харківський національний університет імені в.н. каразіна

Білявська Світлана Борисівна

Удк 616.441-008.64-089.843:57.085.23

корекція експериментального гіпотиреозу шляхом комбінованої трансплантації органотипових культур

03.00.13 – фізіологія людини і тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України і в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Захист відбудеться 28 травня 2008 р . о 15:15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 23 квітня 2008 року.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради Дзюба В.М.

загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я на даний час в світі нараховується близько 200 мільйонів осіб з патологією щитоподібної залози (ЩЗ). В результаті аварії на ЧАЕС кожен рік збільшуються показники захворюваності та поширеності серед населення України таких тиреопатій як гіпотиреоз, дифузний токсичний зоб, аутоімунний тиреоїдит, доброякісні і злоякісні новоутворення ЩЗ, в т.ч. у дітей (Тронько Н.Д. и др., 1997 ). Серед форм гіпотиреозу домінує первинний (тиреогенний) гіпотиреоз, третина від якого приходиться на ятрогенний (Волох Ю.А. и др., 1988; Аристархов В.Г. и др., 2001 ). Відомо, що гіпо- і атиреоїдні стани потребують постійної замісної гормонотерапії. В останні роки з’явились дані про збільшення кількості пацієнтів із порушеннями з боку органів травлення, серцево-судинної та кісткової систем на тлі лікування L-тироксином (Калинин А.П. и др., 1991; Roberts N.D., 1996; Greenspan S.L. et al., 1999; Saravanan P. et al., 2002; Chuo A. M. et al., 2003 ), що сприяло деякім змінам в підходах до лікування гіпотиреозу (Фадеев В.В. и др., 2002 ).

Поряд із вдосконаленням медикаментозної терапії гіпотиреозу вивчається можливість використання методу трансплантації ЩЗ. У випадках первинного гіпотиреозу, коли причинами гормональної недостатності могли стати спадкові дефекти в біосинтезі тиреоїдних гормонів, ембріональні гіпо- і аплазії залози, субтотальна або тотальна тиреоїдектомія та при умові відсутності аутоімунного компоненту захворювання, альтернативою лікування синтетичними гормонами може бути трансплантація ЩЗ (органотипових і клітинних культур). В світовій літературі існує ряд експериментальних робіт, присвячених трансплантації ЩЗ. Доказано, що ксеногенні тканини/клітини ЩЗ здатні не тільки компенсувати нестаток гормонів, але мають і стимулюючу дію на тканину власної залози реципієнта (Скалецкий Н.Н. и др., 1990 ).

Незважаючи на ефективність такого методу лікування, існують супутні питання, такі як реакції гострого та хронічного відторгнення трансплантаційного матеріалу, необхідність імуносупресії і т.д. У зв’язку з цим, актуальним є пошук шляхів подолання бар’єру гістосумісності, індукції толерантності і пролонгації терміну функціонування трансплантату в організмі реципієнта.

Гіпотетично, комбінована трансплантація ЩЗ і надниркових залоз (НЗ) може мати позитивний вплив на морфофункціональні характеристики трансплантату ЩЗ. Шляхи реалізації даного ефекту обумовлені локальною модифікуючою дією глюкокортикоїдних гормонів на сигнально-регуляторні і трофічні процеси в основному графті. Дане припущення аргументується результатами досліджень (Kukreja S.C. et al., 1979; Emerson C.H. et al., 1993; De Fazio S.R. et al., 1994 ), в яких доказано імунопротекторний вплив одних ендокринних тканин на інші та наявність регуляторного механізму сигнальних зв’язків в основному графті шляхом забезпечення його центральної регуляції (Davalli A.M. et al., 1999; Agrawal A.K. et al., 2004 ).

У зв’язку з деякими протиріччями в літературних даних з дослідження дії глюкокортикоїдів на функціональну активність щитоподібної залози in vivo та in vitro і обмеженими даними про комбіновану трансплантацію двох видів ендокринних тканин, детальне вивчення зазначеної проблеми вважається актуальним.

