подавления синтеза вирусной ДНК двоякий: конкурентное ингибирование и терминация синтеза цепи ДНК.
Конкурентное ингибирование состоит в том, что азидотимидинтрифосфат связывается с обратной транскриптазой в том участке, который в норме связывает обычные нуклеозидтрифосфаты. При терминации синтеза цепи ДНК обратная транскриптаза ошибочно включает азидотимидинтрифосфат в растущую цепь вирусной ДНК вместо тимидинтрифосфата, но присоединение следующего нуклеотида невозможно, потому что в молекуле азидотимидинтрифосфата нет гидроксильной группы, которая необходима для образования связи со следующим нуклеотидом. Вирус не в состоянии исправить эту ошибку и синтез дек прекращается.
Другие дидезоксинуклеозиды, обладающие активностью против HIV, действуют, по-видимому, таким же образом. Все эти соединения оказались эффективными против ряда ретровирусов (собственно всех, которые изучались на этот предмет), но только в форме трифосфатов. Поэтому их эффективность как терапевтических средств определяется тем, насколько легко они проникают в клетки и фосфорилируются клеточными ферментами, называемыми киназами. Например, фосфорилирование одних дидезоксинуклеозидов происходит лучше, чем других. Так 2`,3` - дидезокситимидин, который отличается от азидотимидина тем, что вместо азидогруппы (N3) имеется атом водорода, в клетках человека плохо фосфорилируется и поэтому менее эффективен против HIV, чем азидотимидин. Кроме того, процесс фосфорилирования этих соединений различается у разных видов, так что модели на животных могут быть неадекватными для предсказания эффективности конкретного дидезоксинуклеотида в организме человека.
Очень важно, может ли обратная транскриптаза вируса измениться в результате мутаций таким образом, что больше не будет ингибироваться азидотимидином. Это вопрос вовсе не праздный. Азидотимидин эффективен постольку, поскольку обратная транскриптаза HIV предпочитает азидотимидинтрифосфат тимидинтрифосфату, связывает его и включает в ДНК, в то время как ДНК-полимеразы клеток млекопитающих не обладают таким сродством к азидотимидинтрифосфату, синтез клеточной ДНК не нарушается и клетка продолжает успешно функционировать. Не исключено, что обратная транскриптаза могла бы утратить предпочтение к азидотимидинтрифосфату.
После того как на вирусной РНК синтезировалась цепь ДНК, начинается вторая стадия процесса обратной транскрипции - синтез второй нити ДНК, комплементарной первой. На этом этапе также возможно действие лекарственных препаратов. Например, можно попытаться нарушить работу вирусного фермента РНКазы Н, являющегося частью обратной транскриптазы; РНКаза Н, после того как синтезирована первая нить ДНК, расщепляет вирусную РНК, освобождая тем самым место для образования второй нити. Возможно, удастся блокировать и другую часть фермента - интегразу, которая, как полагают, разрезает ДНК клетки-хозяина и вставляет в разрыв ДНК вируса.
Следующее потенциально уязвимое место в цикле HIV появляется несколько позже, когда активируется клетка-хозяин. Клетка может начать синтезировать новые белки а также делиться. Тот же процесс, который активирует клетку, может инициировать транскрипцию провируса и трансляцию с образованием вирусных белков. Существует возможность нарушить этот процесс, используя “антисмысловые олигонуклеотиды”. Суть этой идеи заключается в следующем. Нужно получить олигонуклеотиды (короткие последовательности нуклеотидов), комплементарные части вирусной мРНК; мРНК - это смысловая последовательность, поскольку она непосредственно кодирует белок, а олигонуклеотиды называются антисмысловыми, потому что они комплементарны мРНК. Эти нуклеотиды способны связываться с вирусной мРНК; происходят, как говорят, молекулярная гибридизация: образуется дуплекс, т.е. двухцепочечный участок молекулы, который, вероятно, препятствует движению рибосом клетки вдоль вирусных мРНК и тем самым блокирует синтез вирусных белков. Такой механизм называется гибридизационным блоком трансляции.
В качестве лекарства олигонуклеотиды плохи тем,
8-09-2015, 21:43