МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Станішевська Наталія Володимирівна
УДК 616-08: 616-008.921.1-008.64-021.7.
ВПЛИВ ІШЕМІЧНОГО ПРЕДСТАНУ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНУ АДАПТАЦІЮ СЕРЦЯ ДО НЕКРОЗУ МІОКАРДА ПРИ ВВЕДЕННІ АЛКІЛСЕЛЕНОНАФТИРИДИНУ
(експериментальне дослідження)
14.03.04 – патологічна фізіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук
Харків – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Луганському національному педагогічному університеті імені Тараса Шевченка МОН України.
Науковий керівник доктор медичних наук, професор
Виноградов Олександр Анатолійович, Луганський національний педагогічний університет імені Тараса Шевченка МОН України, завідувач кафедри анатомії, фізіології людини й тварин.
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Коляда Тетяна Іванівна, Державна установа «Інститут мікробіології та імунології ім.І.І. Мечникова АМН України», м. Харків, завідувач лабораторії клінічної імунології та алергології;
доктор медичних наук, професор
Флегонтова Вероніка Валентинівна, Луганський державний медичний університет, професор кафедри патологічної фізіології.
Захист відбудеться 10 квітня 2008 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.03 при Харківському національному медичному університеті (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).
Автореферат розісланий 07 березня 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук, доцент О.Ю. Степаненко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Серцево-судинна патологія є однією з актуальних проблем сучасної медицини (Р.Г. Органов, 1999; Е.И. Чазов, 2001; В.М. Коваленко с соавт., 2002; Ю.Н. Колчин с соавт., 2003, 2005; Е.Н. Амосова, 2004; Н.І. Лутай, А.І. Митченко, 2004). За несприятливих умов, наприклад: стрес, гіпоксія, аутоімунна реакція, чи в експерименті з адреналіновою інтоксикацією може розвинутися некоронарогенний некроз міокарда – НМ (Р.А. Серов с соавт., 1977; А.А. Виноградов, Н.А. Панкратьев, 2006, 2007; С.Ю. Некрасов, 2006). Проте є дані про те, що короткі періоди гіпоксії, навпаки, сприяють підвищенню резистентності міокарда до гіпоксичних пошкоджень. Цей кардіопротекторний механізм був названий «ischemic preconditioning» («ішемічний предстан» – ІПС). Окремі науковці вказують на те, що цей неспецифічний феномен є результатом дії стрес-стимулу, при якому підвищується толерантність клітин до наступних стрес-стимулів (R. Strasser et al., 1996; F. Tomai et al., 1999; H. T. Sommerschild et al., 2000). При цьому виникає пізній захист міокарда через 24 год після ІПС (R. Strasser et al., 1996).
За даними літератури, при моделюванні НМ відразу після гіпоксичного тренування 60% тварин гине у перші 4 години експерименту. При моделюванні НМ через 24 год після гіпоксичного тренування встановлено стовідсоткове виживання тварин (С.Ю. Некрасов, 2006). Між тим є протилежні дані про вплив як гіпоксичного тренування, так і ІПС (R. Lerch еt al., 1997; R. Ferrari et al., 1998; Y. T. Xuan et al., 1999; M. Hill et al., 2001 та ін). Даний факт дає підстави для медикаментозного пролонгування ІПС з метою підвищення толерантності міокарда до гіпоксії (R. Strasser et al., 1996; F. Tomai et al., 1999; H. T. Sommerschild et al., 2000).
Дисбаланс між оксидантами та антиоксидантами за гіпоксичних умов призводить до нейродегенерації (M. A. Ansari et al., 2004). Тому актуальним є вивчення дії антиоксидантів при розвитку некоронарогенного НМ у різні періоди ІПС. Особливий інтерес викликають антиоксидантні властивості деяких селенопротеїнів (E. M. Alissa et al., 2003). Припускають, що функції селену реалізуються через селенопротеїни, в яких селен утримується у складі специфічних амінокислот (E. M. Alissa et al., 2003; J. Chen, M. J. Berry, 2003).
Дослідженнями на тваринах встановлено, що нестача селену викликає кардіоміопатію та раптову смерть. У людей нестача селену є етіологічним фактором розвитку серцево-судинної патології (E. M. Alissa et al., 2003). Це може бути важливим при поясненні патофізіології серцево-судинних захворювань (E. Demirel-Yilmaz et al., 1998).
