Вплив факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Книш Оксана Василівна

УДК: 547.42:612.111.7

ВПЛИВ ФАКТОРІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ТРОМБОЦИТІВ ЛЮДИНИ

14.01.35 – кріомедицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

доктор медичних наук Компанієць Антоніна Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріопротекторів, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, Вищий державний навчальний заклад України “Українська медична стоматологічна академія”, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології, м. Полтава

доктор біологічних наук, професор Субота Ніна Павлівна, Харківський національний педагогічний університет імені Г. C. Сковороди, завідувач кафедри валеології, м. Харків

Захист відбудеться “22” січня 2008 р. о “13³⁰ ” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

Автореферат розісланий “19” грудня 2007 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дослідження, спрямовані на створення ефективної технології низькотемпературного консервування кров’яних пластинок, ведуться упродовж декількох десятиліть. Проте, значних успіхів у даному напрямку досягти не вдалося. Як було зазначено провідними вченими на Міжнародному симпозіумі з кріоконсервування тромбоцитів крові людини (Pittsburgh, Pennsylvania, USA, 1998), емпіричний підхід, на якому базувалися такі дослідження, не дозволив розробити метод кріоконсервування тромбоцитів, що задовольнив би клініцистів за рівнем їх лікувальної ефективності та безпечністю кріоконсерванта для реципієнта. Є нагальна потреба у дослідженні факторів, що можуть впливати на життєздатність кров’яних пластинок на всіх етапах технологічного процесу низькотемпературного консервування – від виділення концентратів тромбоцитів до їх застосування, із залученням адекватних та інформативних методів оцінки структурної цілісності та функціональних властивостей клітин [ReidT.J. etal., 1999; GaoD. etal., 1999; CroweJ.H. etal., 1999; WoodsE.J. et al., 1999; Dijkstra-TiekstraM.J. et al., 2003; BalintB. et al., 2006].

Диметилсульфоксид (ДМСО) у кінцевій концентрації 5 – 6 % забезпечує найбільш високий рівень морфофункціональної збереженості кров’яних пластинок порівняно з іншими кріопротекторами, тому спосіб заморожування з ним визнаний “золотим стандартом” [ReidT.J. andGaoD., 1999]. Однак, трансфузії кріоконсервованих з ДМСО концентратів тромбоцитів несуть небезпеку виникнення у реципієнта серйозних побічних ефектів [CurcoyA.I. etal., 2002]. Обов’язковим є етап видалення ДМСО із суспензії відігрітих клітин, що супроводжується додатковими кількісними втратами кров’яних пластинок та зниженням їх функціонального потенціалу. Існуючі модифікації методу заморожування тромбоцитів з ДМСО [LozanoM. L. etal., 2000; ValeryR.C. et al., 2005] дають можливість уникнути процедури видалення кріопротектора, але не дозволяють повністю позбутися його токсичного ефекту. Диметилацетамід (ДМАЦ) менш токсичний, ніж ДМСО, але поступається йому за кріозахисними властивостями [Компаниец А.М., 1980; 1992; Азовская С.А. и др., 1989]. Щодо 1,2-пропандіолу (1,2-ПД) існують протилежні думки: одні автори вважають дану сполуку перспективною при кріоконсервуванні тромбоцитів [Компаниец А.М. и др., 1992], інші наголошують на її слабкій кріозахисній дії [ArnaudF.GandPeggD.E., 1990]. Таким чином, проблема вибору кріопротектора та визначення оптимального за складом кріозахисного середовища для кріоконсервування тромбоцитів потребує подальшого вирішення.

Як доведено дослідженнями останніх років [BalintB. etal., 2006; BilynetsT. etal., 2006; Kyryliuk еtal., 2006], швидкість охолодження біологічного об’єкта повинна підбиратися з урахуванням конкретних фізико-хімічних явищ і процесів, що спостерігаються в різних температурних інтервалах. Саме тому існуючі програми заморожування кров’яних пластинок, що підбиралися емпірично, потребують перегляду і розробки рекомендацій щодо їх оптимізації.

Дослідження впливу факторів кріоконсервування є актуальними і мають стати основою теоретично і експериментально обґрунтованої стратегії низькотемпературного консервування концентратів тромбоцитів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом НДР ІПКіК НАН України у відділі кріопротекторів в рамках теми 2.2.6.95 “Вивчення ефективності етоксилатів поліолів (метил- і амідозаміщених) в якості кріопротекторів для кріоконсервування компонентів крові, клітин і тканин фетоплацентарного комплексу людини і тварин”, номер держреєстрації 0101U003481; теми 2.2.6.30 “Вивчення закономірностей кріозахисної дії та токсичних властивостей багатокомпонентних середовищ на основі нових кріопротекторів рядів поліолів і амідів при кріоконсервуванні клітин і загальному охолодженні організму гомойотермних тварин”, номер держреєстрації 0106U002166.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи – дослідити вплив ряду факторів кріоконсервування на збереженість структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів на етапах низькотемпературного консервування.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Дослідити у порівняльному аспекті ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з донорської крові двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми та лейко-тромбоцитарного шару, за умови подовження терміну їх зберігання перед заморожуванням до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єС.

