Порівняльний фармакологічний аналіз імунотропних властивостей ряду антибактеріальних препаратів, які застосовуються при туберкульозі легенів

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

Талат Хафіз Сулейман Абу-Кешк

удк:615.28:612.017:616.08

ПОРІВНЯЛЬНИЙ ФАРМАКОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ ІМУНОТРОПНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ РЯДУ АНТИБАКТЕРІАЛЬНИХ ПРЕПАРАТІВ, ЯКІ ЗАСТОСОВУЮТЬСЯ ПРИ ТУБЕРКУЛЬОЗІ ЛЕГЕНІВ

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття вченого ступеня

кандидата фармацевтичних наук

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Науково-дослідному інституті легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку) Міністерства охорони здоров’я Азербайджанської Республіки, і у Національному фармацевтичному університеті Міністерства охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ГАНІЄВ Муса Мехті Огли Азербайджанський медичний університет, завідувач кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор ДИКИЙ Ігор Леонідович Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри мікробіології

доктор біологічних наук, професор КЛІМОВА Олена Михайлівна Інститут загальної та невідкладної хірургії АМН України завідувачка діагностичною лабораторією

Захист відбудеться “ 21 ” березня 2008 р. о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “___” _________________ 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професор Л.М.Малоштан

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останні роки характеризуються розвитком епідемії туберкульозу (ТБ) у ряді країн, різкою зміною перебігу і структури клінічних форм інфекції.

Основним методом лікування ТБ є хіміотерапія, спрямована на знищення мікобактерій туберкульозу (МБТ). Хіміопрепарати, що застосовуються на різних етапах лікування, мають характерні для кожного з них механізми дії. Більшість протитуберкульозних препаратів (ПТП) справляє різноманітну дію на мікробну клітину, чим обумовлюються їх бактеріостатичний і бактерицидний ефекти. Комбінована хіміотерапія ПТП дозволяє запобігти або істотно затримати виникнення лікарсько-стійких штамів МБТ. Проте не можна виключати стан імунітету організму, що відіграє істотну роль у маніфестації туберкульозу.

В останній час ефективність антибактеріальної та симптоматичної терапії туберкульозу значно зменшилася. Зросла частота дисемінованих процесів, почастішали випадки (72,3%) прогресуючого перебігу з гострим початком і масивним бактеріовиділенням, різко збільшилося (до 50%) число хворих з первинною лікарською стійкістю до МБТ. Стійкість до двох препаратів – ізоніазиду і рифампіцину – відзначена у 12% випадків, до трьох – більш ніж у 67,8% випадків.

Окрім резистентності мікобактерій туберкульозу до ПТП, мала ефективність хіміотерапії пов’язана із застосуванням нераціональних лікарських форм антибактеріальних засобів, які не можуть створити їх високу терапевтичну концентрацію на тривалий час в організмі хворого.

Важливим фактором, що впливає на ефективність терапії при туберкульозі, є наявність у хворих тих чи інших дефектів імунної системи. Для раціонального застосування ПТП необхідно враховувати їх дію на неспецифічну резистентність організму та імунітет. У зв’язку із цим великого значення набуває оцінка імуномодулюючого ефекту препаратів, які застосовуються для хіміотерапії туберкульозу при призначенні їх хворим з різними імунодефіцитними станами. Проте у літературі практично немає даних про взаємовплив ПТП і показників імунітету.

Туберкульоз є переважною причиною смертності від інфекційних агентів. Щорічно реєструється з 2 млн. смертельних випадків і 8 млн. нових випадків захворювань. 2 млрд. людей, тобто третя частина населення земної кулі, інфіковані мікобактеріями туберкульозу (МБТ). Число нових випадків впродовж десятиліття від 1990 до 2000 рр. оцінюється в 90 мільйонів. Наведені дані свідчать про те, що туберкульоз набув характеру пандемії.