Тому, питання щодо впливу НЗ на функціонування трансплантата ЩЗ за умов їх комбінованої ауто-, ало- і ксенотрансплантації, а також щодо ефекту глюкокортикоїдних гормонів на синтез і секрецію тироксину in vitro потребує детального аналізу і проведення власних експериментальних досліджень. Крім того, залишаються відкритими питання про вплив тканини аденогіпофізу на функціонування графту ЩЗ при їх комбінованій трансплантації і можливість центральної регуляції графту в організмі реципієнта.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась в рамках держбюджетної теми Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна “Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на ДНК, білки та біомембрани” (№ державної реєстрації - 0197U016741) і наукової тематики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України “Дослідження механізмів функціонування кріоконсервованих органних культур ендокринних тканин” (№ державної реєстрації - 0101U003478).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи було дослідження структурно-функціональних характеристик моно- і комбінованих органотипових культур щитоподібних, надниркових залоз і гіпофіза in vitro та in vivo - за умов трансплантації тваринам з післяопераційним гіпотиреозом.

Відповідно до встановленої мети передбачалося:

1. Дослідити дію специфічних і неспецифічних модифікаторів гормонопоезу на гормональну активність органотипових культур щитоподібних залоз (ОКЩЗ) in vitro.

2. Вивчити вплив органотипових культур надниркових залоз (ОКНЗ), експлантатів гіпофізу на гормональну активність та життєздатність тироцитів за умов комбінованого культивування.

3. Дослідити гормональний рівень і деякі показники білкового, ліпідного та вуглеводного обмінів у щурів з післяопераційним гіпотиреозом при ауто-, ало- і ксенотрансплантаціях комбінованих і монографтів нативних фрагментів (НФ) і ОКЩЗ.

4. Оцінити перевагу методу комбінованого культивування двох видів ендокринних тканин в якості способу передобробки трансплантаційного матеріалу.

5. Провести гістологічний аналіз трансплантаційного матеріалу на етапі передобробки та після трансплантації.

Об’єкт дослідження - тиреоїдний статус і процеси метаболізму у гіпотиреоїдних щурів після ауто-, ало- и ксенотрансплантації НФ і ОКЩЗ в комбінації з НЗ і експлантатами гіпофізу.

Предмет дослідження - нативні фрагменти і органотипові культури щитоподібних залоз новонароджених поросят і статевозрілих щурів (самок) in vitro та in vivo (ауто-, ало- і ксенографти).

Методи дослідження - органотипове культивування, комбіноване культивування, ретроградний спосіб тиреоїдектомії, метод трансплантації під капсулу нирки, радіоімунологічний аналіз (РІА), фотоколориметричний метод визначення біохімічних показників крові, світлова мікроскопія, гістологічний аналіз, математичний аналіз результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові дані про стимулюючий вплив глюкокортикоїдних гормонів на Т4-гормонопоез in vitro. Встановлена концентраційна залежність рівня Т4 від кортикостерону в середовищі культивування ОКЩЗ щурів. Підтверджено здатність ОКЩЗ щурів і новонароджених поросят відповідати на дію специфічних і неспецифічних стимуляторів гормонопоезу шляхом підвищення рівня тироксину в середовищі культивування.

Удосконалено методику органотипового культивування ЩЗ. Розроблено метод комбінованого культивування тканин ЩЗ і НЗ та встановлено позитивний ефект останнього на морфофункціональні властивості ОКЩЗ in vitro та за умов трансплантації гіпотиреоїдним щурам.

Підібрані комбінації ендокринних тканин, при сумісному культивуванні та трансплантації яких, спостерігалося максимальне підвищення рівня тироксину в інкубаційному середовищі та його нормалізація в плазмі крові тварин-реципієнтів.

