Киїський національний університет імені Тараса Шевченка
Беспалова Олена Ярославівна
УДК 616.126-022:612.017:57.089.2
Вплив загальної керованої гіпертермії на стан імунної
системи у хворих на інфекційний ендокардит
03.00.09 – імунологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Національному інституті серцево-судинної хірургії
ім. М.М. Амосова АМН України.
Науковий керівник:
лауреат державної премії України,доктор медичних наук
Воробйова Ганна Михайлівна, Національний інститут
серцево-судинної хірургії ім. М.М. Амосова АМН України,
завідувач відділу клінічної імунології.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук Гавриленко Тетяна Іллівна, Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска АМН України, керівник відділу імунології;
член-кореспондент АМН України, доктор медичних наук, професор Чернушенко Катерина Федорівна, Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України, завідувач лабораторії імунології.
Захист відбудеться ” 20 ” травня 2008 р. о 14 °° годині на засіданні
спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 в Київському національному університеті імені Тараса Шевченка, за адресою:
03127, м. Київ, проспект академіка Глушкова, 2, біологічний факультет, ауд. 434
Поштова адреса 01033 м. Київ, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий ” 15 ” квітня 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради к.б.н. Молчанець О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. До теперішнього часу серцево-судинні захворювання і їх комплексне лікування є однією із актуальних проблем клінічної медицини. Особливе місце серед цих захворювань займає інфекційний ендокардит (ІЕ). Питома вага і смертність від цієї недуги продовжують зростати, незважаючи на значне число робіт, присвячених механізмам розвитку цієї патології і наявності засобів лікування (Тюрин В.П., 2002; Кнышов Г.В. и др., 2004; Tornos P., Iung B. et al., 2005).
Інфекційний ендокардит – це септичне захворювання, яке викликане патогенною або умовно – патогенною мікрофлорою і супроводжується деструктивними змінами ендокарду. Одним з механізмів патогенезу ІЕ є запальний процес, в основі якого лежить взаємодія різних імунокомпетентних клітин і синтезованих ними біологічно активних речовин. Локалізація інфекції в ендокарді клапанів серця призводить до формування набутих вад серця, а також до розвитку імунологічних змін, внаслідок наявності активного осередку інфекції (Демин А.А. и др., 1988; Татарченко И.П. и др., 2001; Mayer D.V. et al., 1997). Дослідження показують, що імунологічні зміни проявляються порушенням клітинної, гуморальної ланки імунної системи організму (Шевченко Ю.Л. и др., 1996; Воробьева А.М., 2003; Auckenhalter R.W.,1998; Brown M.E. et al., 2001).
В більшості випадків консервативне медикаментозне лікування інфекційного ендокардиту малоефективне, єдиним методом лікування є хірургічний в умовах штучного кровообігу. Ризик виникнення гнійно – септичних ускладнень, рецидивів інфекційного процесу в післяопераційному періоді зростає при хірургічних втручаннях в умовах штучного кровообігу, ніж при операціях на «закритому серці» і знаходиться в межах 6 % -24 % (Руденко А.В., 2001; Бокерия Л.А. и др., 2003). На протязі штучного кровообігу кров знаходиться в нефізіологічних умовах, таких як контакт з чужорідною поверхнею, механічна травма, дія лікарських препаратів. Пошкоджуюча дія того, або іншого чинника може призводити до порушення метаболізму і загибелі імунокомпетентних клітин, блокади їх рецепторів, дисбалансу субпопуляцій лімфоцитів і цитокінів, а також до інших змін, що викликають дисфункцію імунної системи (Пинегин Б.В. и др., 1999; Киладзе Е.С., 2001; Миролюбова О.А. и др., 2001; Butler J.M. et al.,1999). Все це зумовлює актуальність пошуку, поєднання лікувальних заходів, спрямованих на всі патогенетичні ланки розвитку інфекційно – септичного процесу у кардіохірургічних хворих на ІЕ.