Однак механізми кардіопротекторної дії ІПС і роль селенопротеїнів у підвищенні толерантності міокарда до НМ вивчені недостатньо.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є частиною науково-дослідної роботи кафедри анатомії, фізіології людини й тварин Луганського національного педагогічного університету імені Тараса Шевченка за номером державної реєстрації 019800026641 «Механізми адаптації до факторів навколишнього середовища». Автор є виконавцем одного з напрямків, який стосується вивчення механізмів адаптації органів і систем в нормі та при експериментальній патології.
Мета дослідження – визначити вплив селенопротеїну – алкілселенонафтиридину (АСНР) – на ефективність ішемічного предстану у підвищенні резистентності організму та морфофункціональної адаптації серця до некоронарогенного НМ.
Відповідно до мети дослідження було поставлено такі завдання:
Визначити морфофункціональні ознаки адаптації серця у тварин, які вижили протягом 6 год від початку моделювання НМ.
Визначити морфофункціональні ознаки адаптації чи дизадаптації серця у тварин, які загинули протягом 6 год від початку моделювання НМ.
В експерименті вивчити морфофункціональні прояви адаптації міокарда до ІПС. Визначити морфофункціональні ознаки адаптації/дизадаптації міокарда до НМ в різних стадіях ІПС.
Вивчити морфофункціональні ознаки адаптації міокарда до уведення в організм АСНР. Вивчити вплив АСНР на можливість підвищення ефективності ІПС у збільшенні резистентності та морфофункціональної адаптації серця до НМ.
Об’єкт дослідження: адаптація серця до НМ.
Предмет дослідження: вплив АСНР на ефективність ІПС у підвищенні резистентності організму в цілому та серця зокрема до розвитку НМ.
Методи дослідження: патофізіологічні (моделювання НМ до ІПС та після нього без уведення АСНР та при ньому), морфологічні (гістологічні дослідження та морфометрія), функціональні (ЕКГ, визначення вмісту води, експозиційної динаміки сорбції – ЕДС, активності каталази в міокарді шлуночків серця та внутрішньошкірної напруги кисню – РО2), статистичні.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в експерименті комплексно вивчено вплив АСНР на прояви морфофункціональної адаптації міокарда до ІПС і НМ. Визначено, що морфофункціональні прояви адаптації міокарда шлуночків серця пов’язані зі зміною маси, збільшенням ЕДС, підвищенням вмісту води на тлі зниження внутрішньошкірної РО2 і підвищення активності каталази в міокарді шлуночків серця.
Встановлено, що при моделюванні НМ у першому періоді ІПС 60% тварин гине у перші 4–5 годин від початку експерименту. При цьому в міокарді шлуночків серця визначено прояви дизадаптації міокарда з грубими осередками дистрофічних пошкоджень міокарда з ознаками некрозу, збільшення ЕДС, підвищення вмісту води й активності каталази з різким зниженням внутрішньошкірної РО2. При моделюванні НМ у другому періоді ІПС визначено стовідсоткове виживання тварин і зменшення дистрофічних змін у міокарді, зниження рівня ЕДС і вмісту води, підвищення внутрішньошкірної РО2. Встановлено, що у першому періоді ІПС у міокарді виникають транзиторні дистрофічні зміни, які негативно впливають на морфофункціональну адаптацію серця до розвитку НМ.
Уперше встановлено, що АСНР підвищує резистентність міокарда до розвитку НМ та збільшує кардіопротекторний вплив ІПС.
Дано кількісні характеристики маси міокарда шлуночків серця, ЕДС, вмісту води, активності каталази в міокарді та внутрішньошкірної РО2 при розвитку адаптації до НМ до ІПС і після нього, а також при попередньому уведенні АСНР.
Практичне значення одержаних результатів. Встановлено, що у другій стадії ІПС здійснюється кардіопротекторний вплив при моделюванні НМ. Розроблено методику уведення АСНР дрібним лабораторним тваринам, а також пристрій для моделювання ІПС у експериментальних тварин і спосіб вимірювання внутрішньошкірної РО2. У навчальний процес уведені теоретичні аспекти впливу ІПС у різних його стадіях на розвиток НМ. Упроваджено 6 раціоналізаторських пропозицій.
