Міністерство охорони здоров’я України
Луганський державний медичний університет
Журба Тетяна Олексіївна
УДК 612.017.1:616:579
ВПЛИВ БІОЛОГІЧНИХ ФЛОГОГЕННИХ ФАКТОРІВ НА
ЕПІТЕЛІОЦИТИ ПІХВИ В ЕКСПЕРИМЕНТІ
14.03.04 – патологічна фізіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Луганськ-2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Луганському державному медичному університеті МОЗ України
Науковий керівник:
доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Казімірко Ніла Казімірівна, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувачка кафедри патофізіології
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Непорада Каріне Степанівна, Вищий державний навчальний заклад “Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, завідувачка кафедри медичної, біологічної та біоорганічної хімії
доктор медичних наук, професор Файфура Василь Васильович, Тернопільський державний медичний університет ім. І.Я. Горбачевського МОЗ України, професор кафедри патологічної фізіології
Захист відбудеться “04” квітня 2008 р. об 11.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.02 при Луганському державному медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1)
Автореферат розісланий “03” березня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько В.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Дослідження останніх років свідчать, що 95 % всіх виділень з піхви можуть бути пов’язані з 5 основними станами: бактеріальним вагінозом (БВ), кандидозним вульвовагінітом, цервіцитом (обумовленим Chlamydia trachomatis, вірусом простого герпесу або Neisseria gonorrhoeae), підвищеною цервікальною секрецією та трихомонадним вагінітом (Анкирская А.С., 1995). В Україні, як і в інших країнах Європи, БВ посідає перше місце серед інфекцій піхви, частота його виявлення під час вагітності складає 6-32 % (Трушкіна С.С., 1999). БВ є вторинним захворюванням, але він здатний суттєво впливати на репродуктивну систему, викликаючи у вагітних передчасний вилив навколоплідних вод внаслідок деструкції плідного пухиря; відома роль БВ в розвитку прееклампсії та жіночого безпліддя (Олійник Н.М., 1998).
Незалежно від якісного та кількісного складу мікрофлори, яка ініціює розвиток БВ, основними факторами, які ушкоджують, при цьому є токсини, ферменти, метаболіти мікроорганізмів, а також їх структурні компоненти – тейхоєві кислоти (ТК), пептидоглікани (ПГН) та ліпополісахариди (ЛПС) (Флегонтова В.В. та ін., 2000). Вони вивільняються при деструкції бактеріальних клітин, мають певну біологічну активність та здатні ушкоджувати тканини репродуктивних органів, насамперед, епітелій піхви (Левченко Т.В., Казимирко Н.К., 2006; Fahey J.V. et al., 2005). Механізми дії, що ушкоджує, ТК, ПГН та ЛПС до нинішнього часу вивчені недостатньо (Гайдаш І.С. та ін., 2000).
ТК, ПГН та ЛПС є біологічно активними речовинами, які впливають на функціональну активність нейтрофілів, моноцитів, лімфоцитів та інших клітин, а саме – здатні стимулювати секрецію широкого спектру медіаторів – інтерлейкінів (ІЛ), фактора некрозу пухлини (ФНП), простагландинів (ПГ) та ін. (Хулуп Г.Я. та ін., 2004). Відомий вплив ТК, ПГН та ЛПС на активність процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), системи антиокислювального захисту (АОЗ), циклічних нуклеотидів та експресію рецепторів до маркерів апоптозу у клітинах імунної системи, пухлинних клітинах (Рубан Т.В. та ін., 2001).
Таким чином, актуальність роботи пояснюється незадоволеністю результатами вивчення взаємодії бактерій з клітинами макроорганізму при БВ, що потребує додаткового дослідження патогенетичних ланок цього процесу.
Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом наукової роботи кафедри патофізіології Луганського державного медичного університету (ЛДМУ) № 0198U005713 “Запалення як результат дії бактерій”. Авторка є співвиконавцем комплексної теми.
Мета і задачі дослідження: Встановити механізми впливу структурних компонентів бактерій на метаболічний статус епітеліоцитів піхви.
Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:
Вивчити in vitro:
1. Біохімічний статус епітеліоцитів піхви здорових жінок та пацієнток з БВ.
2. Вплив ТК, ПГН та ЛПС бактерій – збудників БВ – на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок.
