Метаболічні зміни в органах щурів за умов свинцево-кадмієвих токсикозів та їх корекція гепатопротекторами

інститут біології тварин УААн

Гнатик Оксана Йосипівна

УДК: 577.12:599.323.4

метаболічні зміни в органах щурів

за умов свинцево-кадмієвих токсикозів

та їх корекція гепатопротекторами

03.00.04 — біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Львів — 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському державному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник :

- доктор біологічних наук, професор, академік УААН, СНІТИНСЬКИЙ Володимир Васильович, Львівський державний аграрний університет, ректор, завідувач кафедри екології та біології.

Офіційні опоненти :

- доктор ветеринарних наук,КУРТЯК Богдан Михайлович, Начальник обласного управління ветеринарної медицинив Львівській області;

- доктор біологічних наук, професор,КЛІЩ Іван Миколайович,Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачовського,завідувач кафедри клінічної фармації.

Захист відбудеться „25” березня 2008 р. о 10⁰⁰ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. В. Стуса, 38).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою:

м. Львів, вул. Стуса, 38.

Автореферат розісланий „22” лютого 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради О. І. Віщур

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Захист навколишнього середовища від техногенного забруднення є одним із найважливіших завдань сучасності. Шкідливі викиди промислових підприємств, транспорту в навколишнє середовище на сьогодні досягли значних масштабів, а у великих промислових центрах суттєво перевищують допустимі санітарні норми. особливо гостро стоїть проблема забруднення довкілля важкими металами, левова частка яких припадає на кадмій і свинець. Ці метали належать до другого класу небезпечності і характеризуються не лише великою міграційною здатністю (у системі ґрунт-рослина, тварина-людина), а й високою кумулятивністю (Губський Ю. І., Ерстенюк Г. М., 2003).

Потрапляючи в організм дані метали в залежності від шляхів поступлення локалізуються у більшій чи меншій мірі в головному і кістковому мозку, легенях, серці, печінці, нирках, селезінці.

Свинець та кадмій, попадаючи в організм людини і тварин, легко зв’язуються з тіоловими групами апоферментів, чим порушують активність антиоксидантної, мікросомальної та інших ферментативних систем, порушують обмін макро- та мікроелементів, проявляють канцерогенну дію (Гонський Я. І. зі співавт., 2001).

Незважаючи на те, що в літературі є багато робіт, присвячених розкриттю механізмів негативної дії свинцю та кадмію на організм, проте актуальним залишається питання щодо функціональних змін та стану антиоксидантної системи у клітинах різних органів і тканин в умовах комбінованого впливу цих металів впродовж тривалого часу.

Численними дослідженнями доведена захисна роль селену та його сполук щодо зменшення окислювального стресу за умов дії важких металів (Снітинський В. В. зі співавт.,1994; Скакун М. П. та ін., 1996). Проте ряд аспектів антиоксидантної дії селену та його сполук у комплексі з гепатопротектором “Ліолів” за свинцево-кадмієвих токсикозів у тварин вивчена недостатньо.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно основного наукового напрямку кафедри екології та біології Львівського державного аграрного університету: “Дослідити екотоксикологічний вплив важких металів на процеси метаболізму в організмі рослин і тварин”, що є складовою теми: “Дослідити стан окремих компонентів екосистеми та розробити заходи щодо оптимізації їх функціонування в умовах техногенезу” (номер держреєстрації–0106U002074), в яких автор вивчала особливості впливу свинцю та кадмію на метаболічні процеси у внутрішніх органах тварин та методи їх корекції.

Мета і завдання дослідження. З’ясувати особливості функціонування захисних механізмів клітин органів та тканин, що характеризуються різною інтенсивністю метаболізму (печінка, нирки, легені, серце, головний мозок) за умов короткотривалого та довготривалого свинцево-кадмієвого токсикозу, а також розробити схеми корекції порушень цих систем за допомогою парентерального введення селеніту натрію та гепатопротектору “Ліолів”.