Особистий внесок здобувача. Самостійно проведено патентний пошук та аналіз наукової інформації з проблеми, що вивчається, обґрунтовано актуальність і визначено мету і завдання дослідження, розроблено та впроваджено деякі методи дослідження, виконано експериментальну частину роботи, оброблено та описано одержані результати, проведено статистичні дослідження. Написано всі розділи дисертації й автореферат.
Апробація результатів дослідження. Матеріали дослідження апробовані на конференціях молодих вчених Луганського державного медичного університету (Луганськ, 2005–2006); конференціях молодих вчених Луганського національного педагогічного університету імені Тараса Шевченка (Луганськ, 2005–2007); IV та VI Міжрегіональній конференції «Актуальні питання біології та медицини» (Луганськ, 2005, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 наукових праць, із них 6 статей, в тому числі 5 у спеціалізованих виданнях, затверджених ВАК України, 3 тези у матеріалах конференції.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, двох розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень та висновків. Дисертація викладена на 153 сторінках, включає 9 таблиць і 51 рисунок, які займають 31 повну сторінку. Список літератури містить 117 літературних джерел, із них 82 латиницею.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Робота виконана на 80 щурах-самцях лінії Wistar масою 187–280 г. Утримання й догляд за тваринами (включаючи анестезіологічне забезпечення та евтаназію) здійснювали відповідно до чинних наказів, які регламентують організацію роботи з використанням експериментальних тварин, і з дотриманням принципів «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 1985), а також рішення Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001).
Тварин було розподілено на контрольну й дослідні групи. До контрольної групи увійшло 10 інтактних тварин, до дослідних – 70 (7 груп по 10 щурів у кожній). У тварин дослідних груп вивчали функціональні й морфологічні показники: у щурів першої групи – після моделювання ІПС; у тварин другої групи – після моделювання некоронарогенного НМ; у тварин третьої і четвертої груп – після моделювання некоронарогенного НМ відразу і через 24 год після моделювання ІПС; у тварин п’ятої групи – після уведення АСНР (№ 7498352, «Довідник Бейльштейна») у дозі 180 мкг/100 г маси тварини (M. A. Ansari et al., 2004); у тварин шостої групи – після моделювання некоронарогенного НМ на тлі уведення АСНР; у тварин сьомої групи – при моделюванні НМ після ІПС на тлі уведення АСНР.
ІПС моделювали з утриманням тварин у гіпоксичному середовищі (10 об’ємних% О2) протягом 30–40 хв (H. T. Sommerschild, K. A. Kirkeboen, 2000). Термін утримання у гіпоксичному середовищі залежав від стану тварин. НМ моделювали за методикою Р.А. Серова зі співавт. (1977) шляхом внутрішньочеревного уведення токсичної дози адреналіну (sol. Adrenalini hydrochloridi 0,1% з розрахунку 0,25 мл/100 г маси тварини).
Електричну активність міокарда вивчали шляхом аналізу ЕКГ. Запис ЕКГ виконували портативним електрокардіографом УКОМ-1 в 3 стандартних відведеннях. Внутрішньошкірну РО2 вимірювали за допомогою транскутанного оксигемометра Radiometer TCM-2 (Данія). Стан антиоксидантної системи визначали за активністю каталази в гомогенаті міокарда шлуночків серця (М.А. Королюк зі співавт., 1988). Порушення проникності оболонки міоцитів визначали за ЕДС (О.А. Виноградов, 1989). Вміст води у міокарді правого (ПШ) та лівого (ЛШ) шлуночків серця визначали за методикою Ю.В. Исакова та М.В. Ромасенко (1986). Зміни маси міокарда вивчали шляхом роздільного зважування шлуночків серця у перерахунку на 100 г маси тварини. Гістологічні препарати забарвлювали гематоксиліном – основним фуксином – пікриновою кислотою (Р.А. Серов с соавт., 1977).
