За допомогою методів УФ-спектрофотометрії та ВЕРХ розроблені методики аналізу суми оксикоричних кислот та цикорієвої кислоти в сировині та препаратах кульбаби лікарської.

З використанням розробленої нами УФ-спектрофотометричної методики встановлено, що найбільший вміст суми оксикоричних кислот знаходиться в сировині листя кульбаби лікарської, менший – в квітках, найменший – в коренях кульбаби лікарської. Досліджено коливання вмісту суми оксикоричних кислот в сировині, зібраній у різні роки в різних регіонах України (табл. 4). Встановлено, що вміст оксикоричних кислот у сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 3,01±0,13 % до 3,81±0,18 %, вміст оксикоричних кислот в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 1,920±0,101 % до 2,72±0,11 %, вміст оксикоричних кислот в сировині коренів коливається в межах від 0,98±0,07 % до 1,11±0,08 %.

З використанням розробленої ВЕРХ-методики встановлено, що найбільший вміст цикорієвої кислоти знаходиться в сировині листя кульбаби лікарської, менший – в квітках, найменший – в коренях кульбаби лікарської. Хроматограми цикорієвої кислоти та екстрактів кульбаби лікарської представлені на рис. 1-4. Досліджено як коливається вміст цикорієвої кислоти в сировині, зібраній в різні роки в різних регіонах України (табл. 4). Встановлено, що вміст цикорієвої кислоти в сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 1,21±0,07 % до 1,53±0,05 %, вміст цикорієвої кислоти в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 0,52±0,03 % до 0,066±0,02 %, вміст цикорієвої кислоти в сировині коренів коливається в межах від 0,30±0,02 % до 0,32±0,02 %.

Таблиця 4

Вміст суми оксикоричних кислот та цикорієвої кислоти в сировині кульбаби лікарської, зібраної в різних регіонах України

Сировина кульбаби лікарської, n=6	Вміст суми оксикоричних кислот (%),	Вміст цикорієвої кислоти (%),
Листя, Черкаська обл., 2006 р.	3,51±0,17	1,48±0,05
Листя, Київська обл., 2005 р.	3,50±0,16	1,32±0,06
Листя, Київська обл., 2006 р.	3,81±0,18	1,53±0,05
Листя, Волинська обл., 2006 р.	3,61±0,16	1,49±0,06
Листя, Херсонська обл., 2006 р.	3,01±0,13	1,21±0,07
Квітки, Черкаська обл., 2006 р.	2,11±0,11	0,59±0,03
Квітки, Київська обл., 2005 р.	2,32±0,10	0,58±0,02
Квітки, Київська обл., 2006 р.	2,72±0,11	0,66±0,02
Квітки, Волинська обл., 2006 р.	2,43±0,11	0,61±0,03
Квітки, Херсонська обл., 2006 р.	1,92±0,10	0,52±0,03
Корені, Київська обл., 2004 р.	0,98±0,07	0,30±0,02
Корені, Київська обл., 2005 р.	1,10 ± 0.06	0,32±0,02
Корені, Черкаська обл., 2005 р.	1,11±0,08	0,30±0,03

хв.

Рис. 1. Хроматограма розчину цикорієвої кислоти.

хв.

Рис. 2. Хроматограма екстракту листя кульбаби лікарської.

хв.

Рис.3. Хроматограма екстракту квіток кульбаби лікарської.

хв.

Рис. 4. Хроматограма екстракту коренів кульбаби лікарської.

Із застосуванням методу УФ-спектрофотометрії розроблено методику аналізу суми флавоноїдів в сировині кульбаби лікарської в перерахунку на лютеолін. Проаналізовано сировину листя та квіток кульбаби лікарської, зібраної в різних регіонах України (табл. 5). Встановлено, що вміст флавоноїдів в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 0,4913±0,0360 % до 0,7106±0,0740 %.

Вміст суми флавоноїдів в сировині листя кульбаби лікарської коливається в межах від 0,1821±0,0135 % до 0,2235±0,0183 %.

