Міністерство охорони здоров’я України
Національний медичний університет імені О.О. Богомольця
Петренко Володимир Анатолійович
УДК: 616.127-018:616.441-008.64-085
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ ЗМІН
В МІОКАРДІ ЩУРІВ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ГІПОТИРЕОЗІТА ЙОГО КОРЕКЦІЇ
14.03.09 – гістологія, цитологія, ембріологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Національному медичному університеті імені
О.О. Богомольця МОЗ України.
Науковий керівник
доктор біологічних наук, професор Стеченко Людмила Олександрівна, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, професор кафедри гістології та ембріологіїю.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, професор Квітницька-Рижова Тетяна Юріївна, Інститут геронтології АМН України, завідуюча лабораторією морфології і цитології;
доктор медичних наук, старший науковий співробітник Захарова Валентина Петрівна, Інститут серцево-судинної хірургії імені М. М. Амосова АМН України, завідуюча відділом патоморфології.
Захист відбудеться „8” травня 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.003.06 у Національному медичному університеті імені О. О. Богомольця МОЗ України (01601, м. Київ-601, бульвар Шевченка, 13; тел. 234-60-63).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О. О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул. Зоологічна, 1).
Автореферат розісланий „07” квітня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук, професор О. М.Грабовий
Загальна характеристика роботи
Актуальність проблеми. Стрімке зростання хірургічної патології щитоподібної залози спричинене наслідками аварії на ЧАЕС [Гульчий Н. В., 1998; Комиссаренко И. В., 2006; Перцова Т. О., 2004; Романенко О. Ю., 1997]. Результатом тотальної тиреоїдектомії є маніфестний гіпотиреоз. Поширеність цієї форми захворювання в популяції коливається від 0,2 до 4% [Моргунова Т. Б., 2005; Фадеев В. В., 2004; BoilousR. W., 1998]. Цим обумовлюється потреба в дослідженні гіпотиреоїдної патології, а також проблемних питань її лікування [Фадеев В. В., 2004; Малова Н. Г., 2006; KlempererJ. D.,1996]. Дефіцит гормонів щитоподібної залози в організмі призводить до порушення водно – електролітного, білкового, ліпідного, вуглеводного обмінів, спричиняючи морфофункціональні та біохімічні зміни в різних органах і системах, зокрема в серцево – судинній системі, які виявляють у 70-80% хворих [Бойчук М. М., 2001]. Це сприяє розвиткові атеросклеротичних змін в судинах, ішемічній хворобі серця та вторинній артеріальній гіпертензії [Білявська С. Б., 2005; Зелінська Н. Б., 2002; KleinJ., 2001]. Вказані захворювання, для яких гіпотиреоз є облігатним фактором ризику, призводять до формування серцевої недостатності [Джанашия П. Х., 2004; Погаева Ф. П., 2006; EllyinF. M., 1992; Schmidt-Ott U. M., 2006].
На жаль, морфофункціональним змінам в серці за умов гіпотиреозу присвячена нечисленна література [ГурьеваИ. В., 1990; Павлюк В. Г., 1977]. Їх вивчення, враховуючи клінічні та лабораторні дані, стало б теоретичною основою для розуміння патогенезу серцево – судинних захворювань при гіпотиреозі, розробки адекватних методів їх діагностики, лікування та профілактики.
Відомо, що для передсердних кардіоміоцитів окрім скоротливої їх функції, характерна і ендокринна, яка полягає в синтезі та секреції передсердного натрійуретичного пептиду, якому відводять значну роль в регуляції водно – електролітного балансу, формуванню артеріальної гіпертензії, атеросклерозу судин, ремоделюванні міокарду, розвитку серцевої недостатності [Шутка Б. В., 2003; DeBoldA. I., 1981; EllisR., 1998]. Порівняльний аналіз морфофункціональних змін в міокарді правого передсердя, із вираженою ендокринною функцією, та лівого шлуночка, який зазнає найбільшого механічного навантаження, дозволить виявити основні закономірності формування гіпотиреоїдної міокардіопатії, оцінити стан ендокринного та скоротливого апаратів серця за умови післяопераційного гіпотиреозу.
