Экспериментальные модели бактериального менингита демонстрируют существенное нарушение динамики цереброспинальной жидкости и изменение церебрального кровотока в результате развившегося воспаления. Возникающие нарушения проходимости капилляров в субарахноидальном пространстве приводят к снижению резорбции цереброспинальной жидкости, результатом же является повышение внутричерепного давления, падение церебральной перфузии и ауторегуляции. Эти нарушения приводят к стойким неврологическим нарушениям или к жизнеугрожающим ситуациям.
Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов
Показания к лабораторному исследованию
Лабораторная диагностика гнойных бактериальных менингитов осуществляется бактериологическим методом путем выделения и идентификации возбудителя, серологическим путем выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор, кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови. Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют больных с клинически выраженной формой заболевания, стертой формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и менингиты иной этиологии. По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в контакте с больными менингококковой инфекцией.
Бактериологическому обследованию подлежат:
а) в детских учреждениях - дети, бывшие в общении с больными, и обслуживающий персонал всего учреждения;
б) в школах - учащиеся и преподаватели класса, где зарегистрирован больной;
в) в школах-интернатах (круглосуточное пребывание детей) - учащиеся, общавшиеся с больным в классе и в спальной комнате, а также преподаватели и воспитатели данного класса;
г) в семьях, квартирах - все лица, общавшиеся с больными;
д) в ВУЗах, средних учебных заведениях, ПТУ, спецучилищах, колледжах при возникновении случая заболевания на первом курсе - преподаватели и студенты всего курса; на старших курсах - только общавшиеся с больным в учебной группе и комнате общежития;
е) в других организованных коллективах - лица, проживающие в общежитии.
В детских дошкольных учреждениях бактериологические обследования контактных проводятся не менее двух раз с интервалом в 3-7 дней, в остальных коллективах - однократно.
Носители менингококков, выявленные при бактериологическом обследовании в детских дошкольных коллективах, школах-интернатах и др. детских учреждениях выводятся из коллектива на срок проведения санации. Из коллектива взрослых, в том числе учебных заведений, носители не изолируются.
Носители менингококков - дети и взрослые, выявленные в семейных очагах, в детские дошкольные учреждения, школы, школы-интернаты, санатории, оздоровительные лагеря и др. детские учреждения не допускаются. Бактериологическое обследование коллективов, которые посещали эти носители, не проводится.
При выявлении носителя менингококков среди больных соматических стационаров, его следует изолировать в бокс или полубокс. Вопрос о санации решается в зависимости от основного заболевания. При отсутствии возможности изоляции носителя курс санации проводится обязательно. Персонал отделения подвергается однократному бактериологическому обследованию, выявленные носители отстраняются от работы на время проведения санации.
Выявленные носители менингококков санируются на дому или в специально развернутых для этих целей отделениях: взрослые - ампициллином или левомицетином по 0,5 * 4 раза в день в течение 4-х дней. Детям эти препараты назначают по той же схеме в возрастных дозировках. Для санации носителей в закрытых коллективах взрослых рекомендуется рифампицин по 0,3 через 12 часов в течение 2-х дней.
Через 3 дня после окончания курса санации носители, независимо от примененного препарата, подвергаются однократному бактериологическому обследованию и при наличии одного отрицательного бактериологического анализа они допускаются в коллективы.
При длительном носительстве (свыше 1 месяца) и отсутствии воспалительных изменений в носоглотке носитель допускается в коллектив, где он был выявлен.
Микробиологическая диагностика гнойных бактериальных менингитов
В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми этиологическими факторами гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) могут быть пневмококки, а у детей младшего возраста Hemophilus influencae и др. возбудители, представляется целесообразным изложение основных дифференциально-диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов.
Идентификация вида N.meningitidis основана на комплексе морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических признаков.
При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков на сывороточном агаре бесцветны, круглые с ровным краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию.
Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.
Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.
Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и B.catarrhalis в отличие от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими.
Заболевания, где этиологическим агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным механизмом передачи, что обеспечивает широкое распространение. Из всех представителей этого рода наибольшей патогенностью обладают H. influenzae, впервые описанные Пфейффером в 1892 г. Этот возбудитель является наиболее частым агентом тяжелых генерализованных форм заболеваний, особенно у детей до 5 лет. ГБМ у взрослых могут быть обусловлены другими серологическими типами.
Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высоко требовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.
Для проведения бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением: сроков забора, доставки патологического материала и условий транспортировки.
В бактериологическую лабораторию доставляется материал в следующем объеме:
1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 1,0 мл.
2. Ликвор в 0.1% полужидком агаре (среда "обогащения") для бактериологического накопления культуры, 0,5 мл ликвора засевают в 5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.
