Гіпогомоцистеїнемічна дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

"ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ"

АРТЕМЧУК МИХАЙЛО АНДРІЙОВИЧ

УДК 591.2.001.5:615.03:577.16:612.014.463

ГІПОГОМОЦИСТЕЇНЕМІЧНА ДІЯ НОВОГО ВІТАМІННО-МІКРОЕЛЕМЕНТНОГО КОМПЛЕКСУ

(ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Вінницькому національному медичному університеті ім. М.І.Пирогова МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Луцюк Микола

Борисович, Вінницький національний медичний

університет ім. М.І.Пирогова, професор кафедри

загальної та біологічної хімії.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Французова Стелла Борисівна

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, м. Київ, старший науковий співробітник відділу загальної та молекулярної патофізіології;

доктор медичних наук, професор

Посохова Катерина Андріївна

Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я.Горбачевського МОЗ України, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології.

Захист відбудеться "18" червня 2008 р. о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 в ДУ "Інститут фармакології та токсикології" АМН України (03057, Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут фармакології та токсикології" АМН України (03057, Київ, вул. Ежена Потьє, 14).

Автореферат розісланий "__" травня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

Д 26.550.01

кандидат біологічних наукІ. В. Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Підвищений рівень гомоцистеїну (ГЦ) в плазмі крові, тобто гіпергомоцистеїнемія (ГГЦ), є незалежним фактором ризику прискореного розвитку серцево-судинної патології, у тому числі при атеросклерозі [F.Yang et al., 2005], гіпертонії [І.І. Андрушко та співавт., 2003], цукровому діабеті [S.A.Schafer et al., 2006; O. Essais et al., 2006], псоріазі [B.Vanizor Kural et al., 2003], нирковій недостатності [Н.А.Мухин и соавт., 2002] та інших хворобах і станах. З ГГЦ пов’язують також деякі порушення діяльності ЦНС (депресія, шизофренія, хвороби Альцгеймера та Паркінсона), виникнення дефектів розвитку в онтогенезі, рак прямої кишки [О.О.Пентюк та співавт., 2003; J.Weingaertner et al., 2005; F.G. de Souza et al., 2006]. Негативний вплив ГГЦ на організм реалізується шляхом пригнічення процесів метилювання, хімічної модифікації білків [J.Selhub, 1995], стимуляції оксидативного стресу [K.Sydow et al., 2003; N.Tyagi et al., 2005] та тромбогенезу [P.Hainaut et al., 2002; D. Genser, 2003], впливу на експресію генів [Y.Hu, 2001] та інші процеси. Підтвердженням значної ролі ГГЦ у прогресуванні серцево-судинної патології є і те, що призначення гіпогомоцистеїнемічної терапії призводить не лише до зниження рівня ГЦ в плазмі крові, але і до позитивної динаміки з боку серцево-судинної системи та покращення функції ендотелію [К.П. Постовітенко, 2006; L.M.Title et al., 2000; G. Schnyder et al., 2002]. За даними Z.Ceperkovic (2006), зниження рівня ГЦ в крові на 3 ммоль/л зменшує частоту ішемічної хвороби серця на 16 %, тромбозів на 25 %, серцевих нападів – на 24 %.

Причиною ГГЦ можуть бути явна або прихована недостатність вітамінів В₆ , В₉ , В_12, порушення на генетичному рівні синтезу ферментів, що беруть участь в метаболізмі цих вітамінів, ниркова недостатність, діабет, псоріаз, інші захворювання, шкідливі звички та деякі лікарські препарати [F. De Bree et al., 2002].

Наведені дані свідчать, що боротьба з ГГЦ є актуальною медичною проблемою. В наш час для зниження рівня ГЦ в крові рекомендують такі заходи, як раціональне харчування, пропаганда здорового способу життя, а також застосування ліків, що мають гіпогомоцистеїнемічну дію(вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ , рибофлавіну, холіну, креатин- та бетаїн-вмісних ліків та інших). Найчастіше використовують високі дози вітамінів В₆ , В₉ , та В₁₂ - кожного окремо або комплекси, в яких дози вказаних вітамінів значно перевищують фізіологічні, причому не було виявлено токсичну дію великих доз цих вітамінів [P.Durand et al., 2001]. В клінічних умовах найбільшу гіпогомоцистеїнемічну активність виявила певна комбінація вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ [R.Clark, 1998], тривале застосування якої призвело до вірогідного зниження рівня ГЦ в крові, але не нормалізувало його.

