МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
ГАЛУЗІНСЬКА ЛЮБОВ ВАЛЕРІЇВНА
УДК 615.322:577.127.4:615.212:615.276
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ВИВЧЕННЯ ПРОТИЗАПАЛЬНОЇ АКТИВНОСТІ ПОЛІФЕНОЛЬНОГО ЕКСТРАКТУ З НАДЗЕМНОЇ ЧАСТИНИ ЛЯДВЕНЦЮ РОГАТОГО
14.03.05. – фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступен я
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 200 8
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі біологічної хімії Національного фармацевтичного університету, Міністерство охорони здоров’я України, м. Харків
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор
ВОРОНІНА ЛАРИСА МИКОЛАЇВНА
Національний фармацевтичний університет,
МОЗ України, м. Харків,
завідувачка кафедри біологічної хімії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор
РИЖЕНКО ІРИНА МИХАЙЛІВНА
Національний фармацевтичний університет,
МОЗ України, м. Харків,
професор кафедри фармакології
доктор медичних наук, професор
ЗВЯГІНЦЕВА ТЕТЯНА ВОЛОДИМИРІВНА
Харківський державний медичний університет,
МОЗ України,
завідувачка кафедрифармакології
з медичною рецептурою
Захист дисертації відбудеться 15.02. 2008 року
о _13_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при
Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий 12.01.2008 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Нестероїдні протизапальні препарати (НПЗП) вже більше 100 років активно використовуються в клінічній практиці та посідають провідне місце в фармакотерапії багатьох захворювань запального ґенезу (Дзяк Г.В., 1999; Белоусов Ю.Б., 2000; Насонов Е. Л., 2002; Барсукова Е.Л., 2004; Свинцицкий А. С., 2004). Враховуючи широке споживання НПЗП, важливим є питання про ефективність та безпеку їх використання, тому що вони займають одне з перших місць за кількістю та важкістю побічних ефектів (Насонов Е.Л., 1998; Ушкалова Е.А., 2005; Штриголь С.Ю., 2005).
На першому місці серед ускладнень при застосуванні НПЗП стоїть ураження шлунково-кишкового тракту (ШКТ)(Григорьев П.Я., 1997; DequekerJ.,1998). Більшість з препаратів здатна викликати побічні ефекти з боку ЦНС, які за частотою займають друге місце після гастропатій (DeBroeM.E., 1999; HawkeyC.J., 2003). Різноманітні прояви з боку шкіри і слизових оболонок складають 8-10% усіх побічних реакцій і відзначаються при використанні піразолонів і піразолідонів (Гребенева Л.С., 1997; Насонов Е.Л., 2000). НПЗП властива також гепатотоксична дія (Меньшикова Е.Б., 1997; NyompaA.M., 1996), здатність викликати важкий бронхоспазм (Дзяк Г.В., 2000), гемолітичну анемію, тромбоцитопенію (Насонов Е. Л., 2002). Не менш серйозною проблемою, масштаби якої стали очевидними тільки останнім часом, є НПЗП-індукована нефротоксичність (HaoC.M, 1999; ForedC.M., 2001; WaliR. K., 2002).
Таким чином, пошук ефективних НПЗП, у яких би була відсутня побічна дія при збереженні потужного протизапального ефекту, залишається актуальною проблемою сучасної фармакології.
Важливим напрямком у вирішенні цієї проблеми є створення нових протизапальних препаратів на основі рослинної сировини, які мають нижчу токсичність та меншу кількість побічних ефектів, ніж синтетичні НПЗП (Сандер С.В., 1996; Чекман І.С., 2001).
Виходячи з цього, увагу привернули рослини роду Лядвенець (Lotus L.) родина бобових (Fabaceae), які широко представлені у світовій флорі (Середземномор’я, Середня та Східна Азія, Європа, а також Україна) і нараховують 80 видів. Найбільш розповсюджений на Україні Лядвенець рогатий (Lotus corniculatus) (Яковлев Г.П., 1991). На кафедрі фармакогнозії НФаУ з надземної частини Лядвенцю рогатого було розроблено та отримано новий поліфенольний екстракт під умовною назвою “Локорин” (Король В.В., 1999). Хімічний склад екстракту “Локорин” дозволяє припустити широкий спектр його фармакологічної активності, включаючи і протизапальну дію.
