В 1948 г. открыты первые антибиотики из группы полимиксинов, а два года спустя получены тетрациютины. В последующие годы внимание исследователей привлекла группа антибиотиков, имеющих гликозидоподобную структуру (аминогликозиды, макролиды, анзамицины).
Большой вклад в развитие исследований антибиотиков внесли ученые М.М. Шемякин, А.С. Хохлов (Институт биоорганической химии АН СССР). Следует иметь в виду, что исследования антибиотиков стали возможными в результате познания механизмов процессов, происходящих на молекулярном уровне. Большой вклад в изучение молекулярных механизмов действия антибиотиков внесли труды академиков Ю.А. Овчинникова, В.А. Энгельгардта, А.С. Спирина.
Многие из применяемых в нашей стране антибиотиков разработаны во Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА). Создание этого института совпало со становлением отечественной промышленности антибиотиков и связано с именами ученых З.В. Ермольевой, Н.А. Красильникова, В.Н. Шапошникова, А.Н. Белозерского, С.М. Навашинаидр.
ВНИИА — крупный научный центр, в котором комплексно развиваются все разделы генетики, селекции и физиологии микроорганизмов, биоорганической и органической химии, технологии, стандартизации и контроля антибиотиков. В институте осуществляется система поиска новых природных антибиотиков, а также получение их методами химической и микробиологической трансформации. Фундаментальные исследования и интенсификация методов производства антибиотиков обеспечивают как перспективные научные направления, так и интересы промышленного производства антибиотиков. Многие годы ВНИИА успешно руководил акад. РАМН С.М. Навашин.
Широкие исследования в области полиеновых и других антибиотиков ведутся в С.-Петербурге во Всесоюзном научно-исследовательском технологическом институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ). Работами И.М. Терешина установлена возможность применения полиеновых антибиотиков для лечения не только грибковых, но также вирусных инфекций, злокачественных новообразований и даже атеросклероза.
Наиболее широко применяемые в качестве ЛВ природные антибиотики и их полусинтетические аналоги классифицируют на следующие группы:
1. Антибиотики алициклического строения (группа тетрациклинов, их полусинтетические аналоги и др.).
2. Антибиотики ароматического ряда (группа левомицетина).
3. Антибиотики гетероциклической структуры (пенициллины, их полусинтетические аналоги, цефалоспорины и др.).
4. Антибиотики-гликозиды: стрептомицины; антибиотики-аминогликозиды (канамицины, неомицины, гентамицины, мономицины); макролиды (эритромицины и олеандомицин); анзамицины (рифамицины и их полусинтетические аналоги); полиеновые антибиотики с гликозидоподобной структурой (нистатин, амфотерицин, микогептин).
5. Антибиотики, обладающие противоопухолевым действием, можно классифицировать на производные ауреоловой кислоты, антрациклины, производные хинолин-5,8-диона и актиномицины.
6. Антибиотики-полипептиды (грамицидины, полимиксины и др.).
4.2 Роль антибиотиков в развитии химиотерапии
Внедрение в медицинскую практику антибиотиков помогло победить ряд тяжелых заболеваний. Достаточно указать, что благодаря применению антибиотиков смертность от воспаления легких снизилась в 10 раз, острой дизентерии — в 11 раз, заражений крови и воспалений брюшины — в 4-5 раз.
Антибиотик может быть использован в качестве ЛВ, если он проявляет антимикробную активность в человеческом организме и не имеет токсического действия. Именно поэтому из открытых нескольких тысяч антибиотиков лишь несколько десятков нашли применение в медицинской практике.
Длительное использование одних и тех же антибиотиков в качестве ЛС постепенно приводит к повышению устойчивости первоначально чувствительных к их действию naît)генных микроорганизмов. Это явление — следствие радикальных изменений в геноме микроорганизмов. Оно постепенно приводит к широкому распространению устойчивых к антибиотикам форм стафилококков, кишечных палочек, протеев и других микроорганизмов.
Антибиотики, особенно беталактамиды и аминогликозиды, принято разделять на ЛП I, II, III, IV поколений. Такая классификация учитывает не только время их внедрения в медицинскую практику, но и терапевтические свойства.