3. "Толстая капля" крови для бактериоскопии.
4. Кровь в жидкой питательной среде или в 0,1% полужидком агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры, 5,0 мл крови засевают в 50,0 мл среды обогащения.
5. Кровь в количестве не менее 2-х мл для серологических исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.).
Материал для бактериологических и серологических исследований доставляется в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в теплом виде (t0 =+370 С) в специально оборудованных контейнерах.
При невозможности немедленной доставки допускается хранение патологического материала в условиях термостата при +370 С в течение 18 часов.
Бактериологическое исследование спинномозговой жидкости больного
1-й день исследования
Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2 - 5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар (желательно до начала антибактериальной терапии) с соблюдением все правил асептики. Взятие ликвора производится персоналом в масках.
Первую порцию СМЖ (около 1,0 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования наливают в стерильную пробирку (не менее 1.0 мл) и частично засевают в 0,1% полужидкий агар (0,5 мл СМЖ добавляют в 5 мл 0,1% полужидкого агара). Касаться руками краев канюли, иглы и краев пробирок нельзя. Ватно-марлевую пробку полагается держать на весу за ее наружную часть.
СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3 - 0,5 мл материала и по 2 - 3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы ставят в термостат при +370 С и создают условия повышенного содержания СО2 в атмосфере термостата. Пробирка с ликвором в полужидком агаре инкубируется в термостате.
Нативная спинномозговая жидкость, оставшаяся в пробирке, исследуется в серологических реакциях и используется для приготовления мазков.
Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит.
H.influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.
Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне.
Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2 - 3 капли засеять в чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.
2-й день исследования
Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.
Морфология менингококковых колоний "шоколадном" агаре - нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета cреды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.
Гемофилы на "шоколадном" агаре дают обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2 - 2,0 мм, легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины и короткие цепочки. На сывороточном агаре H.influenzae не растет. Крупные 3 - 5 мм колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P.aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.
Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (0,1 - 1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип α-гемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S.feacalis), которые в редких случаях могут вызывать менингит, особенно у детей 1 года.
В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2 - 3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности. Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20% сыворотки. H.influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями.
На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H.influenzae, N.meningitidis и Str. pneumoniae.
Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при +370 С.
Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.
Если число выросших колоний мало (1 - 2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.
При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, в также изредка в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa), Acinetobactercalcoaceticum, Listeriamonocytogenes, различные стрептококки - гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.
При подозрении на энтеробактерии, синегнойную палочку, стафилококк и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии с методическими материалами.
При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L.monocytogenes характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.
Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 МЕ/мл пенициллина и стрептомицина.
Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").
При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1 - 2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.
При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.
3-й день исследования
Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН.
Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию, серогруппирование идентификационной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).
Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).
Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы.
На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при +370 С на 1 - 2 часа. По истечении этого времени вокруг диска колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста шириной 1 - 2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м секторе кровяного агара используют для постановки пробы на чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было сделано раннее).
При отрицательных результатах пробы на чувствительность к желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов, дифференцирующих стрептококки.
В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если это не было сделано на 2-й день).
4-й день исследования
Учитывают результаты посевов с целью дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и Br.catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа.
Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при +370 С, можно использовать для серологической идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции преципитации в агаре, а также для определения лекарственной устойчивости.
Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный положительный ответ.
Бактериологическое исследование крови
При подозрении на менингококцемию или сепсис проводят бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой капли" из крови, взятой из вены или пальца.
В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке, имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих, располагающихся кучками, парно и по одному, кокков. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.
Кровь, взятую стерильно из вены, засевают на 0,1% полужидкий агар или жидкую питательную среду в отношении 1:10, т.е. 1 - 2 мл крови можно посеять в пробирку с 7 - 10 мл полужидкого агара или 5 - 10 мл крови засеять во флакон с 50 мл среды. После суточной инкубации материал высевают на сывороточный и "шоколадный" агар в чашки Петри. При наличии роста готовят препараты для микроскопии. При отрицательном результате рекомендуется инкубация в течение недели с высевами через день. Выделение и идентификацию гемокультур проводят также, как при исследовании спинномозговой жидкости.
Бактериологическое исследование экссудата из петехий
При менингококцемии иногда удается обнаружить менингококки непосредственно в экссудате кожных петехий.
Для этого вначале обтирают кожу вокруг петехий 70% спиртом. В случае образования некроза в центре петехии экссудат можно взять прокаленной и остуженной бактериологической петлей из некротизированных участков. При неповрежденной коже экссудат берут стерильной тонкой иглой, соединенной со шприцем, в котором имеется 0,1 - 0,2 мл физиологического раствора. Физиологический раствор вводят в толщу петехии и отсасывают обратно.
Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании
8-09-2015, 21:58