У зв’язку з цим експериментальне обґрунтування застосування екстракту “Локорин” є доцільним, та перспективною є можливість створення на його основі нового лікарського препарату, який розширить номенклатуру існуючих рослинних лікувальних засобів і, можливо, стане альтернативою сучасним НПЗП.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету з проблеми МОЗ України “Фармакологічне дослідження біологічно активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування в медичній практиці” (№ Державної реєстрації 0103U000478).
Мета та завдання дослідження. Метою даної роботи є вивчення фармакодинаміки поліфенольного екстракту “Локорин” і обґрунтування його терапевтичної ефективності на різних стадіях запального процесу.
Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні завдання:
1. Провести фармакологічний скринінг протизапальної, анальгетичної, жарознижувальної активності екстракту “Локорин” та визначити ЕД50 за протизапальною активністю.
2. Дослідити протизапальну дію екстракту “Локорин” на моделях запалення з вираженим ексудативним компонентом з використанням різних флогогенів.
3. Провести дослідження антипроліферативних властивостей екстракту “Локорин”.
4. Вивчити вплив екстракту “Локорин” на перебіг запалення з вираженим альтеративним компонентом на моделях спиртово-преднізолонової і індометацинової виразок шлунка та “трафаретної рани”.
5. З’ясувати антиоксидантну дію екстракту “Локорин” на моделях з мембранною патологією.
6. Вивчити параметри гострої токсичності досліджуваного екстракту та його вплив на функціональний стан ШКТ.
Об’єкт дослідження . Протизапальні властивості поліфенольного екстракту “Локорин”, вплив на перебіг запалення у щурів при різних модельних патологіях, антиоксидантна дія, а також його токсичні властивості.
Предмет дослідження . Поліфенольний екстракт з надземної частини Лядвенцю рогатого під умовною назвою “Локорин”.
Методи дослідження . При виконанні дисертаційної роботи використовувався комплексний методичний підхід із залученням фармакологічних, токсикологічних, біохімічних, гематологічних, гістологічних та статистичних методів дослідження.
Наукова новизна . Вперше на основі результатів експериментальних досліджень встановлена виразна протизапальна дія екстракту “Локорин” на різних модельних патологіях запалення, які характеризуються виразністю окремих фаз запального процесу (ексудації та альтерації).
Показана висока антиексудативна активність екстракту “Локорин” на моделях гострого запалення, репаративна, кардіопротекторна, гепатопротекторна, противиразкова дія.
Встановлено, що протизапальна дія досліджуваного екстракту обумовлена його мембранопротекторними, антиоксидантними та капілярозміцнювальними властивостями.
Доведено, що досліджуваний екстракт відноситься до класу відносно нешкідливих речовин і не чинить негативного впливу на функцію ШКТ (не впливає на секрецію шлункового соку, перистальтику кишечнику, не чинить місцевоподразнювальної дії на слизову оболонку шлунка).
Наукова новизна дисертаційної роботи підтверджена деклараційним патентом на корисну модель № 18309 “Безвідходний спосіб одержання біологічно активних комплексів з Лядвенцю рогатого” від 15.11.2006 р.
Практичне значення одержаних результатів. За результатами експериментальних досліджень розроблений та виданий інформаційний лист №23–2007 “Використання субстанцій рослинного походження „Локорин” та густого екстракту з листя Винограду культурного для розробки гепатозахисних засобів”.
Результати проведених досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах: експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією “Українська медична стоматологічна академія” Вищого державного навчального закладу України (м. Полтава) та військової фармації Української військово-медичної академії (м. Київ).