Увагу вчених привертають різноманітні методи імунокорекції, одним з яких є гіпертермія. Дослідженнями вітчизняних та зарубіжних вчених було виявлено імуномодулюючі властивості гіпертермії, як в експериментальних так і в клінічних умовах при онкологічних захворюваннях, псоріазі (Пономарев А.Д. и др., 2005; Шевченко А.І. та ін., 2006; Nakayama J. еt al.,1998; Ostberg J.R. et al., 2000; Morita M.et al., 2001). Проте питання про вплив штучно створеної загальної керованої гіпертермії (ЗКГ) на імунологічну реактивність організму в комплексному лікуванні інфекційного ендокардиту залишається не вивченим, подібних досліджень не проводили.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом наукових досліджень Національного інституту серцево-судинної хірургії ім. М.М.Амосова АМН України у рамках: НДР № держреєстрації 0103U000629 «Розробити і впровадити метод термоімунокоригуючої терапії хворих на інфекційний ендокардит», НДР № держреєстрації 0101U002049 «Екстракорпоральні технології в хірургії та інтенсивній терапії».
Мета і задачі дослідження. Вивчити особливості стану імунної системи у хворих на інфекційний ендокардит в залежності від використання загальної керованої гіпертермії при хірургічному лікуванні.
Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:
вивчити клітинні та гуморальні фактори імунітету у хворих на інфекційний ендокардит до операції;
дослідити стан клітинної ланки імунної системи (Т-лімфоцити та їх субпопуляції, NK-клітини, фагоцитуючі клітини) після операції без використання гіпертермії та із застосуванням загальної керованої гіпертермії з різними температурними режимами у хворих на інфекційний ендокардит;
вивчити стан гуморальної ланки імунної системи (В-лімфоцити, імуноглобуліни класу M, G, A та циркулюючі імунні комплекси) у хворих на інфекційний ендокардит, оперованих у звичайному режимі та з використанням загальної керованої гіпертермії при різних температурних режимах;
визначити рівень С3 компоненту комплемента та прозапальних цитокінів (фактора некрозу пухлин-α, інтерлейкіна-6) в сироватці крові хворих на інфекційний ендокардит після операції без застосування гіпертермії та з використанням загальної керованої гіпертермії;
дослідити імунний статус у хворих на інфекційний ендокардит залежно від тривалості лихоманки в доопераційному періоді до та після операції з гіпертермією при температурі 39,0 – 39,5 °C.
Об’єкт дослідження. Периферична кров: клітинні фактори імунітету – кількісний та субпопуляційний стан лімфоцитів (Т-лімфоцити, Т-хелпери, Т-супресори, NK- клітини, В-лімфоцити), функціональна активність фагоцитів (моноцити, нейтрофільні гранулоцити), гуморальні фактори системи імунітету – імуноглобуліни (IgM, IgG, IgA), циркулюючі імунні комплекси (ЦІК), С3 компонент комплемента, прозапальні цитокіни – інтерлейкін-6, фактор некрозу пухлин-α.
Предмет дослідження. Імунокомпетентні клітини, рівень С3 компоненту комплемента та прозапальних цитокінів в динаміці впливу різних температурних режимів загальної керованої гіпертермії у кардіохірургічних хворих на ІЕ.
Методи дослідження. Імунологічні – визначення вмісту Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій (CD3+, CD4+, CD8+ клітин), В-лімфоцитів (CD22+), NK-клітин (CD16+) методом непрямої імунофлюоресценції за допомогою моноклональних антитіл. Методом радиальної імунодифузії в гелі по J. Mancini визначали вміст імуноглобулінів M, G, A. Спектрофотометричний метод використовували для визначення вмісту циркулюючих імунних комплексів, С3 компоненту комплемента та катепсину-D. Рівень прозапальних цитокінів – інтерлейкіну-6, фактора некрозу пухлин-α визначали методом імуноферментного аналізу. Достовірність отриманих результатів досліджувалась статистичними методами за допомогою пакету прикладних програм Microsoft Excel.
Наукова новизна отриманих результатів. На підставі комплексного дослідження хворих на ІЕ вперше отримані дані впливу різних температурних режимів загальної керованої гіпертермії на стан клітинної і гуморальної ланки імунної системи.
Показано, що зміни стану імунної системи у хворих на ІЕ, оперованих без гіпертермії аналогічні, як у хворих на ІЕ, оперованих з використанням загальної керованої гіпертермії (ЗКГ) з температурою 38,0 – 38,5°C протягом 30 хвилин. В обох групах на 14-у добу після операції зберігається дисфункція клітинної і гуморальної ланки імунної системи, що проявляється достовірним зменшенням кількості Т-лімфоцитів та їх фукціональної активності, дисбалансом імунорегуляторних клітин, підвищенням рівня IgМ, ЦІК та С3 компоненту комплемента.