Дістало подальшого розвитку вивчення впливу гормонів гіпофізу на морфофункціональні характеристики ЩЗ in vitro (показано вірогідне зростання рівня тироксину при комбінованому культивуванні тканин ЩЗ і гіпофізу). За умов комбінованої трансплантації даних тканин визначено локальну стимулюючу дію на гормональну активність графту ЩЗ і наявність регуляторних зв’язків в межах гіпоталамо-гіпофізарно-тиреоїдної системи реципієнта, що підтверджується співвідношенням рівнів тиротропіну (ТТГ) і тироксину в плазмі крові гіпотиреоїдних тварин та гістологічними дослідженнями трансплантатів.

Вперше проведена спроба трансплантації комбінованих культур щитоподібних і надниркових залоз з метою гормональної корекції експериментального гіпотиреозу та супутніх метаболічних порушень. В загальну методику трансплантації ЩЗ введено етап передтрансплантаційної обробки матеріалу, на якому проводилось комбіноване культивування тканин ЩЗ, НЗ і гіпофіза. Встановлено позитивний ефект трансплантації комбінованих культур, ксенотрансплантації нативних фрагментів ЩЗ і НЗ в нормалізації рівнів тироксину, ТТГ і деяких біохімічних показників в плазмі крові тварин-реципієнтів.

Практичне значення одержаних результатів. Позитивні результати використання комбінованого органотипового культивування тканин ЩЗ, НЗ і гіпофізу в даному дослідженні обґрунтовують доцільність практичного застосування зазначеного методу на етапі передобробки трансплантаційного матеріалу з метою поліпшення його гормональної активності, зниження імуногенності та подовження термінів функціонування графту в організмі реципієнта.

Можливе клінічне застосування методу комбінованої трансплантації тканин щитоподібних і надниркових залоз в лікуванні первинного гіпотиреозу лабільного перебігу, в стадії декомпенсації, при неефективності терапії синтетичними гормональними монопрепаратами (L-тироксин), з огляду на відсутність в патогенезі захворювання аутоімунного компонента, а також для лікування первинного гіпотиреозу з супутньою недостатністю надниркових залоз, що виникла на тлі глюкокортикоїдної терапії.

Нові дані щодо компенсаторного впливу комбінованої трансплантації двох видів ендокринних тканин мають значення для розвитку тканинної та клітинної трансплантології, клінічної та експериментальної ендокринології і ендокринної хірургії.

Встановлення стимулюючої дії кортикостерону на Т4-гормонопоез in vitro та in vivo, наявності сигнально-регуляторних зв’язків між ЩЗ та гіпофізом, як в моделі in vitro, так і за умов трансплантації сприятимуть розвитку сучасних уявлень про взаєморегуляцію ендокринних залоз.

Результати досліджень використовуються у навчальному процесі при викладанні дисципліни “Фізіологія сільськогосподарських тварин”, розділу “Фізіологія ендокринної системи” студентам факультету ветеринарної медицини Сумського національного аграрного університету та можуть бути використані для викладання курсів нормальної,

патологічної фізіології та ендокринології на біологічних факультетах університетів та у медичних вищих учбових закладах, а також у роботі науково-дослідних установ ендокринологічного профілю.

Особистий внесок здобувача. Представлені на захист положення і експериментальні дані отримані при безпосередній участі дисертанта, яка полягає в самостійному плануванні дослідження, проведенні серії експериментів in vitro та in vivo, розробці та застосуванні методу комбінованого культивування, інтерпретації і математичному аналізі отриманих результатів, формулюванні висновків.