Не зважаючи на активне розроблення клініцистами різних схем симптоматичної терапії міокардіопатій, більшу цікавість викликають етіопатогенетичні способи корекції гіпотиреоїдного стану [Малова Н. Г., 2007; Федоров С. В., 2006], а відповідно – профілактики та лікування захворювань міокарду при післяопераційному гіпотиреозі.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках держбюджетної теми Інституту проблем патології НМУ імені О. О. Богомольця „ Морфо-функціональний стан органів найбільш чутливих до дефіциту гормонів щитовидної залози за умов гіпотиреозу та його корекції”, номер державної реєстрації 0106U004081.
Метою даної роботи було вивчити морфофункціональні зміни в міокарді правого передсердя та лівого шлуночка в динаміці експериментального післяопераційного гіпотиреозу та за умови його корекції.
Задачі дослідження:
1. Розробити адекватну модель післяопераційного гіпотиреозу на щурах.
2. Вивчити морфофункціональні особливості міокарда щурів в динаміці післяопераційного гіпотиреозу.
3. Вивчити морфофункціональні особливості міокарда тиреоїдектомованих щурів після гормонзамісної терапії L–тироксином.
4. Вивчити морфофункціональні особливості міокарда тиреоїдектомованих щурів після комбінованої гормонзамісної терапії L–тироксином та кальцитоніном.
5. Вивчити морфофункціональні особливості міокарда тиреоїдектомованих щурів після трансплантації фетальних щитоподібних залоз.
6. Дати морфофункціональну оцінку стану ендокринного апарату серця у щурів при гіпотиреозі та при різних способах його корекції.
Об’єкт дослідження - морфофункціональні зміни в структурних компонентах міокарда правого передсердя та лівого шлуночка щурів в динаміці експериментального післяопераційного гіпотиреозу та при його корекції.
Предмет дослідження - фрагменти міокарда правого передсердя та лівого шлуночка тиреоїдектомованих щурів через 14, 35, 50, 100 діб після тиреоїдектомії та після корекції гіпотиреозу.
Методи дослідження – фізіологічні (електрокардіографія, визначення осмотичної резистентності еритроцитів), біохімічні (визначення концентрації вільного тироксину, загального та зв’язаного кальцію плазми крові; жирнокислотного спектру ліпідів міокарду, стану системи перекисного окислення ліпідів), морфологічні (світлооптичний та електронномікроскопічний).
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведене комплексне морфофункціональне порівняльне дослідження біохімічних, фізіологічних, структурних, ультраструктурних змін кардіоміоцитів міокарда правого передсердя та лівого шлуночка щурів в динаміці формування післяопераційного гіпотиреозу на розробленій автором моделі, яка підтверджена патентом. Вперше виявлені морфологічні аспекти формування гіпотиреоїдної міокардіопатії та критерії недостатності монотерапії L-тироксином. Вперше викладені теоретичні основи доцільності застосування кальцитоніну в комплексній замісній гормонотерапії післяопераційного гіпотиреозу. Встановлено, що найбільш ефективним способом корекції міокардіопатії тиреоїдектомованих щурів з етіопатогенетичної точки зору є хірургічний метод пересадки фетальної щитоподібної залози, який має і свої недоліки.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень сприяють поліпшенню діагностики та прогнозування перебігу гіпотиреоїдної міокардіопатії, за рахунок комплексного аналізу функціональних (ЕКГ, осмотична резистентність еритроцитів, жирнокислотний склад ліпідів міокарду, показників перекисного окислення ліпідів) та морфологічних даних. Узагальнення, що випливають з результатів дослідження дозволяють стверджувати, що у випадку післяопераційного гіпотиреозу доцільною є гормонозамісна терапія, яка компенсує не лише недостатність йодвмісних гормонів, а й кальцитоніну. Отримані дані можуть використовуватися в педагогічному процесі на кафедрах гістології та ембріології; патологічної анатомії, ендокринології, кардіології, при написані монографій, посібників, підручників, а також при розробленні ефективних схем лікування та профілактики гіпотиреоїдної міокардіопатії практикуючими лікарями.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є закінченою науково-дослідною роботою. Автором самостійно виконані аналіз літератури, постановка досліджень, одержання первинного матеріалу, проведення морфологічних, фізіологічних та біохімічних досліджень, опис результатів дослідження, морфометрія, статистична обробка даних, а також їх узагальнення. Розроблена модель гіпотиреозу на щурах, метод вивчення порушення ліпідного обміну при гіпотиреозі, які підтверджені патентами. Усі розділи дисертаційної роботи написані автором самостійно.