Цифрові дані обробляли методами варіаційної статистики за допомогою ліцензованої комп’ютерної програми Microsoft Excel. Визначали: середню арифметичну вибірки (M); помилку середньої арифметичної вибірки (±m); імовірність помилки (р<); коефіцієнт кореляції (Rxy); помилку коефіцієнта кореляції (±mr).
Результати дослідження та їх обговорення. Визначено, що морфофункціональні прояви адаптації серця до ІПС полягали у збільшенні маси міокарда ПШ і ЛШ, підвищенні ЕДС і вмісту води. При цьому знижувалася внутрішньошкірна РО2 й активність каталази в гомогенаті міокарда шлуночків серця. На гістологічних препаратах, забарвлених гематоксиліном – основним фуксином – пікриновою кислотою, виявлено фуксинофільні осередки, що вказували на метаболічні зміни у міокарді. Виявлені ознаки морфофункціональної адаптації серця були виражені неоднаково та залежали від стадії ІПС.
При моделюванні НМ загинуло 40% тварин. Морфофункціональні зміни серця полягали у збільшенні маси ПШ на (31,3±7,2)% (Rxy±mr=0,897±0, 196 при p<0,01), а ЛШ – на (16,1±1,0)% (Rxy±mr=0,937±0,123 при p<0,001). На гістологічних препаратах виявлено грубі осередки гіпоксичних пошкоджень міокарда аж до некрозу. М’язові волокна були деформовані, ядра слабко забарвлені. При порівняльному аналізі ступеня гіпоксичного пошкодження міокарда ПШ і ЛШ серця виявлено більш грубі зміни м’язових волокон у міокарді ЛШ. У проекції міжшлуночкової борозни, в перехідній зоні між ЛШ і ПШ, осередки геморагій з великою інфільтрацією. Дифузна геморагійна інфільтрація була визначена також у міокарді ПШ. Виявлені фуксинофільні осередки, які, за даними Р.А. Серова зі співавт. (1977), вказують на грубі метаболічні зміни в міокарді.
Наявність метаболічних змін підтверджували результати дослідження ЕДС – показника, який, за даними О.А. Виноградова (1998, 2001), має досить високу чутливість до зміни функціонального стану тканин. Показники ЕДС і вмісту води в шлуночках серця були значно підвищені відносно контрольних – (9,2±0,1) мкг/мг (p<0,01) і (83,82±0,45)% (p<0,05) відповідно при контрольних показниках (6,03±0,46) мкг/мг і (80,35±0,37)%. У ПШ середній показник ЕДС дорівнював (9,2±0,1) мкг/мг (p<0,01), у ЛШ – (9,35±0,08) мкг/мг (p<0,01), а вміст води – (84,34±0,46) і (83, 19±0,61)% відповідно (p<0,05 в обох випадках).
Вміст води в міокарді шлуночків серця після моделювання некоронарогенного НМ у тварин був більше контролю: у ПШ – в (1,040±0,003) раза (Rxy±mr=0,840±0, 192 при p<0,01), а в ЛШ – в (1,050±0,001) раза (Rxy±mr=0,997± 0,027 при p<0,001). Показники ЕДС перевищували контроль в (1,590±0,133) раза (Rxy±mr=0,981±0,069 при p<0,001) і в (1,500±0,056) раза (Rxy±mr=0,905±0,151 при p<0,001). При порівнянні результатів дослідження встановлено, що вміст води в міокарді шлуночків серця не залежав від рівня ЕДС при моделюванні НМ. Аналогічна думка була висловлена О.А. Виноградовим (1998, 2004) при вивченні ЕДС і вмісту води в головному мозку при розвитку гострого набряку-набухання. Активність каталази в гомогенаті міокарда шлуночків серця різко знижувалася – до (65,35±4,72) мМ/хв при p<0,001 відносно контрольного показника – (105,92±1,78) мМ/хв, а внутрішньошкірна РО2 у перші 2 години експерименту – до (26,37±1,3) мм рт. ст. (p<0,05) при контрольному показнику – (31,13±2,34) мм рт. ст., через 4 год – до (25,22±1,60) мм рт. ст. (p<0,01) і через 6 год – до (26,72±1,01) мм рт. ст. (p<0,05).
На ЕКГ визначали зниження електричної активності міокарда з ознаками дистрофії та некрозу.