3. Вплив ТК, ПГН та ЛПС бактерій – збудників БВ – на активність ПОЛ та систему АОЗ епітеліоцитів піхви здорових жінок.
4. Вплив ТК, ПГН та ЛПС бактерій – збудників БВ – на систему циклічних нуклеотидів та експресію рецепторів до маркерів апоптозу CD38 та CD95 епітеліоцитами піхви здорових жінок.
Об'єкт дослідження: епітеліоцити піхви здорових жінок та пацієнток з БВ.
Предмети дослідження: біохімічний статус епітеліоцитів піхви здорових жінок та пацієнток з БВ; вплив in vitro ТК, ПГН та ЛПС бактерій – збудників БВ – на секрецію медіаторів, активність ПОЛ та систему АОЗ, систему циклічних нуклеотидів та експресію рецепторів до маркерів апоптозу CD38 та CD95 епітеліоцитами піхви здорових жінок.
Методи дослідження: біохімічні (визначення ДК, МДА, активності каталази, супероксиддисмутази (СОД), вмісту циклічних нуклеотидів), імунологічні (визначення вмісту інтерлейкінів, кахектину (ФНП-a), гамма-інтерферону (ІФН), простагландину Е2 (ПГ), трансформуючого фактору росту (ТФР), маркерів апоптозу CD38 та CD95), мікробіологічні (виділення ПГН, ТК та ЛПС з клітинних стінок бактерій), статистичні (методи варіаційної статистики).
Наукова новизна отриманих результатів. Показана здатність епітеліоцитів піхви продукувати ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-a, ТФР, ПГЕ2 та гамма-ІФН in vitro. Встановлені рівні секреції медіаторів, активності процесів ПОЛ, ферментів системи АОЗ, вмісту циклічних нуклеотидів, а також рівні експресії рецепторів до моноклональних антитіл CD38 та CD95 епітеліоцитами піхви здорових жінок та жінок, хворих на БВ різного ступеня тяжкості. Встановлений дозо- та часозалежний вплив ТК, ПГН та ЛПС бактерій – етіологічних агентів БВ – на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок in vitro. Встановлений дозозалежний вплив бактеріальних ТК, ПГН та ЛПС на вміст у епітеліоцитах піхви продуктів ПОЛ (ДК та МДА), на активність ферментів системи АОЗ (каталази та СОД). Показаний дозозалежний та видоспецифічний вплив бактеріальних ТК, ПГН та ЛПС на внутрішньоклітинний вміст в епітеліоцитах піхви цАМФ та ЦГМФ та експресію рецепторів CD38 та CD95.
Практичне значення отриманих результатів.Отримані дані дозволяють провести моніторінгову та скринінгову оцінку біохімічного статусу епітеліоцитів піхви здорових жінок та пацієнток з БВ різного ступеня тяжкості; дозволяють проводити корекцію секреторної активності епітеліоцитів піхви, інтенсивності процесів ПОЛ, активності ферментів системи АОЗ, стану системи циклічних нуклеотидів та експресії рецепторів до антитіл CD38 та СD95 шляхом зміни концентрації та тривалості контакту клітин з флогогенними бактеріальними факторами. Отримані дані використовуються в навчальному процесі кафедр патофізіології і мікробіології Луганського державного медичного університету Мінздраву України, що підтверджено відповідними актами впровадження.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є завершеним науковим дослідженням Т.О. Журби. Вибір теми наукового дослідження, постановка мети, задач і обговорення одержаних результатів, планування роботи були здійснені разом з науковим керівником професором Н.К. Казімірко. Авторкою самостійно проведений: патентно-інформаційний пошук за допомогою бази даних “Medline”, аналіз літератури за темою дисертації, виконана експериментальна частина роботи, вивчені та узагальнені результати проведених досліджень, обґрунтовані наукові висновки і рекомендації для практичного використання одержаних результатів, написані всі розділи дисертації та автореферат.
Апробація роботи. Основні наукові положення дисертації оприлюднені та обговорені на засіданнях: наукової конференції “Четверті читання імені В.В. Підвисоцького” (Одеса, 2005); X міжнародного медичного конгресу студентів і молодих учених Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського (Тернопіль, 2006); 101-го щорічного засідання Товариства анатомів Німеччини (Фрайбург, 2006); 23-ї сесії Товариства анатомів Німеччини (Вюрцбург, 2006); Міжміської конференції молодих вчених наукового товариства патофізіологів “Актуальні проблеми патофізіології” (Санкт-Петербург, 2007); Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, молодих вчених та інтернів “Актуальні проблеми фундаментальної медицини (англійською мовою)” (Луганськ, 2007), а також на засіданнях Луганського обласного товариства патофізіологів протягом 2004-2007 рр.