На підставі експериментальних даних доведена доцільність проведення подальших досліджень з метою створення лікарської форми екстракту “Локорин”.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана на кафедрі біологічної хімії та на базі ЦНДЛ НФаУ. Разом з науковим керівником сформульовані мета та завдання дослідження, розроблені методичні підходи до вибору адекватних моделей при виконанні експериментальної частини роботи. Особисто проведені інформаційно-патентний пошук, аналіз джерел літератури, експериментальні дослідження, статистична обробка, аналіз та систематизація отриманих результатів, сформульовані основні положення та висновки дисертації.
Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи викладалися та обговорювалися на: ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (м.Харків, 2003); Всеукраїнському науково-практичному семінарі “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (м.Харків, 2004); V Всеукраїнській науково-методичній конференції “Клінічна фармація в Україні” (м.Харків, 2004); Всеукраїнській науково-методичній конференції “Хімія природних сполук” (м.Тернопіль, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток наукових досліджень 2005 р.” (м.Полтава), ІІІ Національному з’їзді фармакологів України (м.Одеса, 2006).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 статей, з них 5 - у фахових виданнях, ліцензованих ВАК України, 6 тез доповідей, 1 патент та 1 інформаційний лист .
Об’єм і структура дисертації . Дисертаційна робота складається з переліку умовних скорочень, вступу, літературного огляду, опису матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів власних досліджень, аналізу отриманих результатів, висновків та переліку використаної літератури. Загальний об’єм дисертації складає 170 сторінок машинописного тексту. Робота ілюстрована 36 таблицями, 14 рисунками. Список використаних джерел літератури складає 246 найменувань, з яких 121 – іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Фармакологічні дослідження проведені на 636 білих безпородних статевозрілих щурах обох статей масою 150-220г та 53 білих безпородних статевозрілих мишах масою 20-30г, що були вирощені в розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ та утримувались на збалансованому стандартному раціоні у відповідності з санітарно-гігієнічними нормами (Науково-практичні рекомендації з утримання лабораторних тварин та роботи з ними, 2002). Експерименти проводили згідно з „Загальними етичними принципами експериментів на тваринах” (Україна, 2001), що узгоджуються з положеннями „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985).
Основні етапи проведених досліджень представлені на схемі.
Відомо, що патофізіологічними проявами запалення є біль, набряк, гіперемія, гіпертермія та порушення функції органу (Алексеев В.В., 2003). Тому на етапі скринінгових досліджень вивчали антиексудативну активність на моделі гострого карагенінового набряку, анальгетичну активність на моделі “оцтовокислих корчів” (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) жарознижувальну дію на моделі “молочної лихоманки” (Тринус Ф.П., 1974). Екстракт “Локорин” досліджували в дозах 10, 25, 50, 100 та 200 мг/кг при одноразовому внутрішньошлунковому введенні щурам. Як препарати порівняння служили диклофенак натрію (ЕД50 , 8 мг/кг) і гранули кверцетину в умовно терапевтичній дозі 5 мг/кг − антиексудативна активність; анальгін (ЕД50 , 55 мг/кг) і диклофенак натрію (ЕД50 , 5 мг/кг) − анальгетична активність; ацетилсаліцилова кислота (АСК) (ЕД50 , 50 мг/кг) та диклофенак натрію (ЕД50 , 5 мг/кг) − жарознижувальна активність.
При поглибленому вивченні протизапальної дії екстракту “Локорин” важливим було дослідити його вплив на такі стадії запалення, як альтерація, ексудація і проліферація.
Дослідження антиексудативних властивостей екстракту “Локорин” у дозі ЕД50 , 50 мг/кг проводили на моделях запалення задньої кінцівки у щурів з використанням таких флогогенів, як 0,1% розчину гістаміну, 2% суспензії зимозану і на моделі гострого асептичного перитоніту (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).
Антиексудативну дію екстракту в умовах експериментального перитоніту вивчали через добу після внутрішньоочеревинного введення щурам розчину Люголю і оцінювали за показником приросту окружності черева, а також біохімічними показниками сироватки крові: вмістом глікопротеїнів (ГП) (Штейнберг О.П., Доценко Я.Н., 1984), концентрацією сіалових кислот та середніх молекул (Камышников В.С., 2000). Експерименти проводили у порівнянні з диклофенаком натрію та кверцетином.