У відповідності до поставленої мети було визначено такі основні завдання дослідження:

1. Дослідити вплив короткочасного і довготривалого свинцево-кадмієвого токсикозу на динаміку приростів маси тіла та вагових коефіцієнтів внутрішніх органів щурів.

2. Встановити вплив короткотривалого і тривалого свинцево-кадмієвого токсикозу на: стан антиоксидантної системи внутрішніх органів; гематологічні показники; активність амінотрансфераз та лужної фосфатази у плазмі крові; рівень вітамінів А і Е у печінці; вміст іонів свинцю та кадмію у тканинах щурів.

3. З’ясувати можливість коригування та розробити методи корекції метаболічних змін у тканинах щурів за експериментального свинцево-кадмієвого токсикозу селенітом натрію та гепатопротектором “Ліолів”.

Об’єкт дослідження — токсичне ураження тканин, які характеризуються різною інтенсивністю метаболізму (кров, головний мозок, серце, легені, печінка, селезінка, нирки) на тлі роздільного і поєднаного введення солей свинцю та кадмію.

Предмет дослідження — гематологічні показники, активність ферментів амінотрансфераз, лужної фосфатази та стан антиоксидантної системи тканин і органів за умов токсичного впливу свинцю і кадмію та під впливом корекції селенітом натрію та ліолівом.

Методи дослідження: спектрофотометричні — метод визначення актив-ності супероксиддисмутази, глутатіонпероксидази, каталази, концентрацію малонового діальдегіду, гідропероксидів ліпідів, вмісту загального білка; фотоколориметричні — активності амінотрансфераз; методом високоефективної рідинної хроматографії на приладі “міліхром-4” — концентрацію вітамінів А і Е; методом інверсійної вольтамперометрії — вміст свинцю, кадмію, цинку, міді (аналізатор типу ПТУ-3); гематологічні. опрацювання результатів проводили з використанням ліцензованої комп’ютерної програми “Statistik”. Вірогідність розходжень між показниками оцінювали за критеріями Стьюдента.

Наукова новизна отриманих результатів. Досліджено біохімічні зміни в органах щурів, які характеризуються різною інтенсивністю метаболізму (головний мозок, серце, легені, печінка селезінка, нирки) та їх здатність до кумуляції іонів свинцю та кадмію за умов короткотривалого і довготривалого свинцево-кадмієвого токсикозу. Встановлено, що при комбінованому введенні досліджуваних важких металів, іонам свинцю властивий антагонізм по відношенні до іонів кадмію у нирках (при тривалому введенні) і головному мозку (при короткотривалій інтоксикації), тоді, як іони кадмію витісняють іони свинцю у тканинах печінки, селезінки, серця та легенів.

Вперше застосовано ліпосомальний гепатопротектор “Ліолів” при свинцево-кадмієвому токсикозі. Обґрунтовано доцільність сумісного використання ліоліву та селеніту натрію з метою корекції метаболічних порушень викликаних солями свинцю та кадмію.

Практичне значення отриманих результатів. З метою корекції метаболічних порушень в організмі щурів та нормалізації функціонування антиоксидантної системи при свинцево-кадмієвих токсикозах рекомендується сумісне введення тваринам селеніту натрію та ліоліву.

Особистий внесок здобувача. Проведено інформаційний пошук і аналіз даних літератури за темою дисертації. Особисто дисертантом здійснено біохімічні дослідження та статистичну обробку одержаних результатів, опрацьовано й узагальнено результати досліджень, підготовлено наукові публікації та виступи на конференціях. Обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником. Тварин утримували в віварії лабораторії токсикології ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок. Визначення біохімічних показників проводились на базі лабораторії ендокринної регуляції Інституту біології тварин УААН.