2. Вивчити антирадикальні властивості кріопротекторів різних класів хімічних сполук за здатністю перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі та дослідити їх вплив на інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.

3. Дослідити вплив кріопротекторів: диметилсульфоксиду, диметилацетаміду та 1,2-пропандіолу на структурну цілісність і функціональні властивості тромбоцитів на етапі експозиції.

4. Визначити вплив швидкості охолодження кріобіологічної системи у температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур на структурну цілісність та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів.

5. Оцінити ефективність кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисних середовищах різного композиційного складу (диметилсульфоксид, диметилацетамід, 1,2-пропандіол, комбінації диметилацетаміду і 1,2-пропандіолу).

Об’єкт дослідження – зміни параметрів структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів крові людини під впливом факторів кріоконсервування.

Предмет дослідження – тромбоцити крові людини.

Методи дослідження – кріобіологічні, біохімічні, цитологічні, гематологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше у порівняльному аспекті вивчено вплив комплексу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів, що були виділені з донорської крові двома методами – із збагаченої тромбоцитами плазми і лейко-тромбоцитарного шару та зберігалися перед заморожуванням протягом 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC.

Встановлено фактори, які мають визначальний вплив на ефективність кріоконсервування тромбоцитів – склад кріозахисного середовища та швидкість охолодження кріобіологічної системи в інтервалі кристалізації і зоні евтектичних температур. Вперше експериментально доведена доцільність використання при заморожуванні тромбоцитів комбінації кріопротекторів – ДМАЦ та 1,2-ПД. Теоретично обґрунтована і експериментально апробована програма заморожування концентратів тромбоцитів з оптимальними швидкостями проходження температурного інтервалу кристалізації. Вагомим підтвердженням важливості застосування розробленої програми охолодження є вперше встановлений факт збереження структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів при їх заморожуванні без кріопротектора, за умови поєднання процедури температурної ініціації кристалізації з наступною контрольованою швидкістю охолодження в температурному інтервалі від 0/-1,5 до -35…-40 єC.

Вперше проведене порівняльне дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів різних класів хімічних сполук та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що характер впливу кріопротекторів на інтенсивність процесів ПОЛ у системі визначається, перш за все, їх хімічною природою, а не здатністю до перехоплення гідроксильних радикалів. Експериментально встановлено, що 1,2-ПД і ДМАЦ у кінцевій концентрації 0,7 М не впливають на рівень пероксидації ліпідів у системі “тромбоцити-плазма” на етапі експозиції.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально встановлена висока ефективність способу кріоконсервування концентратів тромбоцитів у кріозахисному середовищі на основі комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД у кінцевій концентрації 0,7 М при застосуванні розробленої програми заморожування з контрольованою швидкістю охолодження у температурному інтервалі кристалізації, дозволяє рекомендувати його при подальшому створенні технології довгострокового зберігання тромбоцитів для клінічного застосування. Практичне значення для роботи низькотемпературних банків крові мають отримані у роботі експериментальні дані про можливість збільшення до 18 – 24 годин проміжку часу між виділенням і заморожуванням концентратів тромбоцитів (загальноприйнятий термін 4 – 6 годин) за умови їх зберігання при температурі 22 ± 2 єC і постійному перемішуванні. Розроблено новий спосіб максимального видалення кріопротекторів із суспензії тромбоцитів за умов мінімального механічного та осмотичного навантаження на кров’яні пластинки [Пат. №15014 Україна, 2006]. Показано, що для більш повної оцінки морфофункціонального стану тромбоцитів на етапах кріоконсервування доцільним є застосування методу люмінесцентної мікроскопії, який базується на різній здатності кров’яних пластинок акумулювати акридиновий оранжевий (АО) в залежності від їх структурної цілісності та функціональних властивостей.