Вперше виявлено, що застосування загальної керованої гіпертермії з температурою 39,0 – 39,5 °С протягом 30 хвилин під час операції у хворих на ІЕ сприяє нормалізації клітинної ланки імунної системи на 14-у добу після операції: збільшується кількість Т-лімфоцитів, підвищується їх функціональна активність, зменшується дисбаланс імунорегуляторних клітин та кількість NK-клітин, до показників контрольної групи практично здорових осіб. Нормалізується поглинальна здатність, внутрішньоклітинний кисневозалежний метаболізм і резервні можливості фагоцитуючих клітин. Знижується рівень IgG, IgМ, IgА, ЦІК, С3 компоненту комплемента, фактора некрозу пухлин-α, та інтерлейкіна-6 до показників контрольної групи практично здорових осіб – що є об’єктивним критерієм зниження інтенсивності деструктивно-запального процесу.
Практичне значення одержаних результатів. Показано, що застосування ЗКГ при температурі 39,0 – 39,5 °C протягом 30 хвилин серед інших температурних режимів в комплексному лікування хворих на ІЕ проявляє імуномодулюючу дію, сприяє нормалізації стану клітинної та гуморальної ланки імунної системи, таким чином зменшує ризик розвитку інфекційних ускладнень у хворих на ІЕ після протезування клапанів серця.
Впровадження в практику. За результатами проведених досліджень отримано
2 патенти на винахід МПК – 7А 61 В 5/145 G 01 N 33/49, № 55145А; МПК – 7 G 01 N 33/49, 33/53, № 73693. Результати досліджень упроваджені в практику роботи відділення інфекційного ендокардиту Національного інституту серцево – судинної хірургії ім. М.М. Амосова АМН України.
Особистий внесок здобувача. Пошукачем самостійно проведено літературний та патентно-інформаційний пошук. Проведено комплексні імунологічні дослідження у хворих на ІЕ, до та після оперативного лікування із застосуванням загальної керованої гіпертермії. Проведено математичний і статистичний аналіз отриманих результатів. Аналіз і інтерпретація матеріалу належать автору.
Апробація результатів дисертації. Основні положення досліджень викладені на науково-практичній конференції «Перспективи гнійної хірургії у XXI ст.» (Судак 2003), біохімічному конгресі (Lublin 2002), «10 Всеросийском сьезде сердечно-сосудистых хирургов» (Москва 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю: «Сепсис: патогенез, діагностика та терапія (Харків 2004), «Девятой ежегодной сесии научного центра сердечно-сосудистых хирургов им. А.Н. Бакулева РАМН и Всеросийской конференции молодых ученых (Москва 2005), на XXI з’їзді хірургів України (Запоріжжя 2005), на 14-й конференції Асоціації серцево-судинних хірургів України «Актуальные проблемы кардиохирургии» (Донецьк 2006).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 31 роботу, з яких 15 статей
у виданнях рекомендованих ВАК України, 2 патенти на винахід, 13 тез конференцій,
1 методичні рекомендації.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 166 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 17 таблицями, 9 рисунками. Робота має традиційну структуру і складається з вступу, літературного огляду, описання матеріалів і методів дослідження, трьох розділів самостійних досліджень, підсумку, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, що містить вітчизняні (113) та іншомовні джерела (90) і додатку.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Огляд літератури. У літературному огляді проведено ретельний аналіз сучасного погляду на стан імунної системи при інфекційному ендокардиті. Узагальнено основні відомості щодо можливості використання гіпертермії та вплив її на імунобіологічну реактивність організму.
Матеріали і методи дослідження. Проведено обстеження 208 хворих на інфекційний ендокардит, середній вік 39,2 + 8,9 р. Серед обстежених пацієнтів 147 (70,7 % ) складали чоловіки і 61 (29,3 % ) – жінки. У досліджуваній групі пацієнтів переважали хворі з вадою аортального клапана – 171 (82,2 % ) хворих. Частка хворих, що мали ваду клапанів мітрального і мітрально-аортального склала 26 (12,5 % ) і 11 (5,3 % ) хворих відповідно. По важкості захворювання хворі ІЕ в основному відносилися до 3-4 функціонального класу NYHA-182 (87,5 % ) хворих, решту 26 (12,5 % ) до другого. У всіх хворих (100 % ) інфекційний ендокардит був визначений як первинний активний з наявністю періоду лихоманки.