Автор висловлює подяку співробітникам відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи викладені та обговорені на засіданнях відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та на засіданні вченої ради біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна; матеріали дисертації представлені на наукових конференціях: IІІ и IV Данилевських читаннях (Харків, 2004, 2005 р.р.), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004 р.), конференціях молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2004, 2005 р.р.), 5^th Parnas Conference "Molecular Mechanisms of Cellular Signalling" (Kyiv, 2005), конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005 р.), науково-практичній конференції з участю міжнародних фахівців “Актуальні питання абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів” (Київ, 2006 р.), 18^th European Student’s Conference “Promising Medical Scientists Willing to Look Beyond” (Berlin, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, у тому числі 6 статей, 4 із яких – у фахових виданнях, 10 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 167 сторінках друкованого тексту, в тому числі на 29 сторінках цитована література, проілюстровано 23 рисунками, 4 таблицями і 31 мікрофотографією. Дисертаційна робота містить вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення), висновки і бібліографічний список, який включає 295 джерел, в тому числі 236 іншомовних.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на щурах лінії Вістар (самках), віком 3 місяці, вагою 165-215 г, використаних в якості реципієнтів для проведення ауто-, ало- і ксенотрансплантацій. Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, вимогам та нормам 1СН С8Р (2002 р.), типовим положенням з питань етики МОЗ України № 281 від 1 листопада 2000 р., відповідно до положень нормативних документів, введених в дію наказом МОЗ України № 6 від 17 січня 1995 р., а також вимогам “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та наукових цілях” (1986 р. № 123).

Трансплантаційний матеріал, у вигляді комбінованих і монографтів, представлено НФ і органотиповими культурами ендокринних залоз (ЩЗ, НЗ і гіпофізу) статевозрілих щурів і новонароджених поросят (НП). На етапі передобробки трансплантаційного матеріалу проводилось органотипове культивування ендокринних тканин, комбіноване культивування і культивування в присутності модифікаторів гормонопоезу. Для цього в асептичних умовах отримували органні фрагменти із ендокринних залоз щурів і новонароджених поросят розміром 0,5-1 мм³ , культивували їх за стандартною методикою (Грищенко В.І. та ін., 2000 ) протягом 4 діб на живильному середовищі 199/RPMI, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75 мкг/л) з додаванням пеніциліну (100 ОД/мл) і канаміцину/стрептоміцину (100 мкг/мл) при температурі 37 єС в атмосфері 5% СО₂ . Для комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин на 3 добу фрагменти ЩЗ і НЗ, а також ЩЗ і експлантати гіпофізу відокремлювали напівпроникливою мембраною і інкубували 24 години, дотримуючись стандартних умов. Для визначення здатності ОКЩЗ відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу культивування в середовище додавали ТТГ (10 мкМО/мл (Sadeh K. et al., 1991 )) та інкубували 12 годин при температурі 37єС, тиротропін-рилізинг гормон (ТРГ) в 2 концентраціях (10 нмоль (4,4 нг/мл)) – на 12 годин (Weintraub B.D. et al., 1990 ) і 200 мкг/мл – на 2 години інкубації (Cheolyoung P. et al., 2005 )), дибутирил-циклічного аденозинмонофосфату (дб-цАМФ) (1 ммоль/мл), кортикостерон (в діапазоні концентрацій від 0,25 до 1,0 мкг/мл (Резников А.Г., 1980 )). Крім того, ОКЩЗ і ОКНЗ окремо культивували в стандартних умовах протягом 3 діб, а потім інкубували 12 годин, відокремлюючи фрагменти напівпроникливою мембраною в присутності ТТГ і дб-цАМФ у вищезазначених концентраціях. ОКЩЗ і експлантати гіпофіза інкубували з ТРГ (4,4 нг/мл – 12 годин і 200 мкг/мл – 2 години).

Життєздатність культур визначали на останню добу культивування методом суправітального забарвлення трипановим синім клітинної суспензії, отриманої методом ферментативної дезагрегації. Кількість життєздатних клітин (ЖК, %) визначали шляхом підрахунку в гемоцитометрі (Адамс Р., 1983 ) і знаходили за формулою: ЖК = (∑_{незабарвл} /∑_заг ) х 100,де ∑_{незабарвл} – кількість живих (незабарвлених) клітин, ∑_заг – загальна кількість клітин в полі зору.