В последние два десятилетия в исследованиях антибиотических веществ появились новые направления. От эмпирических поисков новых антибиотиков ученые перешли к глубокому и всестороннему исследованию процессов биосинтеза, путей различной модификации (трансформации) молекул известных антибиотиков, изучению новых аспектов их фармакологического действия.
В результате исследований продуктов трансформаций природных молекул были созданы полусинтетические пенициллины итетрациклины, цефалоспорины и рифамицины. Эти вещества оказались более эффективными, чем их природные предшественники. Значительные успехи достигнуты в области исследования антибиотиков для лечения злокачественных новообразований.
Чрезвычайно перспективными являются исследования по получению новых штаммов продуцентов антибиотиков. Они позволяют резко повысить интенсивность биосинтеза, что дает огромный экономический эффект в промышленном производстве антибиотиков. Повышения активности продуцентов можно достигнуть, используя методы генной инженерии, в частности слиянием протопластов. Это дает возможность в дальнейшем перейти к получению «гибридных веществ», сочетающих действие нескольких антибиотиков, например свойства аминогликозида и макролида. Такие вещества будут иметь более широкий спектр антибактериального действия.
В последнее время обнаружена возможность применения некоторых антибиотиков для нормализации функции сердца. Из бактерий родаStreptomycesвыделен антибиотик, который проявляет фармакологическое действие ионофора кальция. Результаты исследований, совместно проведенных нашими и американскими учеными, свидетельствуют о высокой эффективности этого антибиотика при сердечной недостаточности.
4.3 Способы получения антибиотиков
Более половины из известных антибиотиков продуцируют лучистые грибы родаStreptomyces — актиномицеты (стрептомицеты). К этой группе относятся стрептомицин и другие антибиотики-гликозиды (неомицины, канамицины), тетрациклины, левомииетин, антибиотики-макролиды (эритромицин, олеандомицин) и анзамицины (рифамицин), полиеновые антибиотики (нистатин) и др. Другим важным продуцентом являются лучистые (плесневые) грибы — различные виды родаPénicillium.Они осуществляют биосинтез пенициллинов, а также некоторых противоопухолевых и противовирусных антибиотиков. Бактерии, главным образом родаBacillus,продуцируют большинство антибиотиков- полипептидов. Они, как правило, высокотоксичны, но некоторые из них применяют в медицине (грамицидин, полимиксин и др.).
Способы получения антибиотиков можно подразделить на три основные группы.
I. Микробиологический синтез на основе плесневых или лучистых грибов. Этим способом получают антибиотики тетрациклинового ряда, природные пенициллины, антибиотики-гликозиды, макролиды и др.
II. Химический синтез из простых органических веществ. Его используют для получения антибиотиков, имеющих несложную химическую структуру (левомицетин и его производные).
III. Сочетание микробиологического и химического синтеза. На основе трансформации молекул природных антибиотиков получают полусинтетические антибиотики (полусинтетические пенициллины, цефалоспорины, тетрациклины и др.).
Получение большинства природных антибиотиков основано на биосинтезе, осуществляемом в клетке микроорганизма. Микробная клетка выполняет роль сложнейшей химической лаборатории, в которой происходят очень тонкие процессы, недоступные пока для органического синтеза, причем для их проведения не требуется высоких температур, повышенного давления, катализаторов.
Получение антибиотиков с помощью микробиологического синтеза включает такие основные этапы, как изыскание высокопроизводительных штаммов продуцентов, подбор питательных сред, процесс ферментации, выделение и очистка антибиотика.
Биосинтез выполняют в специальных аппаратах — ферментерах — вместимостью в несколько десятков тысяч литров. Ферментацию проводят «глубинным способом», который заключается в том, что рост плесени и образование антибиотика происходят по всей толще ферментационной массы. Каждый из микроорганизмов требует специальных условий ферментации: температуры, подачи воздуха (аэрации), определенной продолжительности процесса. Для обеспечения жизнедеятельности микроорганизма и максимального накопления антибиотика необходимы специальные питательные среды. Регулируя качественный и количественный состав ингредиентов питательных сред, можно существенно влиять на выход антибиотика. Питательные среды вначале подают в посевные аппараты (через установки непрерывной стерилизации). Здесь происходит выращивание культур. Затем смесь культуры и питательной среды перемещают в ферментер, где происходит процесс биосинтеза. В ферментер добавляют также пеногасители во избежание образования пены при аэрации.