Хоча мікроелементи мають високу біологічну активність, в літературі відсутні дані щодо застосування вітамінно-мікроелементних комплексів як гіпогомоцистеїнемічних засобів. В зв’язку з цим, пошук нових препаратів гіпогомоцистеїнемічної дії, у тому числі серед вітамінно-мікроелементних комплексів, є важливим завданням фармакології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової наукової роботи кафедри загальної та біологічної хімії ВНМУ ім. М.І. Пирогова (УДК: 615.22:262, № державної реєстрації 0101U002832), а також згідно договору з Інститутом фармакології та токсикології АМН України „Створення нового лікарського засобу антиатеросклеротичної дії на основі комплексу вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ та мікроелементів” від 01.11.2001 р. та 02.02.2004 року.

Мета роботи. На основі експериментальних досліджень встановити лікувально-профілактичні властивості нового вітамінно-мікроелементного комплексу при гіпергомоцистеїнемії.

Задачі дослідження.

1. Відтворити на білих щурах-самцях три експериментальні моделі ГГЦ – гостру метіонінову, хронічну метіонінову та гіповітамінозно-метіонінову.

2. На моделях гострої та хронічної метіонінової ГГЦ дослідити профілактичну гіпогомоцистеїнемічну активність нового вітамінно-мікроелементного комплексу та препаратів порівняння.

3. На моделі хронічної метіонінової ГГЦ вивчити лікувальну гіпогомоцистеїнемічну дію вітамінно-мікроелементного комплексу (ВМК), препаратів порівняння та їх антиоксидантну здатність.

4. На моделі комбінованої (гіповітамінозно-метіонінової) ГГЦ дослідити в динаміці вплив ВМК та препаратів порівняння на рівень ГЦ в плазмі крові, вітамінний статус тварин, а також гематологічні зрушення, показники оксидативного стресу та ендотоксикозу, індуковані ГГЦ.

5. Дослідити дозозалежну гіпогомоцистеїнемічну дію ВМК в умовах гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ.

6. Дослідити зміни мікроскопічної будови внутрішніх органів щурів (серце, легені, нирки, печінка, шлунок, кишківник, сім’яники, сітківка ока та головний мозок) за гіповітамінозно-метіонінової ГГЦ та здатність ВМК в цих умовах відновлювати порушену структуру органів.

Об’єкт дослідження : гіпергомоцистеїнемія.

Предмет дослідження: лікувально-профілактична дія нового вітамінно-мікроелементного комплексу на моделях гіпергомоцистеїнемії.

Методи дослідження: фармакологічні, біохімічні, гематологічні, мікробіологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна дослідження. Достеменно підтверджено, що гіповітамінозно-метіонінова ГГЦ супроводжується пошкодженням судинного русла внутрішніх органів, у т.ч. серця, легень, нирок та печінки. Досліджено основні сторони фармакологічної дії ВМК та встановлено переваги його активності на досліджених моделях гіпергомоцистеїнемії у щурів: нормалізації відхилень, індукованих ГГЦ у порівнянні з певною комбінацією вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ [R.Clark, 1998] та препаратом “Декамевіт”. Вперше показано, що композиція мікроелементів на основі координаційних сполук цинку та хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою та ванадатом амонію підсилює специфічну гіпогомоцистеїнемічну дію вітамінів В₆ , В₉ та В₁₂ . Вперше запропонована класифікація гіпогомоцистеїнемічних лікарських засобів, заснована на аналізі механізму їх дії.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені експериментальні дослідження показали доцільність застосування ВМК, що містить вітаміни В₆ , В₉ , В₁₂ та мікроелементи Zn, Cr, V, з профілактично-лікувальною метою при ГГЦ. На основі літературних та власних даних у співавторстві розроблені методичні рекомендації “Доклінічні дослідження гіпогомоцистеїнемічної дії потенційних лікарських засобів”.