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 наукових статей та 5 тез в часописах та збірках, які відповідають вимогам ВАК України та надруковані згідно вимог, викладених в пункті 3 Постанови ВАК України від 15 січня 2003 р. за № 7-05/1.
Обсяг і структура дисертації. Робота написана на 139 сторінках комп'ютерного набору та складається з вступу, огляду літератури, 3 розділів власних досліджень, аналізу одержаних результатів, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 21 таблицею, 3 рисунками. Список літератури включає 138 джерел вітчизняних та іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал і методи дослідження.Епітеліоцити одержували шляхом піхвових лаважей від 25 здорових жінок-добровольців під час профілактичних оглядів, проведених у поліклініці № 10 м. Луганська з 2005 по 2007 рр. Лаважну рідину отримували шляхом лаважей від 58 жінок віком від 19 до 45 років (середній вік – 30,7±0,33 роки), хворих на БВ. Робота виконувалась у відповідності до загальноприйнятих біоетичних норм: всі пацієнтки дали згоду на обстеження та участь у випробовуваннях, цифрові результати яких увійшли до даного дисертаційного дослідження. В піхву вводили стерильне гінекологічне дзеркало, а потім за допомогою стерильної піпетки, з’єднаної з одноразовим шприцом (об’єм – 10 мл), проводили лаваж 5 мл стерильного фосфатно-буферного розчину протягом 30 секунд. Рідину збирали в стерильну пробірку, центрифугували протягом 10 хвилин при 800 g і видаляли супернатант. Клітини, що залишилися, ресуспендували і використовували або негайно, або заморожували при -70ºС до використання. Результати були однаковими як при використанні свіжих клітин, так і епітеліоцитів, які заморожували. Чистоту пула епітеліальних клітин (>95 %) визначали шляхом підрахунку 100 клітин у 5 різних полях зору і виражали як середній відсотковий вміст клітин з характерними для епітеліоцитів морфологічними ознаками. В усіх дослідах використовували епітеліоцити піхви в концентрації (5,0±0,25)* 5 lg клітин/мл.
ПГН одержували з клітинних стінок бактерій за методом P.K. Peterson і співавт. ТК екстрагували з клітинних стінок 10 % трихлороцтовою кислотою. ЛПС одержували з культур бактерій Escherichia coli (серотип 055:B5, Sigma, Великобританія). Вивчення впливу на епітеліоцити ТК, ПГН та ЛПС проводили при їх концентрації 10,0; 50,0 і 100,0 мг/л в тест-середовищі при спільному культивуванні протягом 24, 48, 72 та 96 годин.
Вміст ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10, ІЛ-12, ФНП-a, гамма-ІФН, ПГЕ2 визначали в супернатантах клітин, отриманих після центрифугування (в здорових жінок) та в лаважній рідині (в пацієнток з БВ), імуноферментним методом. Вміст ТФР визначали з використанням тест-систем виробництва фірми BioSource International, США. Визначення МДА проводили за методом Стальної І.Д. та Гаришвілі Т.Г. (1977). Визначення ДК ненасичених вищих масних кислот здійснювали за методом Стальної І.Д. (1977). Активність каталази вивчали за Королюк М.А. і співавт. (1988). Активність СОД визначали спектрофотометричним методом. Всі показники ПОЛ та системи АОЗ вивчали в супернатантах епітеліоцитів, отриманих після центрифугування (в здорових жінок) та в лаважній рідині (в пацієнток з БВ). Визначення вмісту циклічних нуклеотидів (цАМФ і цГМФ) проводили радіоімунним методом. Експресію молекул CD38 і СD95 на поверхні епітеліоцитів піхви вивчали методом непрямої імунної флуоресценції. Отримані цифрові результати опрацьовували статистично.