Апробація результатів дисертаційного дослідження. Про основні положення дисертаційної роботи доповідали: на засіданнях кафедри екології та біології і вченої ради агрономічного факультету ЛДАУ (2004‑2006 рр.); на звітних наукових конференціях аспірантів ЛДАУ (2004‑2006 рр.); на I Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів “Молодь і поступ біології” (Львів, 2005 р.); на Міжнародній науковій конференції “Ветеринарні препарати: розробка, контроль якості та застосування” (Львів, 2005 р.); на науково-практичній конференції Всеукраїнського товариства ветеринарних патологів з Міжнародною участю “Сучасні проблеми здоров’я і патології тварини” (Львів, 2006 р.); на Міжнародній науковій конференції студентів, аспірантів і молодих вчених до 190-річчя ХНАУ ім. В. В. Докучаєва “Екологізація сталого розвитку агросфери, культурний ґрунтогенез і ноосферна перспектива інформаційного суспільства” (Харків, 2006 р.); на ІІІ міжвузівській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Наука. Молодь. Екологія” (Житомир, 2007 р.).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 7 наукових праць, з яких 4 ‑ у фахових виданнях, що затверджені ВАК України, 3 роботи у матеріалах і тезах конференції та симпозіуму.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 142 сторінках й складається зі вступу, огляду літератури, схеми досліджень, матеріалів та методів, результатів досліджень, їх аналізу і узагальнення результатів, висновків і пропозицій виробництву, 6 додатків та списку використаної літератури із 251 джерела, у тому числі 94 — закордонних. Робота проілюстрована 13 таблицями та 19 рисунками, що складає 25 сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури . Висвітлено шляхи надходження, нагромадження, перерозподілу та виведення свинцю ацетату та кадмію хлориду з організму тварин. Показано вплив досліджуваних металів на стан антиоксидантної та детоксикаційної системи, перебіг вільнорадикальних процесів, а також основні шляхи корекції метаболічних порушень у тканинах гепатопротекторами.

Матеріали та методи досліджень. Експериментальні дослідження здійснювали протягом 2003‑2006 рр. у лабораторіях кафедри екології та біології ЛДАУ, лабораторії токсикології ДНДКІ ветпрепаратів та кормових добавок, лабораторії нейрогуморальної регуляції Інституту біології тварин УААН. Було закладено дві серії дослідів. Першу серію дослідів проводили на 24 щурах-самцях лінії Вістар, масою 200 – 220 г, з яких було сформовано чотири групи тварин: 1-ша — контрольна група (вводили питну воду через металевий зонд в об’ємі, який еквівалентний об'ємам водних розчинів солей Cd²⁺ і Pb²⁺ ); 2-га дослідна група — вводили 16,6 % водний розчин ацетату свинцю в дозі 250 мг/кг (що відповідає 1/20 DL₅₀ ); 3-тя дослідна група — вводили 0,029 % водний розчин хлориду кадмію в дозі 4,4 мг/кг (що відповідає 1/20 DL₅₀ ); 4-та дослідна група — вводили комбінацію свинцю ацетату та кадмію хлориду в дозах 125 та 2,2 мг/кг (що відповідає 1/40 DL₅₀ кожної з солей) (табл. 1).

Таблиця 1

Схема I серії досліду

Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. Щурів декапітували на 30 – тий день під легким ефірним наркозом. Після розтину у тварин брали кров, головний мозок, легені, серце, селезінку, печінку, нирки для біохімічних досліджень.

Другу серію дослідів проводили на 78 щурах-самцях лінії Вістар, масою 140 – 160 г сформованих у 13 груп. За контроль взяли 4‑ри групи тварин: 1-шій дослідній групі вводили питну воду через металевий зонд в об’ємі, який еквівалентний об'ємам водних розчинів солей Cd²⁺ і Pb²⁺ , 2-гій дослідній групі вводили через металевий зонд ацетат свинцю у дозі 1650 мг/кг (що відповідає 1/3 DL₅₀ ), 3-тій дослідній групі вводили через металевий зонд хлорид кадмію у дозі 29,3 мг/кг (що відповідає 1/3 DL₅₀ ), 4-тій дослідній групі вводили через металевий зонд комбінацію солей свинцю та кадмію у дозах 3300 та 58,6 мг/кг (що відповідає 1/6 DL₅₀ кожної з солей). Вводили солі досліджуваних металів протягом семи днів. У інших дослідних групах (5‑13) після семиденної інтоксикації, проводили семиденну корекцію шляхом внутрівенного (в/в) введення гепактопротектору “Ліолів” з розрахунку 15 мг/кг та внутрім’язевого (в/м) введення селеніту натрію з розрахунку 100 мкг/кг. на 14-тий день тварин декапітували під легким ефірним наркозом (табл. 2).