Особистий внесок дисертанта. Дисертантом самостійно підготовлено огляд літератури за темою дисертації, отримано експериментальні дані, проведено статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів досліджень. В опублікованих спільно зі співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

– в роботах [2,6,7,8,9] у визначенні інтенсивності ПОЛ в системах “тромбоцити-плазма”, “тромбоцити-плазма-кріопротектор”; дослідженні здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі; проведенні статистичної обробки отриманих результатів;

– в роботах [1,3,4,5] у здійсненні виділення концентратів тромбоцитів, плануванні та проведенні експериментів з дослідження впливу методу виділення концентратів тромбоцитів, кріопротекторів, режимів заморожування на морфофункціональні властивості тромбоцитів; відпрацюванні способу видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів; проведенні статистичної обробки отриманих результатів; визначенні ступеня пошкодження тромбоцитів за активністю цитозольних ферментів у позаклітинному середовищі; відпрацюванні методики приготування цитологічних препаратів та проведенні люмінесцентної мікроскопії.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на щорічній конференції молодих учених ІПКіК НАН України “Холод у біології і медицині” (Харків, 2005 рік); конференції молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2005” (Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2005 рік); 4-й національній науково-практичній конференції з міжнародною участю “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека” (Смоленськ, Росія, 2005 рік), ІХ Українському біохімічному з’їзді (Харків, 2006 рік).

Публікації. За матеріалами дисертаційного дослідження опубліковано 9 робіт, з яких: 4 наукових статті у спеціалізованих фахових виданнях, 4 тез доповідей на наукових конференціях, 1 деклараційний патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертацію викладено на 162 сторінках друкованого тексту, з яких 124 сторінки основного змісту. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, переліку використаних літературних джерел (22 сторінки), що вміщує 222 джерела. Дисертацію ілюстровано 7 таблицями та 48 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

Матеріалом для досліджень були концентрати тромбоцитів (КТ), отримані фракціонуванням донорської крові, заготовленої на консерванті “Глюгіцир” в полімерні контейнери “Гемакон”. Виділення КТ здійснювали двома методами: із збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) [Волкова Р.И. и др., 1992] та з лейко-тромбоцитарного шару (ЛТШ) [Аграненко В.А. и др., 1991]. Перед проведенням експериментальних досліджень КТ зберігали у контейнерах “Компопласт” до 18 – 24 годин при 22 ± 2 єC в умовах постійного перемішування зі швидкістю 2 об/хв. У межах 2 – 4 годин після виділення КТ визначали його кількісний склад [Перфильева Е.А. и др., 2003; Ронин В.С., 1983].

У роботі використовували кріопротектори: ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ, гліцерин (ГЛ), оксиетильований гліцерин зі ступенем полімеризації 5 (ОЕГn=5), очищені та ідентифіковані у відділі кріопротекторів ІПКіК НАН України. З метою мінімізації осмотичного стресу додавання розчинів кріопротекторів до КТ у співвідношенні 1:1 здійснювали при 22 ± 2 єC у відповідності до рекомендованих схем [ArnaudF.G. etal., 1990; Компаниец А.М., 1992; 1995; WoodsE.J. etal., 1999]. Дослідження здатності кріопротекторів до перехоплення гідроксильних радикалів у модельній системі їх генерації проводили за методом [HalliwellB. еt al., 1987]. Визначення вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у системах “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” здійснювали за методом [AsakawaJ., 1980]. Кінцеві концентрації ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складали 0,5; 0,7 та 1 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М; час експозиції КТ з кріопротекторами – 5; 15; 30 хвилин. Інтенсивність індукованого іонами заліза ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” та “тромбоцити-плазма-кріопротектор” визначали за методом [Владимиров Ю.А., 1972] одразу після введення індуктора та через 15 і 30 хвилин. Кінцева концентрація ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ГЛ складала 0,7 М; ОЕГn=5: 0,25 та 0,125 М.

Морфофункціональні властивості тромбоцитів: здатність накопичувати АО [Деменко В.Д. и др., 1990], здатність до індукованої АДФ та колагеном агрегації [BornG.V.R., 1962], реакцію на гіпотонічний шок (РГШ) [Компаниец А.М., 1992] досліджували у межах 2 – 4 годин після виділення КТ та після 18 – 24 годин зберігання, а також після експозиції КТ з ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ у кінцевих концентраціях 0,7 та 1,4 М протягом 5; 30 хвилин і наступного видалення кріопротекторів розробленим способом [Пат. № 15014 Україна, 2006]. Агрегаційну здатність тромбоцитів додатково визначали у присутності вищезазначених кріопротекторів у кінцевій концентрації 0,1 М. Ступінь пошкодження кров’яних пластинок на етапах виділення та зберігання КТ визначали за активністю у супернатанті ферменту лактатдегідрогенази (ЛДГ) [Лемешко В.В. и др., 1989]. Ступінь пошкодження тромбоцитів на етапі експозиції КТ з кріопротекторами визначали за активністю у супернатанті ферментів: ЛДГ та Г6ФДГ [Родионова В.Л. и др., 2005]. Кінцеві концентрації ДМСО, 1,2-ПД, ДМАЦ складали 0,7 М, а комбінацій ДМАЦ + 1,2-ПД: 0,7 та 0,35 М; час експозиції КТ з кріопротекторами та їх комбінаціями становив 15 хвилин.