Впровадження результатів дослідження в практику. За результатами дослідження отримано 1 патент України на винахід. Основні положеннядисертації використовуються в навчальному процесі на кафедрах Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова (кафедри фармакології, патологічної анатомії), Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського (кафедра медичної хімії), Буковинського державного медичного університету (кафедри фармації та медичної хімії), Ужгородського національного університету (кафедра біохімії і фармакології).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз даних літератури за темою дисертації, опрацьовано моделі, згідно з якими особисто виконано експериментальні дослідження. Дисертант самостійно провів статистичну обробку та аналіз первинного матеріалу, написав всі розділи дисертації, сформулював висновки та практичні рекомендації. Мікробіологічні дослідження проведені на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. – проф. Г.К. Палій), гістологічні – на кафедрі гістології та ембріології ВНМУ ім. М.І. Пирогова (зав. каф. – проф. М.С. Пушкар), гістохімічні у відділі морфології ІФТ АМН України (зав. відділом – ст.н.с. О.В. Сергієнко), за що дисертант їм щиро вдячний.

Апробація результатів дослідження. Результати роботи були оприлюднені на науково-практичних конференціях “Біопсихосоціальні аспекти здоров’я: здоров’я здорових” (Вінниця, 2004), "Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини" (Тернопіль, 2004), “Новітні технології у медицині” (Вінниця, 2005), на ІХ з'їзді Всеукраїнського Лікарського Товариства (Вінниця, 2007).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць: 5 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 4 тез в матеріалах наукових конференцій і з’їздів, 1 методичні рекомендації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 174 сторінках машинопису та містить 30 таблиць, 32 рисунки (з них 27 мікрофотографій). Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження, моделювання гіпергомоцистеїнемії», 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який включає 270 джерелo, у тому числі 211 зарубіжних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Предметом експериментального дослідження був новий вітамінно-мікроелементний комплекс, розроблений сумісно співробітниками Інституту фармакології та токсикології АМН України та ВНМУ ім. М.І. Пирогова, який містить суміш координаційних сполук цинку, хрому з N-2,3-диметилфенілантраніловою кислотою (HL), ванадат амонію та специфічні для лікування гіпергомоцистеїнемії вітаміни: В₆ – піридоксин, В₉ – фолієва кислота , В₁₂ – ціанокобаламін. Один грам суміші містить: ZnL₂ ·2H₂ O – 127 мг (Zn²⁺ – 14 мг), CrL₃ ·2H₂ O – 1,64 мг (Cr³⁺ – 105 мкг), (NH₄ )₃ VO₃ – 38 мкг (V⁵⁺ – 13 мкг), В₆ – 10 мг, В₉ – 2 мг, В₁₂ – 0,2 мг та допоміжні речовини.

Вибір цих мікроелементів зумовлений тим, що ферменти метилювання гомоцистеїну (метіонінсинтетаза та бетаїнгомоцистеїнтрансфераза) є Zn-залежними металоензимами [C.W.Goulding et al., 1997; N.S.Millian et al., 1998; J.L.Ferrer et al., 2004; S.Ratnam et al., 2006], а більшість мікроелементів, у тому числі ванадій та хром, є незалежними чинниками нормального функціонування серцево-судинної системи [А.В.Кудрин, О.А.Громова, 2006]. Вважають, що вітамінно-мінеральні комплекси виявляють високу біологічну та лікувальну активність, при включені до них легкозасвоюваних форм мінеральних солей [Г.С. Григор’єва та співавт., 2004]. В зв’язку з цим, до складу ВМК включені сполуки цих мікроелементів. Для порівняння використані два препарати, близькі до ВМК по вітамінному складу. Першим препаратом порівняння (ПП-1) слугувала композиція, описана в роботі R.Clark (1998), яка в клінічних умовах у порівнянні з 19 іншими комбінаціями вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ виявляє найвищий гіпогомоцистеїнемічний ефект. Ця композиція включає високі добові дози вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ – 10,0; 1,0; 0,4 мг, відповідно, і забезпечує зниження рівня ГЦ в крові пацієнтів з ГГЦ майже на 60%. В якості іншого препарату порівняння (ПП-2) використано відомий в Україні полівітамінний комплекс “Декамевіт” – єдиний з полівітамінних препаратів, що містить в одній таблетці високі дози вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ – 20,0; 2,0; 0,1 мг, відповідно.

