Вплив граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і стійкість мембран еритроцитів до гемолізу

Харківський Національний університет імені В.Н. каразіна

Адіб Халаф Фадел АлАмуш

УДК 577.352+577.182.26

Вплив граміцидину S на агрегаціютромбоцитів і стійкість мембран еритроцитів до гемолізу

03.00.13 - фізіологія людини i тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Перський Євген Ефроїмович,

Харківський національний університет імені В.Н.Каразіна, завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Гордієнко Євген Олександрович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

завідувач відділу низькотемпературного консервування

доктор біологічних наук, професор

Клімова Олена Михайлівна,

Державне підприємство Інститут хірургії АМН України,

завідувач діагностичної лабораторії

Захист відбудеться 09.04.2008 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.17 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна МОН України, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитися в Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна МОН України: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.

Автореферат розісланий 07.03.2008 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Взаємодія біологічно активних сполук з клітинними мембранами лежить в основі протікання і регуляції великої кількості фізіологічних процесів, і її вивчення є однією з найважливіших проблем біології.

Хоча сучасна фізіологія досягла суттєвих успіхів у дослідженні цієї проблеми, багато ще у ній залишається незрозумілим. Це стосується і молекулярних механізмів взаємодії ряду антибіотиків, зокрема, граміцидину S, з клітинними мембранами.

Граміцидин S має різнобічну біологічну активність. Подавляючи грампозитивні та, дещо слабкіше, грамнегативні бактерії, він в той же час згубно діє на клітини тваринного организму. Саме тому він використовується в медицині лише як зовнішній лікарський засіб [Гаузе Г.Ф., 1952, Арнаудов Г.Д., 1978 ].

Однак, незважаючи на більш ніж півстолітню історію використання антибіотику після його повного хімічного синтезу, чітких уявлень про причини та механізми його біологічної активності досі не існує.

Усі наявні уявлення зводяться лише до природного припущення про те, що руйнування фосфоліпідних мембран при взаємодії з граміцидином S є результатом його особливих властивостей, характерних для будь-яких дефектоутворюючих часток на межі мембрана - оточуючий розчин [ EdidinV, 2002].

Практично не існує навіть феноменологічного опису загальних рис і особливостей взаємодії антибіотика з різними типами тваринних клітин. До цього часу дослідження проводились, в основному, на модельних фосфоліпидних мембранах, а ефекти граміцидину S оцінювались лише за його гемолітичною дією[Гаузе Г.Ф.,1952; Егоров Н.С.,1994] . В той же час практично не вивчались особливості дії граміцидину S на мембрани нативных клітин. Немає відомостей про вплив ліпідного складу плазматичних мембран на характер біологічної активності граміцидину S. Невідома роль структурного стану мембран в їх стійкості по відношенню до нього. До сих пір за межами уваги дослідників залишались також, як правило, характер і ступінь впливу антибіотика на структурно-функціональні властивості клітин еукаріот.

Між тим, необхідність таких досліджень визначається, як мінімум, двома причинами По-перше, такі відомості важливі для розуміння загальних принципів взаємодії сполук, подібних до граміцидину S, з мембранами клітин. По-друге, вони, в принципі, можуть бути корисними для з’ясування шляхів зниження активності граміцидину S по відношенню до тваринних клітин без втрати його протимікробної активності.

Для вирішення цих проблем доцільним є вивчення дії граміцидину S на клітини крові, насамперед, на тромбоцити і еритроцити. Це визначається головним чином тим, що при потраплянні в організм граміцидина S він неминуче повинен взаємодіяти з цими клітинами. Тромбоцити та еритроцити, в свою чергу, відіграють найважливішу роль в процесах гемостаза та транспорта сполук відповідно. Серед цих процесів головними є агрегація тромбоцитів і постачання в тканини кисню та вилучення з них вуглекислого газу. Крім того, на цей час накопичені фундаментальні відомості про структурну організацію, властивості та функції цих клітин [MurrerE.H., DayH.I., 1974; WalshP.N., 1974; McMillanD.C., PowellC., BowmanZ.S., 1995; GnatenkoD.V., PerrottaP.L., BahouW.I., 2006]. Тому вони є хорошими та досить зручними моделями для вивчення дії граміцидину S, оскільки характер їх змін при цьому дозволить зробити висновки про механізми біологічної активності антибіотика.

В зв’язку з цим актуальним є вивчення впливу граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і стійкість еритроцитів до гемолізу invitroу середовищах різного іонного складу і при модифікації структурного стану мембран фізичними і хімічними факторами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана відповідно з планом науково-дослідних робіт Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна: в рамках держбюджетних тем "Закономірності фізико-біохімічних та структурно-функціональних механізмів адаптації біологічних сполук до несприятливих факторів середовища в онтогенезі" (№ держреєстрації 0103U005734) та “Механізми впливу фізичних факторів і біологічно активних речовин на ДНК, білки та біомембрани" (№ держреєстрації 0197U016741)

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було встановлення закономірностей агрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів під впливом граміцидину S за умов дії різних факторів, що змінюють хімічний склад та структурний стан мембран.