Таблиця 5

Вміст суми флавоноїдів та вільного лютеоліну в сировині квіток кульбаби лікарської, зібраної в різних областях України

Сировина кульбаби лікарської, n=6	Вміст в сировині,
	Cума флавоноїдів (%)	Лютеолін (%)
Квітки, Черкаська обл., 2003 р.	0,711 ±0,074	0,332±0,009
Квітки, Київська обл., 2002 р.	0,514 ± 0,024	0,183±0,008
Квітки, Київська обл., 2003 р.	0,574±0,036	0,207±0,007
Квітки, Житомирська обл., 2003 р.	0,538±0,043	0,193±0,006
Квітки, Волинська обл., 2003 р.	0,491±0,036	0,190±0,004
Квітки, Херсонська обл., 2003 р.	0,528±0,015	0,205±0,006
Листя, Черкаська обл., 2006 р.	0,214 ±0,016	-
Листя, Київська обл., 2005 р.	0,205 ± 0,015	-
Листя, Київська обл., 2006 р.	0,224 ± 0,018	-
Листя, Волинська обл., 2006 р.	0,193 ± 0,019	-
Листя, Херсонська обл., 2006 р.	0,182±0,014	-

З використанням методу ВЕРХ розроблено методику аналізу вмісту флавоноїду лютеоліну в сировині та препаратах квіток кульбаби лікарської. Проаналізовано сировину квіток кульбаби лікарської, зібрану в різних регіонах України (табл. 5). Встановлено, що вміст лютеоліну в сировині квіток кульбаби лікарської коливається в межах від 0,1830±0,0084 до 0,3315±0,0091 %.

За допомогою методу УФ-спектроскопії розроблена методика аналізу полісахаридів в сировині кульбаби лікарської. Встановлено, що найбільший вміст полісахаридів знаходиться в коренях кульбаби лікарської – 33,73±2,68 %, менший вміст в квітках – 7,70±0,48 %, найменшу кількість полісахаридів знайдено в сировині листя кульбаби лікарської – 2,79±0,23 %.

Досліджено залежність вмісту БАР в сировині надземної частини кульбаби лікарської від фази вегетації. Встановлено, що для максимального вмісту БАР листя та квітки кульбаби лікарської треба збирати в фазу масового цвітіння рослини.

Стандартизація сировини та препаратів кульбаби лікарської

Розроблені науково обгрунтовані рекомендації щодо виготовлення водно-спиртових настойок та екстрактів з сировини квіток, листя та трави кульбаби лікарської з оптимальним вмістом БАР.

Встановлено, що оптимальними умовами екстракції БАР із сировини надземної частини кульбаби лікарської (квітки, листя, трава) є трикратна екстракція подрібненої до розміру 0,5 – 2 мм сировини 40 % або 70 % спиртом протягом 45 хв у співвідношенні (маса сировини : об’єм екстрагенту) 1:20.

Встановлені макроскопічні та мікроскопічні ознаки квіток та листя кульбаби лікарської.

Розроблено проект АНД „Квітки кульбаби лікарської”, який регламентує макроскопічні та мікроскопічні ознаки, параметри ідентифікації, втрату в масі при висушуванні (не більше 13 %), вміст загальної золи (не більше 10 %), вміст золи, нерозчинної в 10 % розчині кислоти хлористоводневої (не більше 2 %), вміст цикорієвої кислоти (не менше 0,5 %), вміст лютеоліну ( не менше 0,15 %).

За розробленим проектом АНД проаналізовано 5 серій сировини квіток кульбаби лікарської.

Розроблено проект АНД „Листя кульбаби лікарської”, який регламентує макроскопічні та мікроскопічні ознаки, параметри ідентифікації, втрату в масі при висушуванні (не більше 13 %), вміст загальної золи (не більше 10 %), вміст золи, нерозчинної в 10 % розчині кислоти хлористоводневої (не більше 2 %), вміст цикорієвої кислоти (не менше 1 %).

За розробленим проектом АНД проаналізовано 5 серій сировини листя кульбаби лікарської.

Розроблено проект АНД „Корені кульбаби лікарської”, який регламентує макроскопічні та мікроскопічні ознаки, параметри ідентифікації, втрату в масі при висушуванні (не більше 14 %), вміст загальної золи (не більше 8 %), вміст золи, нерозчинної в 10 % розчині кислоти хлористоводневої (не більше 4 %), вміст цикорієвої кислоти (не менше 0,2 %), вміст полісахаридів ( не менше 25 %).

За розробленим проектом АНД проаналізовано 5 серій сировини коренів кульбаби лікарської.

Дослідження біологічної активності потенційних лікарських засобів на основі кульбаби лікарської

Вивчення біологічної активності екстрактів листя, квіток та коренів кульбаби лікарської було виконано в Державній установі „Інститут фармакології та токсикології” АМН України.