У сучасних умовах стає усе більш очевидним, що якість життя хворих із туберкульозом є визначеним критерієм сукупної оцінки їх стану та ефективності проведеної терапії.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом планової науково-дослідної тематики Науково-дослідного інституту легеневих захворювань (м. Баку), який розташований на базі Азербайджанського медичного університету МЗ Азербайджанської Республіки (м. Баку, Азербайджан).”Отримання і вивчення нових препаратів із різноманітних химічних груп синтетичного і природного походжння. (No. Державної реєстрації 0106АЗ00790) Здобувач був виконавцем відповідного фрагменту комплексних науково-дослідних тем.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи – порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) на стан імунологічної реактивності in vitro та in vivo з подальшим встановленням їх імунотропних властивостей для оптимізації лікування туберкульозу.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання :

Вивчити імунологічні особливості впливу протитуберкульозних засобів при експериментальному туберкульозі легенів у морських свинок і щурів.

Визначити характер і ступінь впливу рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники клітинної і гуморальної ланок імунітету у тварин і людей.

Проаналізувати ефективність протитуберкульозних засобів за впливом їх на кінетичне вираження Т-клітин імунітету у хворих з інфільтративною формою туберкульозу легенів і результатами експерименту у тварин для з'ясування найбільш оптимального протитуберкульозного препарату з імуномодулюючим ефектом.

Вивчити вплив поєднаного застосування рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, ізоніазиду і канаміцину на показники імунітету при експериментальному туберкульозі.

Об’єкт дослідження. Імунотропна активність протитуберкульозних препаратів та їх комбінацій; показники, що характеризують імунну систему.

Предмет дослідження. Протитуберкульозні препарати – рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, ізоніазид, канаміцин, а також їх комбінації.

Методи дослідження. При виконанні дисертаційної роботи були використані імунологічні, клінічні методи дослідження, а також методи математичної статистики.

Наукова новизна. Вперше в експерименті та клініці проведений порівняльний аналіз імунотропних властивостей протитуберкульозних препаратів – рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду з метою оптимізації терапії хворих на туберкульоз, у яких спостерігається імунодефіцит. Проведено фенотипування клітин, що дозволило визначити не тільки кількість окремих субпопуляцій, але й вміст у них активованих клітин. Вивчено експресію активаційних молекул на поверхні Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій. Показано зростання експресії активаційних маркерів на фоні Т-клітинного дефіциту у хворих туберкульозом легенів. Проведений аналіз імунорегуляторних клітин у хворих з інфільтративною формою туберкульозу. Виявлен вплив ПТП на функціональну активність регуляторних клітин. Визначено зміни відносної кількості активованих маркерів(CD – кластер диференцировки) CD25+ і CD69+ до і після лікування протитуберкульозною терапією, яка включає рифампіцин, рифабутин, офлоксацин і канаміцин. Вивчені імуномодулюючі і супресивні властивості ПТП у період культивування in vitro.

Практичне значення роботи. Наукові дані вперше збагачені інформацією щодо порівняльного аналізу впливу ряду препаратів на імунітет хворих туберкульозом. Розроблено передумови для удосконалення схеми терапії туберкульозу легенів ізоніазидом, рифабутином, офлоксацином як препаратами з найменш вираженими імунодепресивними властивостями. Отримано нові дані, які дозволяють розширити уявлення про участь активованих Т-лімфоцитів у розвитку туберкульозного процесу і визначити нові підходи до корекції порушень функціонування імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляцій. Вивчення Т-клітинної імунної відповіді на вплив протитуберкульозної терапії вказує на необхідність інтенсифікації імунокоригуючої тактики у терапії специфічної інфекції. Визначення піку експресії CD25 і CD69 при культивуванні in vitro до і після стимуляції фітогемаглютиніна (ФГА) і лікарським препаратом допомагає в уточненні рівня дефекту в імунній системі при туберкульозі легенів.Результати проведених досліджень впроваждено в науково-педагогічну діяльність кафедр фармакології,клінічної фармакології та фармакотерапії вищіх навгальних закладі ЙЙЙ та ЙV ривня акредитації.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана на базах Науково-дослідного інституту легеневих захворювань, який розташований на базі Азербайджанського медичного університету (м. Баку), і Національного фармацевтичного університету. Разом з науковим керівником були визначені мета і завдання дослідження, розроблений план досліджень. Здобувачем самостійно проведений літературний пошук і науковий аналіз даних щодо теми дисертації, повністю виконані імунологічні тести з морськими свинками і щурами. Спільно з науковим керівником проведений аналіз імунного статусу людей, хворих на інфільтративну форму туберкульозу легенів, а також визначені мета і завдання дослідження, сформульовані висновки і практичні рекомендації. Самостійно проведено статистичне опрацювання результатів досліджень.