Секреція медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок. Базальний рівень секреції ІЛ-1 інтактними епітеліоцитами піхви до 24-ї години інкубації перевищив показник секреції ІЛ-2 в 1,83 рази, ІЛ-6 – в 2,53 рази, ІЛ-8 – в 1,69 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12 – в 3,07 та 2,15 рази відповідно (р<0,05 у всіх випадках порівняння). Порівняною з секрецією ІЛ-1 виявилась секреція ФНП-a. Вміст ТФР в середовищі культивування епітеліоцитів піхви виявився в 3,0 рази нижчим, ніж вміст ФНП-a, а концентрація гамма-ІФН – в 3,58 рази (р<0,05 в обох випадках). Базальний рівень секреції гамма-ІФН епітеліоцитами піхви склав 2,6±0,15 пг/мл. Найменш активно епітеліоцити піхви in vitro секретували ПГЕ2, концентрація якого склала 0,83±0,04 пг/мл, що було в 10,36 рази нижче порівняно з секрецією ІЛ-1, та в 11,2 рази – порівняно з продукцією ФНП-a.
Для дослідження секреторної активності епітеліоцитів піхви здорових жінок in vivo проводили визначення концентрацій медіаторів у лаважній рідині піхви. Встановлено, що in vivo продукція епітеліоцитами піхви ІЛ-1 була в 1,39 рази нижчою, ніж in vitro (p<0,05), продукція ІЛ-2 – в 1,205 рази нижчою (р<0,05), ІЛ-6 – в 1,26 рази (р<0,05), ІЛ-8 – в 1,19 рази (р<0,05), ІЛ-10 – в 1,27 рази (р<0,05), ІЛ-12 – в 1,11 рази (р>0,05), ФНП-a - в 1,24 рази (р<0,05), ТФР – в 1,29 рази (р<0,05), гамма-ІФН – в 1,44 рази (р<0,05), ПГЕ2 – в 1,46 рази (р<0,05).
Стан ПОЛ та системи АОЗ епітеліоцитів піхви здорових жінок. Базальна активність процесів ПОЛ в інтактних епітеліоцитах піхви здорових жінок характеризувалась значенням внутрішньоклітинного вмісту ДК, яке дорівнювало 0,26±0,01 мкмоль/л, та значенням МДА, яке дорівнювало 0,43±0,02 мкмоль/л. Для базального рівня системи АОЗ була характерна активність каталази, яка дорівнювала2,47±0,12 мкмоль/год* л, та активність СОД, рівна 0,75±0,04 МО/мг Hb.
Система циклічних нуклеотидів та експресія маркерів апоптозу епітеліоцитами піхви здорових жінок. Вміст цАМФ в епітеліоцитах піхви здорових жінок складав, в середньому, 2,37±0,12 пкмоль/6 lg клітин, що було в 2,08 рази більше, ніж внутрішньоклітинний вміст цГМФ (1,14±0,06 пкмоль/6 lg клітин).
Відносний показник епітеліоцитів піхви, які експонували на цитоплазматичних мембранах рецептор до моноклонального антитіла CD38 (неспецифічного маркеру апоптозу), склав 4,16±0,21 %, тоді як кількість епітеліоцитів піхви, які мали рецептор до специфічного маркеру апоптозу CD95, склала в загальній популяції клітин 2,05±0,10 % (кратність переважання CD38+-клітин над CD95+-клітинами – 2,03 рази, р<0,05).
Секреція медіаторів епітеліоцитами піхви жінок, хворих на БВ. Вміст ІЛ-1 в лаважній рідині, отриманій від пацієнток з БВ, був в 2,58 рази вищим порівняно з аналогічним показником в групі здорових жінок; вміст ІЛ-2 – в 2,09 рази, ІЛ-8 – в 2,1 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12 – в 2,09 та в 1,78 рази відповідно (р<0,05 у всіх випадках). З усіх досліджених інтерлейкінів найбільша продукція була зареєстрована для ІЛ-1, абсолютний рівень якого перевищував концентрацію ІЛ-2 в 1,97 рази, ІЛ-6 – в 2,76 рази, ІЛ-8 – в 1,77 рази, ІЛ-10 та ІЛ-12, відповідно, в 3,48 та в 2,5 рази. Загальний вміст ІЛ-6 та ІЛ-8 склав 14,82 пг/мл.
Було відзначене значне збільшення вмісту ФНП-a, рівень якого в 2,18 рази перевищував аналогічний показник у групі здорових жінок. Збільшення концентрації ТФР в пацієнток з БВ склало 2,14 рази проти такої у здорових жінок, а кратність збільшення вмісту гамма-ІФН та ПГЕ2 – 2,78 та 2,0 рази відповідно.