Таблиця 2

Схема II серії досліду

Після забою тварин брали внутрішні органи для біохімічних досліджень.стан пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) у досліджуваних органах (легенях, серці, печінці, селезінці, нирках, головному мозку) вивчали за концентрацією малонового діальдегіду (МДА) (Корабейникова Е. Н., 1989) та гідропероксидів ліпідів (ГПЛ) (Мирончика В. В., 1984), ферментної та неферментної ланок антиоксидантної системи (АОС) за активністю супероксиддисмутази (СОД) (Дубинина Е. Е., 1988), глутатіонпероксидази (ГП) (Моина В. М., 1988), каталази (КАТ) (Королёва М. А., 1988), концентрацією вітаміну А і Е методом високоефективної рідинної хроматографії на аналізаторі типу “Міліхром-4” (Спурихин В. И., 1991), функціональний стан мембранних структур за активністю аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ) (Горячковський А. М., 1994) та лужної фосфатази (ЛФ) (Мельников В. В., 1987). Методи клінічної гематології: підрахунок еритроцитів та лейкоцитів, визначення гематокриту, концентрації гемоглобіну за загальноприйнятими методиками (Кондрахин И. П., 1985). Концентрацію іонів свинцю та кадмію визначали методом інверсійної вольтамперометрії (анодна або катодна вольтамперометрії) на аналізаторі типу ПТУ-3 (Прохорова Г. В., 1998). опрацювання результатів проводили з використанням ліцензованої комп’ютерної програми “Statistik”. Вірогідність розходжень між показниками оцінювали за критеріями Стьюдента. У другій серії дослідів показники дослідних груп тварин (з токсичним ураженням важкими металами) прирівнювали до показників інтактних тварин, тоді як показники у щурів, яким проводили корекцію гепатопротектором та селенітом натрію прирівнювали до показників тварин з токсичним ураженням.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Клініка тривалого свинцево-кадмієвого токсикозу. Із літературних джерел відомо, що одним із ранніх симптомів свинцево-кадмієвих токсикозів є відмова тварин від корму, пригнічення та зниження маси тіла (Жиленко В. М., 2002), що ми і спостерігали у наших експериментах.

Зміни приростів маси тіла та вагових коефіцієнтів органів у щурів при тривалому свинцево-кадмієвому токсикозі. У результаті проведених досліджень у групах тварин, яким внутрішньошлунково вводили розчини солей важких металів, відмічали тенденцію до зниження приростів маси тіла у щурів (рис. 1).

Рис. 1. Прирости маси тіла у щурів при тридцятидобовому свинцево-кадмієвому токсикозі.

Примітка. В цьому та наступних рисунках:

1 ‑ контрольна група;

2 ‑ група уражена свинцем;

3 ‑ група уражена кадмієм;

4 ‑ група уражена свинцем та кадмієм.

Близькими до показників контрольної групи є прирости маси тіла щурів у третій дослідній групі, якій вводили хлорид кадмію. У другій — на 3,5 % та у четвертій — на 4 % прирости маси тіла щурів були меншими, в порівнянні з контрольною групою.

Зменшення приростів маси тіла щурів при дії іонів свинцю та кадмію супроводжувалися вірогідним збільшенням вагових коефіцієнтів нирок у четвертій групі — на 16,6 % (р<0,001) та у другій групі — на 19,0 % (р<0,01), тоді як у третій групі спостерігалась тенденція до зменшення.

Гематологічні показники у щурів при тридцятидобовому свинцево-кадмієвому токсикозі. Важливими показниками реакції організму на токсичну дію іонів свинцю та кадмію є кількість еритроцитів та вміст гемоглобіну. У всіх дослідних групах спостерігали достовірне зменшення кількості еритроцитів (р<0,001). У другій дослідній групі на 11,9 %, третій та четвертій — на 35,7 % і 42,1 % відповідно. Зменшення кількості еритроцитів не впливало на зміну гематокриту дослідних груп у порівнянні з контролем, тоді як середній об’єм еритроцитів зростав.