Апробація і впровадження. Основні положення дисертації були представлені на: науковій конференції “Актуальні проблеми експериментальної медицини” (Київ, 2003р.); науковій конференції “Использование электронной микроскопии в ХХІ веке” (Москва, 2003р.); VI научно-практической конференции с международным участием «Санкт- Петербургские научные чтения» (Санкт-Петербург, 2004р.); 16-thEuropeanstudents’ conference (Berlin, Germany, 2005); 14-thannualinternationalAinShamsMedicalstudents’ Congress (Cairo, Egypt, 2006); науково-практичній конференції «Досвід і проблеми застосування сучасних морфологічних методів досліджень органів і тканин у нормі та при діагностиці патологічних процесів» (Тернопіль, 2007р.).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 19 наукових праць, з них 8 журнальних статей у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 9 тез доповідей на наукових конгресах та конференціях, серед яких 5 – в міжнародних виданнях. Отримано 2 патенти України на корисну модель.
Об’єм та структура роботи. Матеріали дисертації викладені на 276 сторінках машинописного тексту, текстова частина займає 152 сторінки. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали та методи досліджень”, п’яти розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків та списку використаних джерел. Список цитованої літератури містить 338 джерел, серед яких 168 – опубліковані кирилицею та 170 – латиницею. Дисертація ілюстрована 93 рисунками та 17 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження. Об’єктом дослідження стали серця від 212 статево-зрілих безпородних щурів–самиць, яким у віці 3-4 місяці хірургічно моделювали стан гіпотиреозу. Вивчали чотири групи тварин, відповідно до поставлених завдань.
I група - віварійний контроль (неоперовані щури, 15 тварин);
II група - тварини, яким моделювали стан гіпотиреозу (70 тварин);
III група - тиреоїдектомовані щури, які отримували гормонзамісну терапію L-тироксином («Фармак», Україна) в дозі 10мкг/кг маси тварини (64 тварини);
IV група - прооперовані тварини, які отримували комбіноване лікування L-тироксином («Фармак», Україна) у дозі 10мкг/кг perosта кальцитоніном (препарат «міакальцик», «Novartis», Швейцарія) у дозі 1,0 МО/кг (58 тварин);
V група – щури, яким після видалення щитовидної залози була проведена трансплантація фетальної щитоподібної залози (5 тварин).
Утримання, догляд за тваринами, маркування і всі маніпуляції проводили відповідно до положень «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей» (Страсбург, 1985). Комісією з біоетики Національного медичного університету імені О. О. Богомольця встановлена відповідність проведених наукових досліджень етичним вимогами згідно наказу МОЗ України №231 від 01.11.2000 року.
Гіпотиреоз моделювали хірургічно розробленим методом, підтвердженим патентом.
Біоелектричну активність міокарда піддослідних щурів вивчали за електрокардіограмами у II стандартному відведенні з реєстрацією кривих на Мінгографі-34 («Siemens-Elema», Швеція).
Проникність еритроцитарних мембран вивчали за допомогою показника мембранних процесів – осмотичної резистентності еритроцитів (ОРЕ). ОРЕ визначали за методом Дейсі [Гиріна О. М., 2004], принцип якого полягає в зміні ступеня гемолізу еритроцитів (у відсотках) в серії забуферених гіпотонічних розчинів натрію хлориду (в розведеннях від 0,5% до 0,1%, рН 7,4).
Для контролю ефективності гіпотиреозу, у дослідних тварин досліджували вміст тироксину в сироватці крові імуноферментним методом. Вміст рівня іонізованого та загального кальцію в сироватці крові визначали титруванням.
Процеси перекисного окислення ліпідів оцінювали за рівнем вторинних продуктів ліпопероксидації (малонового діальдегіду) у гомогенатах міокарда, які визначали спектрофотометричним методом при спонтанній неіндукованій ліпопероксидації та індукованому ферментативно-залежному ліпопереокисленні з використанням в ролі прооксиданта систему НАДФН+ та сульфат заліза (ІІ).
Вивчення жирнокислотного складу ліпідів міокарду у експериментальних щурів проведено методом газорідинної хроматографії на базі лабораторії газової хроматографії Інституту проблем патології. Міокард експериментальних тварин гомогенізували у фізіологічному розчині, підготовку біологічного матеріалу ліпідів тканин серця експериментальних та контрольних щурів і газохроматографічний аналіз проводили за існуючою методикою [Трофімова Т. С. із співавт., 2005]. За даним методом отримано патент.