Антипроліферативну активність екстракту “Локорин” визначали на моделі „ватної гранулеми” (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) і порівнювали з диклофенаком натрію та кверцетином.
На наступному етапі вивчали антиальтеративну активність екстракту
“Локорин” у дозі 50 мг/кг на таких модельних патологіях, як “трафаретні рани”, спиртово-преднізолонова виразка шлунка (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001) та індометацинова виразка шлунка (Derelanko M. G., 1980).
|
ІІ етап
|
||||
 |
||||
|
||||
 |
||||
ІІІ етап
|
|||
 |
|||
ІVетап
|
Схема. Етапи та основні методи фармакологічних досліджень поліфенольного екстракту “Локорин”.
Інтенсивність альтеративного запалення на моделі стандартних шкіряних ран оцінювали за динамікою планіметричних показників (стан рани, їх площа) з 2-ої доби до повного загоєння ран (19-та доба), вмістом ГП та ТБК-реактантів (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977) в сироватці крові, а також за динамікою показників периферичної крові у щурів (Камышников В.С., 2000) на 5-ту, 9-ту та 13-ту добу досліду. Референс-препаратом був диклофенак натрію в дозі 8 мг/кг.
При вивченні противиразкової активності екстракту “Локорин” визначали показники, які узагальнено характеризують збалансованість ПОЛ та АОС у сироватці крові (спиртово-преднізолонова виразка шлунка), гомогенаті печінки (індометацинова виразка шлунка) та гомогенатах шлунка в умовах даних патологій у порівнянні з кверцетином у дозі 5 мг/кг.
Для встановлення антиоксидантної дії екстракту “Локорин” проводили вивчення його антиокиснювальних властивостей в системі in vitro на моделі спонтанного та аскорбатіндукованого ПОЛ в гомогенаті печінки (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.,1972). З метою підтвердження ефективності в умовах in vivo визначали антиоксидантну дію екстракту “Локорин” на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту. Мембраностабілізувальну активність екстракту “Локорин” вивчали за методом F.C.Jager (Вороніна Л.М. зі співавт., 1996), капілярозміцнювальну дію досліджували відповідно до методу Голікова П.П., 1964.
Гепатопротекторну активність вивчали на моделі гострого ураження печінки тетрахлорметаном. В умовах даної патології досліджували в гомогенаті печінки деякі показники ПОЛ - ТБК-реактанти, дієнові кон’югати (ДК), ацилгідропероксиди (АГП) (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977) та систему антиоксидантного захисту за вмістом відновленого глутатіону (GSH) (BeutlerE.D., atal., 1963) та активністю каталази у гомогенаті печінки (Королюк М.А., 1988). У сироватці крові визначали активність аланінамінотрансферази (АлАТ), гамма-глутамілтранспептидази (г-ГТП), лужної фосфатази (ЛФ) у порівнянні з гепатопротектором силібором в дозі ЕД30 , 25 мг/кг (Камышников В.С., 2000).
Морфоструктуру зразків печінки вивчали за допомогою стандартного методу світлової мікроскопії (Меркулов Г.А, 1969, Соколовский В.В., 1971).
Кардіопротекторну активність в умовах ізадринового міокардиту визначали за активністю ферментів аспартатамінотрансферази (АсАТ), лактатдегідрогенази (ЛДГ), креатинфосфокінази (КФК) (Камышников В.С., 2000) в сироватці крові та в гомогенаті серця досліджували вміст ТБК-реактантів та ДК (Стальная И.Д., Гавришвили Т.Г., 1977). Кардіопротекторну дію екстракту “Локорин” характеризували також за показниками ЕКГ і порівнювали з диклофенаком натрію в дозі 8 мг/кг.