Апробація роботи відбулася 28 квітня 2005 р. на міжкафедральній конференції в Азербайджанському медичному університеті (м. Баку), а також на конференції молодих вчених у Національному фармацевтичному університеті (м. Харків, 2007 р.),1 інформаційні лист.

Публікації. Основні положення дисертації опубліковані у 5 статтях провідних фахових видань, 1 тезах та 1 інформаційному листку.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 155 сторінці комп'ютерного тексту і складається з вступу, 5 глав, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури, який включає 187 джерела, з яких 153 – іноземних авторів. Робота ілюстрована 39 таблицями і 45 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. У результаті аналізу літературних джерел щодо протитуберкульозних препаратів для подальших досліджень були обрані рифампіцин, рифабутин, офлоксацин, канаміцин та ізоніазид, а також дві комбінації: ізоніазид + офлоксацин + рифабутин та ізоніазид + канаміцин + рифампіцин.

Враховуючи те, що рівень імунореактивності організму має важливе значення при призначенні хіміотерапії при туберкульозі, нами були досліджені показники імунітету тварин і людей, хворих на туберкульоз легенів.

Експерименти з доклінічного вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет тварин проводили на щурах і морських свинках. У досліді використані 320 статевозрілих морських свинок обох статей масою 280-305 г і 360 щурів інбредної лінії (WAG Wistar albina glaxo) масою 180-200 г. Під час експерименту тварини знаходилися у стандартних умовах у віварію згідно прийнятих санітарно-гігієнічних умов. Робота з тваринами проводилася відповідно до принципів Європейської конвенції із захисту лабораторних тварин з дотриманням норм GLP.

В експерименті тварин поділяли на 6 груп. У кожній групі було по 60 щурів або 30 морських свинок. Проводили дослідження крові, селезінки та легенів дослідних тварин.

Оцінку стану імунної системи тварин і пацієнтів проводили за допомогою визначення фагоцитарної активності лейкоцитів, уніфікованих методом інкубації культури клітин з частками латексу, а також за тестом з нітросинім тетразолієвим, методиками визначення Е-, ЕАС-, авторозіткоутворюючих клітин при змішуванні крові морських свинок і щурів між собою, визначенням гемолітичної активності сироватки шляхом розведень.

Підрахунок клітин здійснювали загальноприйнятим методом з використанням гемоцитометру (камери Горяєва). Для підрахунку ядровміщуючих клітин застосовували 2% розчин оцтової кислоти.

Вивчення морфології клітин, мієлограм і лейкограм крові проводили у мазках, виготовлених із суспензій клітин і забарвлених азур-ІІ-еозином за Романовським – Гімзе. У кожному мазку вивчали 300 клітин.

У крові тварин і хворих на туберкульоз людей визначали також рівень гемоглобіну, швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) і лейкоцитарну формулу. Їх вивчали за загальноприйнятими методиками клінічного аналізу крові.

Для оцінки утворення активних форм кисню фагоцитами як показника імунореактивності організму використовували метод спонтанної та індукований зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ).

Для більш глибокого дослідження також проведено визначення гемолітичної активності сироватки крові здійснювали за методикою, розробленою Антипенскою Л.В.