ВМК та препарати порівняння в тривалих дослідах (10-20 діб) вводили тваринам з дієтою, в короткочасних дослідах – за допомогою зонду в шлунок. Добове дозування ВМК та препаратів порівняння: тваринам на 1 кг маси тіла вводили дози, що в 5 разів перевищують передбачені для людини. Так, у випадку ВМК щури в якості добової дози вітамінів В₆ , В₉ , В₁₂ отримували 715; 143; 14,3 мкг/кг маси тіла, та мікроелементів: Zn²⁺ – 1 мг/кг, Cr³⁺ – 7,5 мкг/кг, V⁵⁺ – 0,93 мкг/кг, в той час як для людини пропонована добова доза цих компонентів в складі ВМК – 143; 28,6; 2,86 мкг/кг та 0,2 мг/кг; 1,5 мкг/кг; 0,186 мкг/кг, відповідно.

Тварини та дієти . Експериментальні дослідження проведені на 377 статевозрілих білих щурах-самцях з масою тіла 200±30 г. Тварин утримували на напівсинтетичній крохмально-казеїновій дієті з контрольованим вмістом всіх нутрієнтів, яку модифікували в залежності від мети експерименту.

Моделі ГГЦ . Використані три моделі гіпергомоцистеїнемії – гостра метіонінова, хронічна метіонінова та комбінована гіповітамінозно-метіонінова (ГМГ). Вказані моделі дозволяли підвищити рівень ГЦ в плазмі крові експериментальних тварин: за гострої ГГЦ ~ в 5 разів, за хронічної ГГЦ – в 1,5-2 рази, за ГМГ – в 11-13 разів.

Біохімічні, мікробіологічні та гематологічні дослідження . Досліджували кров, плазму або сироватку крові, гомогенати печінки та нирок. Вміст ГЦ в плазмі крові визначали на апараті Hewlett Packard (США) з використанням колонки Hypersil BDS C-18 методом високоефективної рідинної хроматографії в модифікації [О.О. Пентюк та співавт., 2001]. Рівень білка визначали уніфікованим біуретовим методом [В.В. Меньшиков, 1987], середні молекули (СМ), як показник ендотоксикозу, методом [Н.И. Габриэлян, В.И. Липатова, 1984], малоновий діальдегід (МДА) – за допомогою тіобарбітурової кислоти [В.Н. Орехович, 1977], гідроперекиси (ГП) методом [В.Б. Гаврилов, М.И. Мишкорудная, 1983], карбонільні групи (КГ) білків реакцією з фенілгідразином [H. Refsgaard, 2000]. Визначали забезпеченість тварин, що перебували на гіповітамінозно-метіоніновій дієті, вітамінами – фолієвою кислотою (прямим методом) та вітамінами В₆ і В₁₂ (непрямими методами). Вміст фолату в плазмі крові визначали мікробіологічним методом за допомогою фолатдефіцитного штаму Lactobacillus casei АТСС 7469 [Ю.М. Островский, 1979], статус вітаміну В₆ – по активності в печінці ферментів АСТ та АЛТ [В.В. Меньшиков, 1987], вітаміну В₁₂ – по екскреції з сечею метилмалонової кислоти [Л.В.Снегирева, 1972]. Вміст гемоглобіну визначали за допомогою геміглобінціанідного методу, кількість еритроцитів та лейкоцитів – в камері Горяєва. Ці дослідження виконані в акредитованій для біохімічних досліджень науково-дослідній клініко-діагностичній лабораторії ВНМУ ім.М.І.Пирогова (завідувач лабораторією професор О.О. Пентюк).