Дослідження гострої токсичності та протизапальних властивостей проводили в відділі протизапальних та анальгезуючих засобів при консультативній допомозі к.б.н. Ядловського О.Є. В результаті проведення токсикологічних досліджень встановлено, що водно-спиртові екстракти коренів, квіток та листя кульбаби лікарської за величиною ЛД₅₀ при внутрішньошлунковому введенні відносяться до ІVкласу токсичності (практично нетоксичні речовини).

Проведені дослідження на моделі карагенінового набряку у мишей дозволили виявити наявність протизапальних властивостей у водно-спиртових екстрактах коренів, листя та квіток кульбаби лікарської, при цьому екстракт листя кульбаби лікарської не поступається за вказаною активністю настойці горіха грецького.

Вивчення антирадикальної, антиоксидантної та геномозахисної дії проводили у відділі біохімічної фармакології під керівництвом та консультативною допомогою д.м.н. Літвінової Н.В. Дослідження, що були проведені invitro на моделі дифенілпікрилгідразилу та invivo на ізольованих фракціях репресованого хроматину і транскрипційно активних хроматину клітин печінки щурів продемонстрували, що вищезазначені лікувальні властивості в різній мірі притаманні всім досліджуваним екстрактам кульбаби, при цьому водно-спиртовий екстракт листя кульбаби лікарської не поступається за своїми антиоксидантними та геномозахисними властивостями настоянці горіха грецького.

За результатами проведених досліджень як перспективні препарати з протизапальними, антиоксидантними та геномозахисними властивостями запропоновано для застосування настойки, екстракти та лікарські чаї на основі сировини листя кульбаби лікарської.

Дослідження багатокомпонентних фітокомпозицій, до складу яких входить кульбаба лікарська

Для розробки методологічних підходів для ідентифікації та стандартизації кульбаби лікарської в багатокомпонентних фітокомпозиціях як об'єкт для дослідження нами було взято розроблену в Державній лабораторії з контролю якості лікарських засобів ДУ „Інститут фармакології та токсикології” АМН України фітокомпозицію “Кардіосед”. Вона має такий склад: трави астрагалу шерстистоквіткового – 20 г; трави меліси лікарської – 20 г; трави кульбаби лікарської – 20 г; плодів глоду – 30 г; плодів фенхелю – 10 г; коренів та кореневищ валеріани лікарської – 20 г; спирту етилового 70 % – достатня кількість для доведення до об'єму 1 л.

З використанням методу ВЕРХ нами було запропоновано стандартизацію компонентів кульбаби лікарської в фітокомпозиції за наявністю та вмістом цикорієвої кислоти, яка присутня в усіх частинах кульбаби лікарської.

На рис. 5 представлені хроматограми фітокомпозиції „Кардіосед” та контрольної фітокомпозиції, що відрізняється за складом від „Кардіоседу” відсутністю трави кульбаби лікарської. Хроматограми відрізняються одна від другої тим, що на хроматограмі фітокомпозиції “Кардіосед” присутній пік цикорієвої кислоти, на хроматограмі ж контрольної фітокомпозиції вказаний пік відсутній.

хв.

Рис. 5. Хроматограма складних фітокомпозицій:

1 – фітокомпозиція “Кардіосед”;

2 – контрольна фітокомпозиція без додавання трави кульбаби лікарської.

Встановлено, що вміст цикорієвої кислоти в фітокомпозиції „Кардіосед” становить 0,0080±0,0004 %.

Таким чином, нами була показана можливість стандартизації сировини кульбаби лікарської за наявністю та вмістом цикорієвої кислоти в присутності трави астрагалу шерстистоквіткового, трави меліси лікарської, плодів глоду колючого, плодів фенхелю та коренів з кореневищами валеріани лікарської.

За допомогою методів ТШХ та УФ-спектрофотометрії розроблено методики визначення діючих речовин в складній фітокомпозиції „Кардіосед”. Визначені якісні та числові показники якості фітокомпозиції: ідентифікація компонентів валеріани лікарської; ідентифікація компонентів астрагалу шерстистоквіткового; вміст суми флавоноїдів (не менше ніж 0,05 %); вміст ефірних олій (не менше ніж 0,1 %); відносна густина (0,895 – 0,901); сухий залишок (не менше ніж 1,8 %); вміст спирту (не менше ніж 66,5 %); вміст важких металів (не більше ніж 0,001%).

Були також розроблені методики визначення цикорієвої кислоти в препаратах кульбаби лікарської, що присутні на фармацевтичному ринку України. В усіх проаналізованих об'єктах була ідентифікована цикорієва кислота. Результати проведених досліджень представлені в табл. 6.