Встановлення діагнозу ІЕ ґрунтувалося на поєднанні клінічних критеріїв, що включають позитивні бактеріологічні дослідження крові, клінічні ознаки, результати досліджень ехокардіографії. Діагноз ІЕ встановлювався відповідно до діагностичних критеріїв Duke University (Durack D. T. et al., 1994). Первинний ІЕ був визначений, як випадок виникнення інфекційного ендокардиту на анатомічно нормальних і не вражених іншими захворюваннями клапанах серця. Активність ІЕ визначалася комплексно відповідно до декількох критеріїв: клінічні (лихоманка, прогресування серцевої недостатності), лабораторні (високі показники ШОЕ (20,0 мм/год і вище), лейкоцитоз). ІЕ був визначений як активний, якщо хворі потребували хірургічного лікування до закінчення стандартного курсу антибактеріальної терапії.
Базисне лікування хворих на ІЕ включало хірургічне видалення осередку інфекції, корекції пошкоджених клапанів серця а також антибіотикотерапію. Всіх 208 (100 %
) хворих ІЕ оперували по розробленій стандартній методиці в умовах штучного кровообігу (ШК). Основний етап операції проходив в умовах помірної системної гіпотермії (температура 28°С). Після виконання хірургічної корекції клапанної патології і зняття затиску з аорти хворих зігрівали до нормальної температури тіла, t° стравоходу = 37,0 °С (нормотермічний етап) з подальшим зігріванням диференційовано до
t° стравоходу = 38,0 – 39,5 °С (гіпертермічний етап). Температуру моніторували стравохідним, ректальним, артеріальними і венозними датчиками. Зігрівання проводили через теплообмінник фізіологічного блоку апарату штучного кровообігу (температура циркулюючої води 42 °С) і за допомогою водяного матраца.
Хворі ІЕ, залежно від температурного режиму загальної керованої гіпертермії (ЗКГ), яку застосовували після основного етапу кардіохірургічної операції, були розділені на групи. І-у групу – склали 60 хворих ІЕ, яких оперували в звичайному режимі без застосування ЗКГ. До ІІ-ї групи ввійшли 30 хворих на ІЕ, оперованих із застосуванням ЗКГ в температурному режимі 38,0 – 38,5 °С протягом 30 хвилин. ІІІ-ю основну групу дослідження склали 100 хворих на ІЕ, оперованих із застосуванням ЗКГ в температурному режимі 39,0 – 39,5 °С протягом 30 хвилин. Хворі ІЕ III-ї групи (n=100) в залежності від тривалості лихоманки в доопераційному періоді були розділені на групи: 1-а група – пацієнти з періодичним субфебрилітетом до 1-го місяця (n = 22); 2-а група – лихоманка (38 – 39,5 C°) до 1-го місяця (n = 23); 3-я група – лихоманка (38,0 – 39,5 C°) від 1-го до 3-х місяців (n = 22); 4-а група – лихоманка (38,0 – 39,5 C°) від 3-х до 6-ти місяців (n = 18); 5-а група – лихоманка (38,0 – 39,5 C°) від 6-ти до 12-ти місяців (n = 15). До групи III-А ввійшло 15 пацієнтів, яким застосовували ЗКГ з температурою 39,0 – 39,5 °С протягом 10 хвилин. III -Б групу склали 3 хворі із використанням ЗКГ з температурою 39,5 – 40,0 °С протягом 30 хвилин.
Контрольну групу – склали 30 практично здорових осіб – донорів крові.