Кількість лейкоцитів у крові тварин зменшувалась, у порівнянні із контрольною групою: у другій дослідній групі на 21,3 % (р<0,05), у четвертій групі на 39,8 % (р<0,025), у третій групі спостерігалась тенденція до зменшення на 29,4 %. Лейкопенія, на нашу думку, пов’язана з системним ураженням важкими металами кровотворних органів тварин, які пригнічують лейкопоез.

Активність ферментів сироватки крові щурів при тривалій свинцево-кадмієвій інтоксикації. Як видно із рис. 2 комбіноване введення солей свинцю та кадмію зумовлює підвищення активності у сироватці крові щурів АлАт на 19,0 % (р<0,05) та АсАТ ‑ на 16,6 % (р<0,05), в порівнянні з контролем.

Рис. 2. Активність АлАт, АсАт та ЛФ у сироватці крові щурів при тривавлому свинцево-кадмієвому токсикозі.

Примітка. В цьому та наступних рисунках —* р < 0,05, ** р < 0,025, ***р < 0,01, **** р < 0,001 (по відношенню до контрольної групи).

Тенденція до зростання активності ензимів спостерігалася і в інших групах тварин, проте вірогідних змін не відзначено. Таке збільшення активності АлАт та АсАт у сироватці крові щурів вказує на порушення цілісності плазматичних мембран клітин різних органів, у першу чергу печінки. Підвищення активності даних ферментів при захворюванні печінки тісно корелюється з ступенем деструкції гепатоцитів.

Суттєві зміни спостерігалися і при визначенні ЛФ. Активність цього ензиму в тварин четвертої групи була більшою в 2,3 раза (р<0,01) в порівнянні з контрольною групою, а в другій та третій групах — на 75,9 % (р<0,025) та 72,4 % (р<0,01) відповідно.

к онцентрація вітамінів А і Е у печінці щурів на тридцяту добу ураження тварин солями свинцю і кадмію. печінка – основний орган кумуляції вітаміну А та Е, тому зміна концентрації цих вітамінів є важливим показником стану печінки. Ці вітаміни відносяться до неферментативної ланки антиоксидантної системи та відіграють важливу роль у підтриманні фізіологічного рівня кисневих радикалів.

З результатів наших досліджень видно, що під впливом солей досліджуваних токсичних металів концентрація вітамінів А і Е у печінці щурів значно знижувалась. Зокрема, концентрація ретинолу у щурів другої дослідної групи зменшилась відносно контрольної групи на 21,9 % (р<0,001), а у третій та четвертій — на 28,1 % (р<0,001) й 36,3 % (р<0,001) відповідно (рис. 3).

Рис. 3. Концентрації вітаміну А (а) та вітаміну Е (б) у печінці щурів при тривалій свинцево-кадмієвій інтоксикації.

Аналогічні зміни спостерігалися і при визначенні вмісту токоферолу у печінці. У тварин дослідної групи, ураженої свинцем, концентрація вітаміну Е знизилась на 24,0 % (р<0,001), ураженій кадмієм на 29,3 % (р<0,001). Інтоксикація тварин солями свинцю та кадмію призводить до зменшення вмісту цього вітаміну на 36,0 % (р<0,001), порівняно з контрольною групою.

Активність ферментів антиоксидантної системи та рівень ГПЛ та МДА у тканинах щурів за умовою тривалого свинцево-кадмієвого токсикозу. тканини внутрішніх органів щурів проявляють не однакову чутливість до дії іонів важких металів. Найбільший оксидаційний стрес спостерігався в печінці та нирках (рис. 4).

Рис. 4. Активність ферментів антиоксидантної системи та рівень ГПЛ та МДА у печінці щурів при тридцятидобовому свинцево-кадмієвому токсикозі.

а —


8-09-2015, 22:24