Таблиця 6

Вміст цикорієвої кислоти в препаратах кульбаби лікарської

ВИСНОВКИ

1. Проведено фармакогностичне дослідження надземної частини кульбаби лікарської; на основі вивчення якісного складу та кількісного вмісту біологічно активних речовин з використанням сучасних методів визначені показники якості та розроблені способи аналізу сировини і потенційних лікарських засобів кульбаби лікарської; обгрунтовано можливість створення лікарських засобів з протизапальною, антиоксидантною та геномозахисною активністю.

2. В квітках кульбаби лікарської ідентифіковано 45 біологічно активних речовин: 4 гідроксикоричні кислоти, 3 флавоноїди, 13 амінокислот, 14 жирних кислот, 5 цукрів, 3 токофероли, тритерпеноїд, стерин та кумарин. В квітках кульбаби лікарської вперше ідентифіковано L-рамнозу та 4 жирні кислоти (арахінову, бегенову, лігноцеринову та пальмітинолеїнову).

3. В листі кульбаби лікарської ідентифіковано 35 біологічно активних речовин: 4 гідроксикоричні кислоти, 3 флавоноїди, 12 амінокислот, 9 жирних кислот, 4 цукри, тритерпеноїд, стерин та кумарин. З листя кульбаби лікарської вперше виділено лютеолін-4'-О-β-D-глюкопіранозид та п-кумарову кислоту, вперше ідентифіковано 3 цукри (L-рамноза, D-ксилоза, та D-арабіноза) та 8 жирних кислот (міристинова, стеаринова, олеїнова, лінолева, арахінова, бегенова, ліноленова, лігноцеринова та пальмітинолеїнова кислоти).

4. З застосуванням методів ВЕРХ, ГРХ та УФ-спектрофотометрії досліджені оптимальні параметри аналізу сировини кульбаби лікарської (листя, квітки, корені) за вмістом наступних БАР: флавоноїдів, оксикоричних кислот, полісахаридів, поліфенолів, амінокислот, жирних кислот, каротиноїдів, токоферолів та хлорофілів. В сировині листя та квіток кульбаби лікарської встановлено високий вміст похідних оксикоричних кислот, флавоноїдів, поліфенолів, жирних кислот, каротиноїдів, токоферолів та хлорофілів.

5. За допомогою вперше розроблених нами методик порівняно вміст БАР в листях, квітках та коренях кульбаби лікарської. Встановлено, що вміст флавоноїдів, оксикоричних кислот, поліфенолів, амінокислот більший в надземній частині кульбаби лікарської. Для стандартизації показників якості проаналізовано на вміст БАР сировину кульбаби лікарської, зібрану в різних регіонах України.

6. За допомогою методу УФ-спектрофотометрії визначено вміст БАР в сировині надземної частини кульбаби лікарської в залежності від фази вегетації. Встановлено, що для максимального вмісту БАР листя та квітки кульбаби лікарської треба збирати в фазу масового цвітіння рослини.

7. Проведено дослідження щодо науково обгрунтованих параметрів виготовлення екстрактів із сировини листя та квіток кульбаби лікарської. Встановлено, що оптимальними умовами екстракції БАР із сировини надземної частини кульбаби лікарської є трикратна екстракція подрібненої до розміру 0,5 – 2 мм сировини 40 % або 70 % спиртом протягом 45 хв у співвідношенні (маса сировини:об’єм екстрагенту) 1:20.

8. Встановлені показники якості та розроблені проекти АНД „Кульбаби лікарської листя”, „Кульбаби лікарської квітки”, „Кульбаби лікарської корені” та фітокомпозиція „Кардіосед”.

9. Встановлено, що за параметрами гострої токсичності водно-спиртові екстракти листя та квіток кульбаби лікарської відносяться до четвертого класу токсичності – практично нетоксичні речовини та проявляють протизапальну, антиоксидантну та геномозахисну активність. Як перспективні препарати запропоновано настойку та екстракт листя кульбаби лікарської.

10. За допомогою методу ВЕРХ розроблено методику якісної та кількісної стандартизації компонентів кульбаби лікарської, які містяться в багатопомпонентній фітокомпозиції „Кардіосед”. Встановлено, що за вмістом цикорієвої кислоти можна визначати кульбабу лікарську в рослинних фітокомпозиціях в суміші з такими видами сировини: плодами глоду колючого, травою астрагалу шерстистоквіткового, листям меліси лікарської, плодами фенхелю, коренями та кореневищами валеріани лікарської. На основі методу ВЕРХ запропоновані методики аналізу для 5 препаратів кульбаби лікарської, що присутні на фармацевтичному ринку України.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Гудзенко А.В. Вивчення антирадикальних властивостей водних та спиртових екстрактів кульбаби лікарської (Taraxacumofficinale) // Ліки. – 2006. – № 3–4. – С. 66–71.

2. Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В., Цуркан О.О. Кульбаба лікарська (Taraxacumofficinale): розробка методик аналізу флавоноїдів // Фітотерапія. Часопис. – 2006. – №3. – С. 41–45. (Особистий внесок – проведення аналізу літературних джерел та експериментальних досліджень по розробці методик аналізу флавоноїдів, узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

3. Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В. Дослідження вмісту похідних оксикоричної кислоти в сировині та препаратах кульбаби лікарської // Фітотерапія.Часопис. – 2007. – №1. – С. 62–67. (Особистий внесок – проведення аналізу літературних джерел та експериментальних досліджень кількісного вмісту похідних оксикоричної кислоти, узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

4. Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В. Дослідження екстрактів кульбаби лікарської // Фармацевтичний журнал. – 2007. – №5. – С. 92–99. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень кількісного вмісту біологічно активних речовин в ліпофільних екстрактах та пошук оптимальних умов екстракції сировини, узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

5. Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В. Кульбаба лікарська: розробка методик аналізу лікарської сировини // Фармацевтичний журнал. – 2006. – № 6. – С. 84–87. (Особистий внесок – проведення аналізу літературних джерел та експериментальних досліджень кількісного вмісту похідних оксикоричної кислоти та полісахаридів, узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

6. Гудзенко А.В., Ядловський О.Е. Гостра токсичність та протизапальна активність спиртових екстрактів кульбаби лікарської (Taraxacumofficinale) // Современные проблемы токсикологии. – 2007. – №3. – С. 39–42. (Особистий внесок – проведення аналізу літературних джерел та експериментальних досліджень протизапальної дії та гострої токсичності, узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

7. Пат. на корисну модель № 16657 Україна, МПК G01N 30/02. Спосіб ідентифікації квіток кульбаби лікарської / О.О. Цуркан, Т.В. Ковальчук, С.А. Шкляєв, А.В. Гудзенко (Україна). - № u 2006 02243; Заявл. 01.03.2006; Опубл. 15.08.2006, Бюл. № 8. – 2 с. (Особистий внесок – розробка способу ідентифікації квіток кульбаби лікарської, проведення експериментальних досліджень, участь у оформленні патенту).

8. Пат. на корисну модель № 26668 Україна, МПК G01N 30/02, А61К 31/00. Спосіб ідентифікації сировини (коріння, листя, квіток) кульбаби лікарської / О.О. Цуркан, Т.В. Ковальчук, А.В. Гудзенко (Україна). - № а 2006 11806; Заявл. 09.11.2006; Опубл. 10.10.2007, Бюл. № 16. – 3 с. (Особистий внесок – розробка способу ідентифікації сировини кульбаби лікарської, проведення експериментальних досліджень, участь у оформленні патенту).

9. Гудзенко А.В. Дослідження елементного складу надземної частини кульбаби лікарської // Медична наука: сучасні досягнення та інновації: Матеріали наук.-практ. конф., 22 листопада, 2007 р. – Харків: Вид-во ХМАПО, 2007. – С. 24–25.

10. Цуркан А.А., Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В., Курапова Т.Н. Определение флавоноидов в цветках одуванчика лекарственного // Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія: Зб. тез ІІІ Міжнар. наук.-практ. конф., 21 – 23 травня, 2003 р. – Харків: Вид-во НфаУ, 2003. – Ч. 1. – С. 312. (Особистий внесок – проведення експериментальних досліджень по якісному та кількісному аналізу флавоноїдів, узагальнення результатів, написання тез).

11. Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Гудзенко А.В., Бурмака О.В. Ідентифікація флавоноїдів та терпеноїдів у складній фітокомпозиції кардіотропної дії // Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів: Матеріали 1-ї Міжнародн. наук-практ. конф., 6–7 квітня, 2006 р. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2006. – С. 93. (Особистий внесок – участь у проведенні експериментальних досліджень по аналізу якісного складу флавоноїдів та терпеноїдів, узагальнення результатів, участь у написанні тез).

12. Цуркан О.О., Ковальчук Т.В., Гудзенко


8-09-2015, 23:12