Гостру токсичність з розрахунком середньолетальних доз при внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введенні мишам та щурам проводили за методом Пастушенко Т.В. зі співавт., 1978. Ступінь токсичності визначали за класифікацією Сидорова К.К., 1973. Вплив вивчаємого екстракту на стан слизової оболонки шлунка та секрецію шлункового соку вивчали за методом Андрєєвої Н.І. та Шарової С.Д., 1978, на рухову активність ШКТ згідно з методом Sticknay I.S., 1951.
Експериментальні дані оброблені методами варіаційної статистики з використанням критерію Ст’юдента (t) (Иванов Ю.И., Погорелюк Р.Н.,1990).
Результати досліджень та їх обговорення. Результати скринінгових досліджень протизапальної дії екстракту “Локорин”, яка включає антиексудативну, анальгетичну та жарознижувальну активності, наведені на рисунках 1-3.
Показано, що вплив екстракту “Локорин” на розвиток карагенінового запалення залежав від дози, яку вводили щурам. В дозах 10 мг/кг та 25 мг/кг антиексудативна активність на 3-й годині досліду (пік запалення) дорівнювала 3,7% та 37,5%, відповідно (рис. 1). Найбільша антиексудативна активність була в дозі 50 мг/кг (47,1%). Подальше підвищення її до 100 мг/кг та 200 мг/кг призводило до зменшення фармакологічного ефекту. ЕД50 досліджуваного екстракту дорівнювала 50 мг/кг. Антиексудативна активність екстракту “Локорин” наближалась до активності диклофенаку натрію (53,9%) та перевищувала таку у кверцетину в 1,7 рази. Отримані дані свідчать про можливість вивчаємого екстракту впливати на простагландинову фазу карагенінового запалення і пригнічувати циклооксигеназу. Більш виразна активність в порівнянні з кверцетином, можливо, обумовлена хімічним складом екстракту “Локорин”, до якого окрім флавоноїдів входять оксикоричні кислоти, дубільні речовини, і здатністю фенольних рослинних речовин пригнічувати ферменти циклооксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти (Henry D.et al., 1996).
Рис.1. Скринінгове дослідження антиексудативної активності екстракту “Локорин” на моделі карагенінового запалення.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до кверцетину (р£ 0,05).
Анальгетичну активність на моделі “оцтовокислих корчів” у щурів екстракт “Локорин” проявив в усіх досліджуваних дозах, але виразна дія була притаманна дозам 50 мг/кг та 100 мг/ кг (57,7% та 56,2%, відповідно) (рис.2). При цьому за анальгетичною активністю він не поступався анальгіну (60,6%) та перевищував активність диклофенаку натрію (45,1%). Результати досліджень свідчать про вплив екстракту “Локорин” на периферичні компоненти механізму розвитку болю, одним з яких є пригнічення фази ексудації запальної реакції і зменшення механічного тиску на больові рецептори.
Рис.2. Скринінгове дослідження Рис.3. Скринінгове дослідження
анальгетичної активності жарознижувальної активності
екстракту “Локорин”. екстакту “Локорин”.
Примітки:
1.*- відмінність достовірна по відношенню до контрольної патології (р£ 0,05);
2.** - відмінність достовірна по відношенню до диклофенаку натрію (р£ 0,05).
Введення досліджуваного екстракту в різних дозах приводило до зменшення температури тіла у щурів з експериментальною лихоманкою (рис.3). Найбільшу жарознижувальну дію спостерігали в дозі 50 мг/кг (74,2 %). Підвищення дози до 200 мг/кг не виявило достовірного зменшення температури тіла у щурів. За жарознижувальною активністю екстракт “Локорин” у дозі 50 мг/кг перевищував ефект диклофенаку натрію в 1,3 рази, але значно поступався АСК. Ймовірно, антипірична дія екстракту проявляється за рахунок гальмування утворення простагландинів (ПГ).
Таким чином, наведені дані свідчать, що протизапальна дія екстракту “Локорин” у дозі 50 мг/кг може бути пов’язана із пригніченням циклооксигеназної активності
9-09-2015, 00:43