Кріозахисні розчини (1,4 М ДМСО, ДМАЦ, 1,2-ПД, ДМАЦ + 1,2-ПД та 0,7 М ДМАЦ + 1,2-ПД на плазмі, плазма без кріопротектора) вводили в КТ у співвідношенні 1:1 при 22 ± 2 єC протягом 1 хвилини, одразу після чого здійснювали заморожування зразків за допомогою програмного заморожувача “Cryoson” (Німеччина) у кріоампулах “Nunc”. Об’єм зразка становив 1,6 мл.

При порівняльному дослідженні ефективності кріоконсервування КТ, виділених з донорської крові двома методами, застосовували ДМСО у кінцевій концентрації 0,7 М та програму заморожування №1.

При дослідженні впливу процедури заморожування КТ в температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 °C) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей кріоконсервованих тромбоцитів застосовували наступні програми:

програму №1: охолодження зразка від 22 ± 2 °C до -35…-40 °C проводили зі швидкістю 1°C/хв, після чого – занурювали у рідкий азот;

програму №2: зразок охолоджували аналогічно програмі №1, але додатково вводили процедуру температурної ініціації кристалізації, після чого застосовували контрольовану швидкість охолодження 6 – 7 °C/хв;

програму №3: охолодження зразка проводили аналогічно програмі №2, але після процедури температурної ініціації кристалізації зменшували швидкість його охолодження до 0,2 – 0,3 °C/хв.

Заморожування зразків за зазначеними програмами здійснювали з кріопротектором та без нього. При застосуванні програм, що передбачали процедуру температурної ініціації кристалізації, величина переохолодження не перевищувала 0,5 – 1 °С.

При дослідженні впливу швидкості заморожування КТ з ДМСО в зоні евтектичних температур (від -35…40 до -80 єC) на показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів застосовували програми №4 – №7 (табл. 1).

Показники структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів, отримані після кріоконсервування КТ за програмами №4 – №7, порівнювали з відповідними показниками після заморожування КТ того ж донора за програмами №1, №2 та №8 [BalintB. еtal., 2006], що за даними літератури забезпечує високий рівень збереженості кров’яних пластинок. При дослідженні кріозахисної ефективності середовищ різного композиційного складу застосовували програми заморожування №1 та №2.

Таблиця 1

Програми заморожування №4 – №7

Відігрівання зразків здійснювали на водяній бані при 37 °C, одразу після чого проводили оцінку кількісної збереженості тромбоцитів та визначення ступеня їх пошкодження за активністю в супернатанті цитозольних ферментів. Ступінь пошкодження тромбоцитів після термоциклювання (Т) приймали за 100 %. Морфофункціональні показники кріоконсервованих клітин визначали після видалення кріопротектора.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили із застосуванням критерію Стьюдента та непараметричного критерію Вілкоксона-Манна-Уітні.

Результати досліджень та їх обговорення

Відомо, що процедура отримання КТ спричиняє зміну морфофункціонального стану певної частини кров’яних пластинок, їх активацію [BodeA.P., 1990; EstebanellE. etal., 2000]. Ступінь активації залежить від умов та способу виділення клітин [BцckM. etal, 2002]. На першому етапі досліджень, при оцінці морфофункціонального стану тромбоцитів, виділених з донорської крові двома різними методами, ми застосували люмінесцентну мікроскопію, яка базується на здатності кров’яних пластинок акумулювати в гранулярному апараті флуорохром АО. Порівняльний аналіз співвідношення морфологічних форм тромбоцитів в препаратах ЗТП та КТ показав, що останні містять значно більшу кількість активованих гранулярних, агранулярних форм (рис. 1) та агрегатів тромбоцитів, характеризуються нижчим показником гранулярності та вищим ступенем мікровезикуляції (табл. 2). Зазначені ознаки активації тромбоцитів виявилися більш вираженими в препаратах КТ із ЗТП, ніж КТ з ЛТШ.

Таблиця 2

Показники активації тромбоцитів ЗТП, КТ з ЛТШ та КТ із ЗТП (М ± у, n = 6)

Примітка: * – відмінності статистично достовірні порівняно з відповідним показником ЗТП, та КТ з ЛТШ, Р_U <0,05.

У межах 2 – 4 годин після виділення КТ спостерігалося значне пригнічення індукованої АДФ і колагеном агрегації кров’яних пластинок у порівнянні з даними для ЗТП (рис. 2А, 2Б). При цьому агрегація тромбоцитів КТ з ЛТШ була достовірно вищою від агрегації тромбоцитів КТ із ЗТП. Протягом наступних 18 – 24 годин зберігання КТ при 22 ± 2 єС агрегаційна здатність тромбоцитів


8-09-2015, 21:55