Антибиотики выделяют из культуральной жидкости осаждением, с помощью адсорбционной или ионообменной хроматографии, экстракцией различными органическими растворителями или при различных значенияхсреды. Очистку антибиотика-сырца осуществляют хроматографическим методом или противоточной экстракцией с последующей перекристаллизацией. Выделенный кристаллический антибиотик подвергают тщательному химическому и биологическому контролю. Весь процесс производства антибиотиков осуществляют в строго соблюдаемых асептических условиях.
4.4 Методы анализа антибиотиков
Количественное определение большинства антибиотиков осуществляют биологическим методом, основанным на сравнительной оценке угнетения роста тест-микроорганизмов. Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами. ГФ XI рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образцов антибиотика на тест-микроорганизм (ГФ XI, в. 2, с. 210).
Это испытание основано на способности антибиотиков угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов испытуемым препаратом и Государственным стандартным образцом (ГСО) антибиотика. Активность ГСО устанавливают, как правило, в соответствии с Международными биологическими или химическими стандартами.
Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации. Процесс инкубации осуществляют в течение 16-18 ч при 36-38°С.
Расчет биологической активности производят по стандартной кривой, предварительно построенной на основании результатов определения пяти концентраций стандартного препарата. Умножением полученной концентрации (ЕД/мл) на степень разведения вычисляют активность (содержание ЕД) антибиотика в 1 мг препарата. Точность определений колеблется от 5 до 25%.
Единица действия (ЕД) представляет собой меру, которой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды. Количественное выражение 1 ЕД отличается у различных антибиотиков. Например, у натриевой соли бензилпенициллина 1 ЕД соответствует 0,5988 мкг химически чистого вещества, а у стрептомицина основания, тетрациклина и его производных 1 ЕД соответствует 1 мкг химически чистого вещества.
В последние годы разработаны ускоренные биологические методы определения антибиотиков в биологических жидкостях.
Для установления концентрации антибиотиков аминогликозидов в крови больных применяют более простой модифицированный метод диффузии в агар. Ускорение определения до 2-6 ч вместо 16-18 ч достигается за счет создания максимально благоприятных условий для роста тест-микроорганизмов (уменьшения слоя питательной среды, оптимизации температуры инкубации и т.д.).
К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов. Концентрацию определяют сравнением изменений рН в средах испытуемых и стандартных образцов через 1,5 ч после начала инкубации. На этом принципе основан так называемый уреазный метод, заключающийся в наблюдении за изменением рН жидкой питательной среды, содержащей 2% мочевины. Выделяющийся в процессе роста микроорганизма аммиак вызывает изменение рН среды. Точность определений около 46%.
Ферментативный метод основан на инактивации аминогликозидов в крови специфическими ферментами (аденилтрансфераза и ацетилтрансфераза), продуцируемыми грамотрицательными микроорганизмами, устойчивыми к антибиотикам этой группы. Эти ферменты катализируют процесс аденилирования или ацетилирования аминогликозидов в присутствии 14 С-аденозинтрифосфата или 14 С-ацетилкоэнзима А. Они являются источником радиоактивности. Затем способом подсчета радиоактивности делают заключение о концентрации антибиотика. Определение занимает 1-2 ч.
Радиоиммунный метод основан на сравнительной оценке конкуренции антибиотика, меченного тритием, и испытуемого антибиотика по отношению к специфическим антителам иммунной сыворотки. Метод отличается очень высокой чувствительностью (0,003-0,01 мкг/мл), результаты получают в течение 1-2 ч, точность высокая (коэффициент вариации 4-5%).
На точность биологических методов оказывают влияние целый ряд факторов (характер питательной среды, условия инкубации, точность измерения зон угнетения роста и т.д.). Поэтому понятно стремление исследователей к замене биологических методов контроля химическими и физико-химическими. При этом обязательно должна соблюдаться адекватность предлагаемых методик по отношению к результатам биологического контроля.
Использование различных химических и физико-химических методов рассмотрено далее на примерах испытаний на подлинность и количественного определения ЛВ, относящихся к числу антибиотиков и их полусинтетических аналогов.
8-09-2015, 22:31