Здатність лімфоцитів селезінки щурів формувати Е-розітки з еритроцитами морської свинки і, відповідно, лімфоцитів морської свинки з еритроцитами щурів визначали за методом JondalM.

Відносну кількість В-лімфоцитів визначали у реакції ЕАС-розіткоутворення.

Циркулюючі імунні комплекси визначали за методом Караулова А.В. за допомогою реакції преципітації з подальшим визначенням оптичної щільності на фотоколоримітрі.

У клінічній частині експерименту було обстежено понад 60 хворих на інфільтративний туберкульоз легенів у віці від 18 до 59 років, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у клініці НДІ легеневих захворювань за період з 2002 до 2005 рр. Серед обстежених переважали чоловіки – 45 (75%), жінок було 15 (25%). Контрольну групу склали 20 практично здорових осіб, аналогічних за статтю і віком до дослідних груп.

У роботі використані результати обстеження традиційними клініко-рентгенологічними і лабораторними методами, а також проведене вивчення імунного статусу. При дослідженні клітинного, гуморального імунітету, а також параметрів неспецифічного захисту застосовувалися імунологічні методи, що використовували у доклінічних дослідженнях, а також додаткові. Так, субпопуляційний склад лімфоцитів периферичної крові (CD3⁺ , CD4⁺ , CD8⁺ , CD16⁺ , CD19⁺ , CD21⁺ , CD25⁺ , CD69⁺ ) визначали методом проточної цитофлюориметрії. Експресію поверхневих маркерів Т-лімфоцитів визначали за стандартною методикою імунофенотипування з використанням венозної периферичної крові, взятої з ліктьової вени та змішаної з гепарином (25 ОД/мл).

Мононуклеарні клітини виділяли методом центрифугування у градієнті фікол-верографін із щільністю 1,077 г/см³ за A.Boyum. Концентрацію і підрахунок мононуклеарних клітин визначали у камері Горяєва.

Активаційну і проліферативну здатність лімфоцитів оцінювали за адаптованою методикою Павлюк А.С.

Кількісне визначення імуноглобулінів сироватки крові проводили методом радіальної імунодифузії за Манчіні.

Фагоцитарну активність нейтрофілів визначали за нітросинім тетразолім (НСТ) тестом.

За методикою М.Л.Біленького проводили дослідження люмінолзалежної хемілюмінісценції (ЛЗХЛ) фагоцитуючих клітин.

Статистичну обробку отриманих у дослідженнях результатів здійснювали за допомогою параметричних методів аналізу за допомогою коефіцієнта Стьюдента, а також непараметричними методами аналізу з використанням програми Statistica (StatSoft, USA).

Результати досліджень та їх обговорення. Першим етапом наших досліджень було вивчення впливу монотерапії протитуберкульозними препаратами на імунітет експериментальних тварин – щурів і морських свинок.

Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на показники периферичної крові щурів і морських свинок показало, що у всіх експериментальних групах спостерігалися зміни гематологічних показників (табл. 1, 2).

Таблиця1

Показники периферичної крові при експериментальному туберкульозі у щурів (M± m)

Примітка. * – Достовірність розходжень с контрольною групою.

Таблиця2

Показники периферичної кровіу експериментальних морських свинок(M± m)

Примітка. * – Достовірність розходжень с контрольною групою.

Рівень гемоглобіну в обох видів тварин після їх зараження туберкульозною паличкою підвищувався. Призначення канаміцину морським свинкам і щурам призводило до зниження гемоглобіну до рівня, що був нижче, а ніж у здорових тварин. Застосування рифампіцину призводило до зниження рівня гемоглобіну в щурів нижче норми, а у морських свинок показник повертався практично до контрольних значень. Терапія офлоксацином і рифабутином сприяла поверненню гемоглобіну до вихідного рівня(в обох видів тварин). Тобто призначення канаміцину і рифампіцину морським свинкам і щурам несприятливо впливало на кровотворення.