Матеріалом для електронномікроскопічного дослідження були ділянки міокарду правих передсердь та лівих шлуночків щурів. Фрагменти міокарду фіксували в 2,5% розчині глютарового альдегіду на какодилатному буфері з дофіксацією в 1% розчині осмієвої кислоти. Зневоднювали у спиртах 70%, 80%, 90%, 100% концентрації та ацетоні. Заливали в суміш епон – аралдит, згідно загальноприйнятій методиці [Карупу В. Я., 1984]. Напівтонкі та ультратонкі зрізи з блоків отримували на ультратомах LKBIII (Швеція) та Reihart (Швеція). Напівтонкі зрізи забарвлювали метиленовим синім та за Hayat [Hayat М., 1986] і досліджували за допомогою фотооптичної системи „Olympus”. Ультратонкі зрізи контрастували насиченим розчином 2% уранілацетату та цитрату свинцю. Препарати досліджували під електронними мікроскопами ЕМ-100 та ПЕМ – 125К.
Для морфометричних досліджень використовували програму «Органела», розроблену на базі лабораторії електронної мікроскопії Інституту проблем патології. В передсердних кардіоміоцитах підраховували співвідношення різних типів гранул [Коростишевская И. М., 1989]. І тип представляє собою популяцію гранул, що формуються. ІІ тип гранул представляє зрілі форми органел, які депоновані в передсердних кардіоміоцитах. ІІІ тип гранул складається з органел, вміст яких виводиться з клітини. Різні типи гранул підраховували на негативах, отриманих при однаковому збільшенні, які містили фрагменти передсердних кардіоміоцитів, зріз яких пройшов через центр клітини.
В кардіоміоцитах лівого шлуночка визначали об’ємну і числову щільність мітохондрій, середню площу мітохондрій, фактор форми мітохондрій, об’ємну щільність міофібрил та співвідношення об’ємних щільностей мітохондрій і міофібрил, згідно принципам стереометричного аналізу [Автанділов Г. Г., 2007].
Трансплантацію фетальної щитоподібної залози експериментальним тваринам здійснювали в день тиреоїдектомії. Донорський матеріал брали від плодів щурів на 9-10 добу гестації. Трансплантували заготовлені фетальні щитоподібні залози в дуплікатору очеревини здухвинної кишки.
Статистична обробка здійснювалась методами варіаційноі статистики, за допомогою програмного забезпечення StatisticaforWindiws 6.0 (MicrosoftCorporation, USA). Обраховувались дані морфометричного та біохімічних досліджень. По кожному з показників обчислювалося середнє значення та стандартна похибка для кожної з піддослідних тварин. Вірогідність отриманих даних оцінювали за параметричними і непараметричними критеріями достовірності.
Результати досліджень та їх обговорення. Морфофункціональний стан міокарду щурів в динаміці експериментального гіпотиреозу. В результаті тиреоїдектомії у щурів формується стан стійкого гіпотиреозу, про що свідчить достовірне зниження концентрації вільного тироксину плазми крові більше, ніж вдвічі, порівняно з контролем (рис. 1). Встановлене зниження концентрації загального кальцію в плазмі крові впродовж всіх 100 діб дослідження, проте, рівень іонізованого кальцію в крові залишався в межах норми, визначеної для інтактних тварин, що свідчить про відсутність гіпопаратиреозу у досліджуваних тварин [Федоров С. В., 2006; JacobsD., 2004].
Рис. 1. Графік змін концентрації вільного тироксину в плазмі крові в динаміці експерименту. По осі абсцис – терміни досліджень та контрольне значення, по осі ординат – концентрація вільного тироксину в плазмі крові (нмоль/л).
Аналіз отриманих результатів комплексного дослідження функціонального стану та структури міокарду дозволив виявити стадійність формування патоморфологічних змін в ньому. Ці зміни мали однаковий характер та спрямованість як в міокарді правого передсердя, так і лівого шлуночка, проте їх виразність була більшою в міокарді правого передсердя. За характером виявлені процеси в міокарді можна розділити на три основні стадії: реактивних змін, компенсаторно-пристосувальних процесів та декомпенсації.