Зі збільшенням ступеня тяжкості БВ секреторна активність епітеліоцитів піхви зростала, що мало прояв у збільшенні концентрацій досліджуваних медіаторів у лаважній рідині, отриманій з піхви пацієнток. Найбільша секреторна активність епітеліоцитів піхви була зареєстрована при IV ступені БВ, найменшу активність спостерігали у пацієнток з БВ I ступеня.
Стан процесів ПОЛ та системи АОЗ епітеліоцитів піхви жінок, хворих на БВ. В загальній групі хворих на БВ внутрішньоклітинний вміст ДК та МДА був суттєво вищим аналогічних показників у групі здорових жінок. Так, концентрація ДК в епітеліоцитах піхви, виділених від пацієнток з БВ, була вищою норми в 2,42 рази, а концентрація МДА – в 2,12 рази. Активність внутрішньоклітинних ферментів системи АОЗ в епітеліоцитах піхви пацієнток з БВ виявилась нижчою нормативних показників у 1,27 рази для каталази та СОД (р<0,05 в обох випадках). Внаслідок вказаних змін інтегральний показник ПОЛ/АОЗ збільшувався, перевищуючи показник в групі здорових жінок в 2,9 рази.
Підвищення активності процесів ПОЛ та зниження активності ферментів системи АОЗ мало місце у всіх групах жінок з БВ І-ІV ступенів. При цьому найменшу активність процесів ПОЛ та недостатність системи АОЗ спостерігали в жінок з БВ І ступеня, найбільшу – при ІV ступені захворювання.
Різноспрямовані зсуви в системах ПОЛ та АОЗ супроводжувались змінами коефіцієнту ПОЛ/АОЗ, абсолютні значення якого збільшувались. При БВ І ступеня коефіцієнт ПОЛ/АОЗ перевищував показник норми в 1,67 рази, при ІІ ступені – в 2,38 рази, при ІІІ та ІV ступенях – в 3,29 та в 4,67 рази відповідно.
Система циклічних нуклеотидів та експресія маркерів апоптозу епітеліоцитами піхви жінок, хворих на БВ. Внутрішньоклітинний вміст цАМФ в епітеліоцитах піхви пацієнток з БВ виявився в 1,13 рази вищим порівняно з аналогічним показником в групі здорових жінок. Внутрішньоклітинна концентрація цГМФ в епітеліоцитах піхви при БВ суттєво зменшувалась і була в 1,16 рази нижчою порівняно з такою в епітеліоцитах піхви здорових жінок. В зв’язку з вказаними змінами внутрішньоклітинного вмісту цАМФ та цГМФ інтегральний коефіцієнт цАМФ/цГМФ для епітеліоцитів піхви пацієнток з БВ був в 1,31 рази вищим, ніж в групі порівняння. У всіх випадках співставлення різниця між параметрами, які вивчали, була вірогідною.
В загальному пулі епітеліоцитів піхви, виділених від жінок, хворих на БВ, мало місце двократне збільшення кількості епітеліоцитів, які несли на цитоплазматичних мембранах рецептори до неспецифічних та специфічних маркерів готовності до реалізації апоптозної програми (СD38 та CD95). При цьому відносна кількість CD38+-епітеліоцитів піхви виявилась у 2,03 рази вищою, ніж CD95+-епітеліоцитів (р<0,05).
Виразність змін внутрішньоклітинного вмісту циклічних нуклеотидів в епітеліоцитах піхви, а також експресія маркерів апоптозу на даних клітинах збільшувались по мірі наростання ступеня дісбіотичних зсувів у жінок з БВ. Найбільш суттєві зміни досліджуваних показників були зареєстровані в групі пацієнток з БВ ІV ступеня.
Вплив ТК бактерій на секрецію медіаторів епітеліоцитами піхви здорових жінок in vitro. Стимулюючий вплив 10 мг/л ТК був неоднаковим в залежності від тривалості контакту з епітеліоцитами піхви здорових жінок. Найбільший стимулюючий ефект був зареєстрований на 96 годині культивування епітелоцитів з ТК. Найменша стимулююча дія мала місце на 24 годині досліду. Найбільш інтенсивно епітеліоцити піхви здорових
8-09-2015, 23:24