Для вирішення цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Дослідити концентраційну залежність впливу граміцидину S на зміни форми тромбоцитів.

2. Вивчити концентраційну залежність впливу граміцидину S на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів за умов дії різної концентрації Са²⁺ і Mg²⁺ та оцінити енергію активації цього процесу.

3. Дослідити вплив різних фізико-хімічних чинників (температура, іонізуюче опромінення, перекисне окислення ліпідів мембран) на АДФ-індуковану агрегацію тромбоцитів.

4. Вивчити концентраційну залежність гемолізу еритроцитів під дією граміцидину S та оцінити енергію активації цього процесу.

5. Дослідити вплив ліпідного складу та перекисного окислення ліпідів мембран еритроцитів на їх гемоліз за дією граміцидину S.

Об'єкти дослідження - комплекси граміцидину S з мембранами тромбоцитів і еритроцитів.

Предмет дослідження – агрегація тромбоцитів та гемоліз еритроцитів під впливом граміцидину S.

Методи дослідження – оптичний метод реєстрацій агрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів, спектрофотометрія, полум'яна фотометрія, полярізаційно-флуоресцентна мікроскопія, тонкошарова хроматографія, визначення продуктів ПОЛ, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі було вивчено вплив граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів в умовах модифікації плазматичних мембран г-опроміненням та біологічно активними сполуками. Вперше встановлено, що взаємодія граміцидину S з інтактними тромбоцитами призводить до їх набрякання і зміни форми, подібної до такої, що відбувається під впливом відомих індукторів агрегації. Цей процес є Са²⁺ , Mg²⁺ - залежним.

Вперше продемонстровано, що граміцидин S руйнує агрегати тромбоцитів, що утворюються під впливом індукторів агрегації, не руйнуючи при цьому плазматичну мембрану клітин.

Встановлено, що зменшення впорядкованості ліпідів у плазматичній мембрані тромбоцитів та еритроцитів при їх г-опроміненні чи перекісному окисленні ліпідів веде до полегшення вбудовування граміцидину S до мембрани, але, водночас, призводить й до зменшення міцності зв'язування антибіотика до неї.

Показано, що ступінь і швидкість дезагрегації тромбоцитів граміцидином S найбільші в області структурних фазових переходів ліпідів мембран (18⁰ С – 33⁰ С). При вищих температурах ці параметри дезагрегації знижуються, що свідчить про більшу стійкість агрегатів при температурі тіла.

На еритроцитах здорових донорів і людей з серцево-судинними захворюваннями вперше доведено, що біологічна активність граміцидину S залежить від вмісту холестерину та відношення холестерин/фосфоліпіди в мембранах. Його збільшення знижує гемолітичну дію антибіотика по відношенню до цих клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані експериментальні результати виявили характер взаємодії граміцидину S з інтактними тромбоцитами і еритроцитами - набрякання, зміна форми і руйнування агрегатів перших і гемоліз других, а також особливості цих процесів в залежності від структурного стану клітинних мембран – рівня їх розпорядкованості під дією іонізуючого опромінення, перекисного окислення ліпідів і відношення холестерин/фосфоліпіди. Отримані дані розширюють уявлення про механізми взаємодії пептидних антибіотиків з клітинними мембранами і можуть бути використані при розробці штучних антибіотиків, не руйнуючих тваринні клітини. Їх можна також залучати при читанні загальних і спеціальних курсів лекцій «Біоорганічна хімія», «Біохімія», «Клітинна фізіологія» тощо у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і задач, вибір об'єктів та методів досліджень, обговорення та інтерпретація одержаних експериментальних результатів і формулювання висновків було здійснено разом з науковим керівником.

Автор особисто опрацював фахову літературу за темою дисертації, виконав експериментальні дослідження і провів статистичний аналіз одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені і обговорені на: конференції молодих вчених біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Карабіна (2005), І Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2005), засіданні Харківського біохімічного товариства (2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), ІV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, у тому числі 4 статті у фахових наукових журналах та 3 в матеріалах і тезах конгресів, з'їздів, конференцій, які повністю відбивають основний зміст дисертації.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 148 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків. Список використаних літературних джерел містить 218 найменувань. Робота ілюстрована 21 рисунком і 14 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлені дані про структуру, властивості і біологічну дію граміцидину S на бактеріальні і тваринні клітини. Розглянуті сучасні уявлення про основи його біологічної активності, а також не з’ясовані ще молекулярні механізми взаємодії антибіотика з нативними мембранами.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Дослідження проведені на тромбоцитах і еритроцитах здорових донорів і людей з серцево-судинними захворюваннями (атеросклероз і післятромбофлебічний синдром) обох статей віком 41 – 60 років.

Збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) та еритроцитарну масу одержували з крові методами [MacCenzieR.D., 1974] та [GrossmanS.J. andJollowD.J.,1992] відповідно. В усіх експериментах кількість клітин в ЗТП становила, в середньому, ~ 2,5 Ч 10⁸ / мл, а в суспензії еритроцитів ~ 10⁶ / мл. Кількість клітин у зразках підраховували в камері Горяєва. Тромбоцити фарбували метиленовим синім.

Отримані зразки зберігали у скляному силикованому посуді і всі вимірювання проводили на протязі 3 – 5 годин після приготування і не пізніше 24 годин після отримання крові.

Агрегацію тромбоцитів викликали додаванням до 0,9 мл ЗТП 0,1 мл розчину АДФ (Reanal, Угорщина) в концентрації 2 Ч 10 ^-5 М.

Для дослідження впливу граміцидину S на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів 2-% розчин антибіотика в етанолі (фармацевтичний препарат, Фармахим, РФ), розводили розчином 0,15 М NaCl, рН 7,4 в 30 – 50 разів до концентрації, в якій він додавався до ЗТП та суспензії еритроцитів. Попередні контрольні досліди показали, що етанол в концентрації до 1% не впливає на агрегацію тромбоцитів і гемоліз еритроцитів.

Процеси агрегації тромбоцитів і гемолізу еритроцитів в різних експериментах вивчали за змінами світлопропускання (Т), або оптичної густини (D) [Лопатин В.Н.,Седько Ф.Я.,1988]. Вимірювання проводили на фотоелектроколориметрі ФЕК-М з максимумами світло пропускання 540 нм для ЗТП і 670 нм для еритроцитарної суспензії. Запис кінетики досліджуваних процесів проводили автоматично на самописці ЕПП-09М.

За одержаними кінетичними кривими визначали ступінь і швидкість цих процесів. Ступінь агрегації і дезагрегації тромбоцитів та гемолізу еритроцитів розраховували, як різницю між початковими і поточними значеннями світлопропускання (∆Т), або оптичної густини (∆D) і виражали в абсолютних величинах. Для обох типів клітин швидкість досліджуваних процесів визначали за тангенсом кута нахилу дотичної до відповідної ділянки кінетичної кривої на її піввисоті. Для еритроцитів виміряли також час їх повного гемолізу.

По кривим швидкості гемолізу еритроцитів і дезагрегації тромбоцитів в діапазоні температур 4⁰ С- 44⁰ С за рівнянням Ареніуса розраховували енергії активації цих процесів.

Структурні властивості мембран тромбоцитів і еритроцитів змінювали шляхом індукції перекисного окислення ліпідів (ПОЛ). Для цього ЗТП і суспензію еритроцитів інкубували протягом 15 хв з 0.5 М аскорбінової кислоти і 12 мкМ солі Мору. Інгібування ПОЛ здійснювали розчином (50 мкг/мл) б - токоферолу в гексані (Sigma, США). Інтенсивність ПОЛ тромбоцитарних і еритроцитарних мембран оцінювали за накопиченням в зразках сполук малонового діальдегіду (МДА) по реакції з 2-тіобарбітуровою кислотою. Концентрацію МДА розраховували на основі коефіцієнту його молярної екстинкції (е = 1,53 Ч 10⁵ М^-1 см^-1 Ч л) за інтенсивністю поглинання при л = 532 нм [EsterbauerH., CheesemanK.H., 1990].

Концентрацію білка в зразках визначали за методом Лоурі [LowryO. еtal., 1955].

Тромбоцити також опромінювали г - випромінюванням ⁶⁰ Со дозами 2,58 Ч 10^-4 Кл/кг і 6,45 Ч 10^-3 Кл/кг на установці «Исследователь» при потужності випромінюваної дози в активній зоні 5,16 Ч 10^-2 Кл/кг/хв.

Для зв’язування вільних іонів плазми Са²⁺ і Мg²⁺ ЗТП інкубували відповідно з ЕГТА і ЕДТА (Sigma, США) в концентраціях 0,05 – 2 мМ протягом 2 хвилин. Концентрацію Са²⁺ і Мg²⁺ в зразках виміряли на полум'яному спектрофотометрі СФП-1.

Процеси утвлрення і розпаду тромбоцитарних агрегатів контролювали мікрофотографічно цифровою камерою CannonEOS 300Dна поляризаційно – флуоресцентному мікроскопі мPOLAM-Lпри 100-кратному збільшенні.

Мембрани еритроцитів отримували за методом [GrossmanS.J., JollowD.J.,1992]. Ліпіди мембран еритроцитів екстрагували за методом [Bligh E.G., Dyer W.J., 1959].