Показник ШОЕ у заражених щурів збільшувався в 2 рази, а в морських свинок – у 1,7 рази. Призначення офлоксацину повертало цей показник в обох видів тварин до рівня здорових. Те ж саме спостерігали після застосування рифабутину в щурів, а у морських свинок ШОЕ була на 33,3% вищою.

Після застосування канаміцину і рифампіцину ШОЕ, у порівнянні з групою контролю, збільшувалася у 1,5 рази у щурів. У морських свинок призначення канаміцину і рифампіцину мало впливало на показники ШОЕ у порівнянні з нелікованими тваринами.

Вивчення впливу лікування антибіотиками на загальну кількість лейкоцитів у щурів і морських свинок мало тенденції, аналогічні іншим показникам периферичної крові. Після зараження показник збільшувався – відповідно, на 24,2% і 27,3% для щурів і морських свинок.

Після лікування антибіотиками рівень лейкоцитів знижувався, що свідчить про пригнічення запального процесу. Призначення офлоксацину і рифабутину сприяло приведенню кількості лейкоцитів практично до рівня здорових тварин (відповідно, 104,5% і 103,0% до контролю). Кількість лейкоцитів у групах, пролікованих канаміцином і рифампіцином, виявилася нижчою за контроль, відповідно, на 13,6% і 10,6%.

У лейкоцитарній формулі після зараження тварин спостерігали збільшення кількості еозинофілів, моноцитів і лімфоцитів, а рівень палочкоядерних і сегментоядерних нейтрофілів знижувався або залишався на рівні заражених тварин.

Таким чином, призначення для лікування рифабутину та офлоксацину сприяло поверненню більшості показників периферичної крові до нормального рівня, у той час як канаміцин і рифампіцин сприяли пригніченню клітинного імунітету.

Вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на фагоцитарну активність нейтрофілів показало, що мінімальні зміни показників фагоцитозу в щурів відбулися в експериментах із застосуванням офлоксацину (табл. 2). Розходження з контрольною групою склали, відповідно, для фагоцитарного індексу 9,5% і 9,1% (через 30 і 60 хвилин), а фагоцитарного числа – 14,3% і 11,1%. Дещо більше відрізнялися результати, отримані при застосуванні рифабутину. Фагоцитарна активність нейтрофілів у щурів, яким були призначені канаміцин і рифампіцин, була приблизно схожою: фагоцитарний індекс знижувався при застосуванні канаміцину в 1,6 разів, а при застосуванні рифампіцину – у 1,5 рази. При цьому впродовж години цей показник не змінювався. Фагоцитарне число при цьому через 30 хвилин зменшилося у 1,4 рази, а через 1 годину в групі тварин, де застосовувався канаміцин, воно знижувалося у 1,5 рази, а у групі, лікованій рифампіцином, – у 1,3 рази.

Таким чином, найкраще фагоцитарна активність зберігалася у групах щурів, що приймали офлоксацин, і дещо гірше у тих тварин, яким як лікування був призначений рифабутин.

Вивчення фагоцитарної активності нейтрофілів показало, що після зараження морських свинок фагоцитарний індекс і фагоцитарне число знижувалися. Лікування антибіотиками сприяло збільшенню зазначених параметрів. Мінімальний пригнічюючий вплив на імунітет морських свинок справляли рифабутин і офлоксацин.

НСТ-тест, що відбиває ступінь активації кисеньзалежних механізмів бактерицидної активності фагоцитуючих клітин, також проводили на щурах і морських свинках. У групі заражених і не лікованих тварин оптична щільність знижувалася у порівнянні з інтактною групою. Аналогічні дані були отримані для груп морських свинок і щурів, яким вводили рифампіцин, що свідчить про пригнічюючий вплив його на імунітет. У той же час результати практично на рівні контролю були отримані у тварин, яких лікували офлоксацином і рифабутином. Проте в експериментах на морських свинках мінімальний вплив на імунітет справляв офлоксацин і дещо більше рифабутин, що свідчить про імунотропну дію цих


8-09-2015, 22:49