Реактивні зміни в міокарді набувають свого розвитку в ранньому післяопераційному періоді (через 14 та 35 діб після операції). Вже на цій стадії активувались процеси як спонтанного, так і НАДФН+ -індукованого механізмів перекисного окислення ліпідів (концентрація малонового діальдегіду в гомогенаті міокарда в першому випадку виросла на 116%, а у другому – на 56%). Тобто, реактивні зміни в міокарді характеризувались активацією переважно процесів спонтанного утворення вільних радикалів. Ці дані узгоджуються даними інших авторів [Ланкин В. З., 2000; Реброва Т. Ю., 2007;Сомова О. В., 1999; Ткаченко О. Р., 1994]. Ймовірною причиною ланцюгової активації вільнорадикального окислення ліпідів є розмежування окисно-відновних процесів в мітохондріях.
Одними з перших в процес перекисного окислення ліпідів включаються поліненасичені жирні кислоти за рахунок наявності в них нестійких зв’язків [Савицький И. В., 1982]. Отримані нами результати визначення жирнокислотного спектру ліпідів міокарда дають право вважати, що для періоду реактивних змін характерним є перекисне окислення саме поліненасичених жирних кислот, вміст яких зменшився на 10%. Поліненасичені жирні кислоти в структурі фосфоліпідів беруть участь у формуванні мембран клітин. Причому, чим більший вміст цих жирних кислот в мембрані, тим нижче її в’язкість та тим вищою є активність рецепторних, транспортних та сигнальних систем [Галявич А. С., 2006]. Зниження вмісту поліненасичених жирних кислот в мембранах організму сприяє підвищенню їх проникності та зменшенню міцності. Ми спостерігали це на прикладі мембран еритроцитів тиреоїдектомованих щурів. Виявилось, що через 14 діб рівень нестійких форм еритроцитів в 0,45% NaCl підвищилась на 95,8% порівняно з контролем.
Описані біохімічні та патофізіологічні процеси мали своє морфологічне відображення в міокарді. В патологічний процес включаються обмінні мікросудини, компоненти інтерстиційного простору та самі кардіоміоцити. Виявлений гетеротипізм змінених кардіоміоцитів відображає грубі механізми їх селекції в умовах різкого дефіциту гормонів щитоподібної залози. Найбільш чутливими до дії патогенного чинника виявляються найбільш активні з функціональної точки зору клітини [Непомнящих Л. М., 1981; Твердохліб І. В., 1996].
Характерною ознакою реактивних процесів в міокарді через 14 діб була поява ділянок апоптозно змінених клітин, які втрачають контакти з сусідніми кардіоміоцитами, мають пікноморфні ядра, ущільнену цитоплазму з деструктурованими міофібрилами, розширеними канальцями саркоплазматичної сітки, які не утворюють тріади, активними мітохондріями з дещо ущільненими кристами. Окрім кардіоміоцитів, спостерігались апоптозно змінені ендотеліоцити.
Вважають, що специфічним для кардіоміоцитів є мітохондріальний шлях запуску апоптозу [CookS. A., 1999; Стеченко Л. А., 2006]. Разом з тим, не можна заперечувати і участь цитоплазматичних кальцієвих механізмів. Очевидно, вони доповнюють висунуту концепцію кальцієвих пошкоджень кардіоміоцитів [Меерсон Ф. З., 1980; Ейлер В. Г., 1990; KraniasE. G., 2007]. Цілком можлива комбінація цих двох механізмів.
Іншою важливою ознакою реактивних процесів в міокарді як через 14, так і через 35 діб була поява значної кількості „світлих” кардіоміоцитів, із вираженими набряковими процесами в саркоплазмі, розвитком альтеративних змін з боку скоротливого та енергетичного апаратів та недостатністю репаративних процесів. Набряк саркоплазми, очевидно, пов’язаний із порушенням функції транспортних білків в складі сарколеми та виявленим зниженням вмісту поліненасичених жирних кислот в структурі фосфоліпідів мембран. Він відображає описане нами підвищення проникності клітинних мембран за умови гіпотиреозу. Згідно даних літератури, тиреоїдині гормони індукують синтез Na/K-АТФази, білків іонних каналів в кардіоміоцитах, що за умови гіпотиреозу спричиняє підвищену її проникність для іонів Na+ , яка стає причиною набрякових процесів в кардіоміоцитах [Сыч Ю. П., 2003; DillmanW. H., 1990; KahalyG. R., 2005].
Реактивні процеси в цей період встановлені і в більшості капілярів, де вони проявлялись активацією мікровезикулярного транспорту та білоксинтетичних процесів, появою мікроклазматозних виростів, які збільшують площу дифузійної поверхні. В цій
8-09-2015, 22:26