Фракціонування загальних ліпідів проводили тонкошаровою хроматографією на силікагелевих платівках марки Sulufol UV 254 (Sklarny Kavalier, Чехія). Розподіл фосфоліпідів проводили методом тонкошарової хроматографії на платівках Silicagel

Wolem TLC (Германія).

Ідентифікацію ліпідів виконували за допомогою стандартів (“Sigma”, США). Кількісний вміст фракцій проведено відповідно до стандартних методик (Фіндлей Дж., Еванз У., 1990).

Якщо про це не зазначено спеціально, всі експерименти проводили при кімнатній температурі (t = 20⁰ С).

Для статистичної обробки результатів використовували критерій вірогідності Стьюдента та Манн-Уітні. Вірогідними вважали результати с р<0,05. Криві, що представлені на рисунках, є типовими для серії повторних дослідів (не менше, ніж три в кожній серії).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження впливу граміцидину S на інтактні тромбоцити.

З метою дослідження особливостей впливу граміцидину S на інтактні тромбоцити були вивчені часові залежності світлопропускання ЗТП в присутності різних концентрацій антибіотика. Динаміка світлопроскуння ЗТП після додавання до неї граміцидину S являє собою криву з максимумом (Рис.1). Збільшення світлопропускання, про яке свідчить висхідна частина кривої, є наслідком зміни розсіювачої здібності поверхні тромбоцитів, що відбувається за рахунок зміни їх розміру і форми. Цей ефект повністю аналогічний першій стадії дії класичних індукторів агрегації, коли зміни світлопропускання ЗТП виникають за рахунок активації тромбоцитів – їх набрякання, зміни форми і звільнення рецепторів до фібриногену. Їх взаємодія з молекулами останього утворює в подальшому фібриногенові містки, які з’єднують окремі тромбоцити в агрегати [SeissW., 1989; Blockmansetatal, 1995; ТomasiakM.etal., 2004].

Зниження світлопропускання ЗТП після досягнення максимуму (низхідна частина кінетичної кривої) відображає зворотний процес – частковий розпад агрегатів, що формуються під впливом індукторів, в умовах invitro[SeissW., 1989; Сабаль ?,?, Черенкевич ?,?, 1990; ТomasiakM.etal., 2007].

Таким чином, дія граміцидину S на інтактні тромбоцити аналогічна дії індукторів агрегації і полягає в зміні їх форми і активації.

Наступна дія індуктора агрегації АДФ на тромбоцити, що були активовані граміцидином S, призводить до подальшого розвитку агрегації (Рис.1). Але ступінь агрегації при постійній концентрації АДФ зменшується з підвищенням концентрації антибіотика (Табл..1). Це явище можна зрозуміти, виходячи з того, що існує критична концентрація граміцидину S, після котрої він починає руйнувати тромбоцити. Дійсно, як видно з рис. 1, при концентрації 7,8 мкмоль/л, шо відповідає 14,94 Ч10⁶ молекул граміцидину S, які припадають на один тромбоцит, низхідна частина кінетичної кривої перетинає початковий рівень свїтлопропускання. Оскільки він відповідає нативним клітинам, негативна величина світлопропускання свідчить про руйнування частини тромбоцитів в ЗТП [LatimerP. etal, 1977]. Це і є причиною зменшення ступеня агрегації під дією АДФ. Час початку руйнування тромбоцитів зменшується з підвищенням вмісту граміцидину S в ЗТП після досягнення ним критичної концентрації (Табл.1).

Табл.1.

Концентраційні залежності впливу граміцидину S на зміни форми тромбоцитів і ступінь їх агрегації наступної дії АДФ.

Примітка:* - вірогідно відносно мінімальної концентрації граміцидину S (р < 0,05)

** - вірогідно відносно попередньої концентрації граміцидину S (р < 0,05)

Суттєвим є питання про роль іонів Са²⁺ і Мg²⁺ у взаємодії граміцидину S з тромбоцитами. Іони Са²⁺ відіграють важливу роль в процесі агрегації тромбоцитів, оскільки вони беруть участь у формуванні центру зв’язування рецепторів до фібриногену з його молекулами [SanerheberR.D. etal, 1980;RinkT.J., 1988]. В той же час немає повного розуміння відносно природи цього кальцію – позаклітинний він, або внутріклітинний, який міститься у кальцієвих депо тромбоцитів [ТomasiakM.etal., 2007]. Щодо іонів Мg²⁺ , то в широкому діапазоні концентрацій вони не впливають на агрегацію, а у

концентраціях вищих, ніж фізіологічні, – пригнічують її. Що ж стосується впливу малих концентрацій, то й тут гадки дослідників неоднозначні [KempfertG., BehrendsS., 2003].

Тому у діапазоні від малих до середніх


8-09-2015, 23:24