Встановлено, що у процесі моделювання ІПС у першій його стадії (стадія ІПС-1, яка спостерігається у перші години після моделювання ІПС) маса ПШ серця збільшувалася на (21,80±3,33)% (Rxy±mr=0,794±0,215 при p<0,01), а ЛШ – на (8,30±2,49)% (Rxy±mr=0,908±0,148 при p<0,001). На гістологічних препаратах у міокарді було виявлено осередки ранніх ішемічних змін. Суттєві зміни визначено в міокарді ЛШ. Ступінь ішемічного пошкодження міокарда ПШ був менш виражений, незважаючи на збільшення маси міокарда. Виявлені фуксинофільні осередки вказували на метаболічні зміни в міокарді, але вони не характеризувалися як грубі, бо були транзиторними. Про це свідчив той факт, що через 24 год після моделювання ІПС (стадія ІПС-2) фуксинофільні осередки були майже відсутні. Гістологічними дослідженнями виявлено поодинокі волокна або частини м’язових волокон, забарвлені в червоний колір.
У процесі дослідження визначено підвищення ЕДС в міокарді шлуночків серця – до (8,72±0,23) мкг/мг при p<0,05. Виявилося, що рівень ЕДС у ЛШ і ПШ був практично однаковим – (8,76±0,31) і (8,76±0,11) мкг/мг при p<0,05. Вміст води в міокарді шлуночків серця підвищувався до (82,61±0,33)% при p<0,05. У міокарді ПШ вміст води підвищувався до (82,40±0,16)% (p<0,05), а у міокарді ЛШ – до (82,82±0,42)% (p<0,05).
Вміст води в міокарді шлуночків серця у тварин у стадії ІПС-1 був більше контролю: у ПШ – в (1,020±0,003) раза (Rxy±mr=0,797±0,214 при p<0,01), а у ЛШ – в (1,040±0,001) раза (Rxy±mr=0,965±0,093 при p<0,001). Показники ЕДС перевищували контроль в (1,520±0,117) раза (Rxy±mr=0,835±0, 195 при p<0,01) і в (1,460±0,122) раза (Rxy±mr=0,973±0,123 при p<0,001). При порівнянні результатів дослідження встановлено, що рівень ЕДС у стадії ІПС-1 не залежав від вмісту води в міокарді шлуночків серця.
Активність каталази в гомогенаті міокарда шлуночків серця знижувалася до (92,82±6,74) мМ/хв при p<0,05. Внутрішньошкірна РО2 знижувалася до (23,80±2,04) мм рт. ст. при p<0,01; контрольний показник становив (31,13± 2,34) мм рт. ст.
У стадії ІПС-1 на ЕКГ було визначено ознаки ішемії (тахіаритмія, зниження амплітуди зубця R і зсув STII і STIII вище ізолінії), які були транзиторними. У літературі розцінюють цей стан як парадоксальний феномен, при якому потенційний стрес-стимул може підвищити клітинну толерантність до наступних стрес-стимулів (F. Tomai et al., 1999; H. T. Sommerschild et al., 2000). На думку авторів, виникає пізній захист міокарда через 24 год після ІПС (R. Strasser et al., 1996).
У наших дослідженнях встановлено, що через 24 год після моделювання ІПС (стадія ІПС-2) маса ПШ (у перерахунку на 100 г маси тварини) була збільшена на (7,90±3,23)% (Rxy±mr=0,885±0,165 при p<0,001), а ЛШ – на (3,50± 2,16)% (Rxy±mr=0,987±0,057 при p<0,001). На гістологічних препаратах визначено поодинокі ледь забарвлені фуксинофільні осередки ішемічних змін.
У тварин у стадії ІПС-2 ЕДС в міокарді шлуночків серця залишалася підвищеною – (7,98±0,49) мкг/мг при p<0,05. Рівень ЕДС у ПШ [(8,04±0,27) мкг/мг при p<0,05] був вищим, ніж у ЛШ [(7,92±0,69) мкг/мг при p<0,1]. Вміст води в міокарді шлуночків серця знижувався відносно показника щурів у стадії ІПС-1 до (81,54±0,42)% при p<0,1. У міокарді ПШ і ЛШ вміст води
8-09-2015, 19:08