Морфологічні дослідження . Протягом експерименту визначали мікроскопічну будову внутрішніх органів шляхом зафарблення зрізів тканин гематоксиліном та еозином і гістохімічними методами [Н.З. Слінченко, 1964], Picro-Mallory V [Д.Д.Зербино, Л.Л. Лукасевич, 1989] для виявлення наявності в судинах фібрину та його “віку”.

Статистичні методи . Отримані цифрові дані підлягали обробці за допомогою методів варіаційного аналізу з використанням пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windows 98. Підраховували середні значення критеріїв, а також середньоквадратичні відхилення (М±m). Використовували також універсальні статистичні пакети до персонального комп’ютера “Exсel”. Для визначення зв’язків між показниками використовували кореляційний аналіз (з вираховуванням r) по Пірсону [Е.В.Гублер, 1978]. Достовірною вважалась різниця за Р≤0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Виявлено, що протягом експериментів, проведених на трьох моделях ГГЦ, у тому числі на гіповітамінозно-метіоніновій, використані дієти забезпечують нормальний приріст маси тіла тварин всіх груп, крім того щури візуально мають звичайний вигляд та поведінку. Відсутність негативного впливу на масу тварин гіповітамінозно-метіонінової дієти пояснюється тим, що в дослід були взяті дорослі, а не молоді тварини та відносно невеликою (14 діб) тривалістю дослідів. Характерно, що ВМК та препарати порівняння не справляли помітної негативної дії на загальний стан тварин, а також не виявили здатності гальмувати чи стимулювати їх ріст.

1. Дослідження на моделі гострої метіонінової ГГЦ

На цій моделі вивчена профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння. Суть моделі полягає в тому, що тваринам одноразово, зондом в шлунок вводять велику кількість L-метіоніну - по 1 мл 5 % розчину на 100 г маси тіла. При цьому через 2 години рівень ГЦ в плазмі крові досягає максимуму. Профілактика полягала в попередньому протягом 10 діб введенні щурам через рот за допомогою зонду ВМК або препаратів порівняння, утриманні на дієті збагаченій ВМК. Отримані дані наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Порівняльна профілактична гіпогомоцистеїнемічна дія ВМК та препаратів порівняння (ПП-1 та ПП-2) на моделі гострої метіонінової ГГЦ (М±m)

Примітки:

1. * - Р≤0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

2. # - Р≤0,05 у порівнянні з дією ВМК (група 3).

Виявлено, що попереднє введення тваринам ВМК та препаратів порівняння достовірно знизило гіпергомоцистеїнемічну дію L-метіоніну. Ефективність ВМК та ПП-1 була рівною і вищою, у порівнянні з ПП-2. Характерно, що введення ВМК за допомогою зонду або з дієтою в умовах гострої ГГЦ було однаково ефективним (зниження рівня ГЦ на 65,4 та 66,7 %, відповідно).

2. Дослідження на моделі хронічної метіонінової ГГЦ

Суть цієї моделі ГГЦ полягає в згодовуванні тваринам протягом 14 діб дієти, збагаченої L-метіоніном (1 % до сухої маси). Профілактика полягала у тому, що тварини певних груп отримували дієту, збагачену не тільки L-метіоніном, але і ВМК або препаратами порівняння. Лікування ГГЦ та ускладнень, індукованих ГГЦ, здійснювали шляхом щодобового введення тваринам з ГГЦ в шлунок зондом протягом 3 діб ВМК або препаратів порівняння. Отримані дані наведені в табл. 2.

Таблиця 2

Порівняльна профілактична та лікувальна дія ВМК, ПП-1 та ПП-2 на динаміку біохімічних показників крові щурів на моделі хронічної метіонінової гіпергомоцистеїнемії (М±m)

Примітки:

1. * - Р≤0,05 у порівнянні з інтактним контролем;

2. # - Р≤0,05 у порівнянні з контролем ГГЦ.

Виявлено, що збагачення метіонінової дієти ВМК (група 3), як і ПП-1 (група 4), повністю попереджає гіпергомоцистеїнемічний ефект L-метіоніну, в той час як дія ПП-2 була слабшою (Р<0,05). Лікувальна дія всіх трьох композицій була рівною. Хронічна метіонінова ГГЦ (група


8-09-2015, 21:58