Післяопераційний гіпотиреоз моделювали за допомогою ретроградної тиреоїдектомії (Легач Е.И., 2005 ) під комбінованим внутрішньочеревним наркозом (кетамін - 2,5 мг, ксилазин – 0,5 мг/100г маси тіла). З метою запобігання порушення кальцієвого обміну тваринам давали 0,2% розчин кальцію хлориду (Корлэтяну А.Н., 1987; Шкуматов Л.М., и др., 2001 ).

Трансплантаційний матеріал у дозі 30-35 мг вносили під капсулу нирки. У випадку комбінованої трансплантації з НЗ тваринам здійснювали лівосторонню адреналектомію.

Сакрифікацію тварин проводили на 30 добу після трансплантації під ефірним наркозом. Кров для аналізу брали за допомогою внутрішньосерцевої пункції.

Вміст загального рівня тироксину (Т4) в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування дослідних зразків ОКЩЗ визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РИА – Т4 – СТ (Білорусь) (Прядко К.А. и др., 2000 ) и Т4 Immunotech (Чехія) згідно з інструкцією.

Показники концентрації Т4 в середовищі культивування ОКЩЗ нормували на білок, який вимірювали за методом Бредфорда (Bradford, 1976 ).Рівень ТТГ в плазмі крові щурів-реципієнтів визначали з використанням набору для РІА - ТТГ «Ирма» REF (Угорщина).

Тест толерантності до вуглеводів проводили шляхом внутрішньочеревного введення розчину глюкози (0,1 г глюкози на 100-150 г маси тіла тварини) за 40 хвилин до сакрифікації (Громакова І.А. и др., 2002 ). Рівень глюкози в крові вимірювали фотоколориметричним методом в модифікації Н.В. Клімкіної (Пушкина Н.Н., 1963 ) та експрес-методом за допомогою глюкометру “Глюкофот” та індикаторних пластин “Гемоглан” (Україна).

Рівень альбуміну в плазмі крові визначали фотоколориметричним методом за реакцією з бромкрезоловим зеленим стандартним тест-набором Альбумин “Филисит Диагностика” (Україна), рівень холестерину - набором Chol 150 “Lachema” (Чехія) згідно з інструкціями. Фотоколориметричні визначення проводили з використанням ФЕК (КФК-2-УХЛ42).

Підготовку матеріалу до гістологічних досліджень проводили в стандартних умовах. Нирку з трансплантатом або фрагменти культури фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, зневоджували етанолом і заливали у парафінові блоки. Зрізи товщиною 5-7 мкм виготовляли так, щоб гістологічна поверхня включала трансплантат і оточуючі тканини – паренхіму і капсулу нирки. Зразки забарвлювали гематоксиліном та еозином. Препарати досліджували під світлооптичним мікроскопом при збільшеннях об’єктиву х20, х40 і х60. Мікрофотографії отримували за допомогою мікроскопу Olimpus з цифровою камерою і пакетом прикладних програм для обробки зображення.

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента і однофакторного дисперсійного аналізу (ANOVA) - для непараметричних даних.

Результати досліджень та їх обговорення

Морфофункціональні властивості органотипових культур щитоподібних залоз в умовах специфічної і неспецифічної стимуляції та комбінованого культивування. Одним із якісних параметрів оцінки функціонального стану культури є її здатністьвідповідати на стимуляцію змінами гормональної активності. Функціональним параметром життєздатної культури прийнято вважати її здатність виключати із клітин суправітальні барвники (розчин трипанового синього тощо). Дані, представлені в табл. 1 свідчать, що показник життєздатності клітин ОКЩЗ НП після комбінованого культивування з ОКНЗ був на 19,53% вищий за такий клітин монокультур ОКЩЗ НП.

Таблиця


8-09-2015, 19:58