Дослідження імунологічних показників проводили до операції та на 14-у добу після операції. Імунологічне обстеження включало визначення абсолютного вмісту лейкоцитів та лімфоцитів в периферичній крові по загально прийнятій методиці (Передерій В.Г. та спіавт., (1995 р.)). Визначення числа лімфоцитів за допомогою поверхневих антигенних мембранних маркерів CD3, CD4, CD8, CD16, CD22 методом непрямої імунофлюоресценції з використанням моноклональних антитіл виробництва НПЦ «МЕДБИОСПЕКТР» (Москва). Проліферативну здатність Т-лімфоцитів оцінювали за допомогою реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) з мітогеном ФГА. Вміст IgА, IgM, IgG визначали методом радиальної імунодиффузії в гелі по J. Manchini (1965), використовуючи моноспецифічні сироватки проти імуноглобулінів G, А, M людини і стандартні сироватки до них виробництва філіалу ФГУП «НПО «Микроген» МЗРФ» м. Москва. Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці крові оцінювали методом преципітації антиген антитіло в 3,75 % розчині «Поліетилен-гліколю-6000» спектрофотометричним визначенням щільності преципітату за методом Константинова К.С. та співавт. (1992).
Функціональний стан нейтрофільних гранулоцитів (НГ) та моноцитів (Мц) крові характеризували за їх здатністю поглинати частки латексу з розрахунком проценту фагоцитозу (ПФ) – відсотком фагоцитуючих клітин та фагоцитарного числа (ФЧ) – середньою їх активністю (Потапова О.Г., Хрустіков В.С., (1974)) та інтенсивністю їх внутрішньоклітинного кисневозалежного метаболізму в НСТ – тесті (Г. Фримель 1987; Є.У. Пастер та співавт. 1989).
Рівень прозапальних цитокінів – інтерлейкіну (ІЛ-6), фактора некрозу пухлин – α (ФНП-α) визначали методом імуноферментного аналізу з використанням тест–системи «Іmmunotech а Becham Coulter Company» (Франція). Облік проводили на імуноферментному аналізаторі Labsystens IEMS Reader MF (Фінляндія).
Спектрофотометричним методом проводили визначення С3 компоненту комплемента з використанням реагентів фірми Sentinel CH, Milano-Italy та активність катепсина D за методом Веремеєнко К.Н. і співавт.(1988).
Статистична обробка матеріалу проводилася на персональному комп’ютері ІВМ Atlon з використанням універсальних статистичних програм Microsoft Excel з урахуванням t-критерію вірогідності Ст’юдента. Зміни вважали вірогідними при р < 0,05.
Результати досліджень та їх аналіз.
Вплив різних температурних режимів загальної керованої гіпертермії на стан імунної системи у хворих на інфекційний ендокардит. У ході проведених досліджень нами встановлено (табл. 1), що на момент первинного імунологічного обстеження (до операції) у всіх пацієнтів ІЕ мали місце чітко виражені порушення імунного стану, однотипні в досліджуємих групах. Виявлені зміни імунологічних показників характеризувалися статистично достовірним зниженням вмісту Т-лімфоцитів (CD3+), переважно за рахунок їх супресорної популяції (CD8+). Спостерігалося також порушення субпопуляційного складу імунорегуляторних клітин, що проявлялося тенденцією збільшення кількості (CD4+ ) лімфоцитів (у III-й групі достовірно, (р < 0,05)). Зменшення супресорної популяції клітин: у хворих ІЕ I-ї групи до 12,0 ± 0,8 % , II-ї групи до 11,8 ± 0,9 % , III–ї – 12,3 ± 0,9 % , тоді як у здорових цей показник сягав 16,3 ± 1,1 % , (р < 0,05), що призводило до підвищення імунорегуляторного індексу (ІРІ). Так в доопераційному періоді у хворих I-III-ї групи майже на 24 % збільшений ІРІ ніж у здорових осіб (р<0,05), за рахунок зниження кількості Т-супресорів, та тенденції підвищення Т-хелперів, характеризуючи дисфукцію клітинної ланки імунної системи при запальному процесі. Одночасно мало місце у хворих ІЕ всіх груп достовірне збільшення кількості NK-клітин.
Зміна кількісних показників клітинної ланки імунної системи узгоджувалась із зміною функціональної активності лімфоцитів в реакції бласттрансформації лімфоцитів. Простежувалося достовірне зниження проліферативної активності лімфоцитів на неспецифічний мітоген (ФГА) у хворих на ІЕ I-III-ї групи, в порівнянні з контрольною групою (р <
8-09-2015, 23:24