Порівняльний фармакологічний аналіз імунотропних властивостей ряду антибактеріальних препаратів, які застосовуються при туберкульозі легенів

Оцінка утворення активних форм кисню фагоцитами методом спонтанної та індукованої зимозаном люмінолзалежної хемілюмінесценції (ЛЗХЛ) показала, що після зараження тварин показник спонтанної ЛЗХЛ падав на 35% і 33,3%, відповідно, у щурів і морських свинок, а ЛЗХЛ, індукована зимозаном, зменшувалася на 11,8% і 8,0% відповідно. Після введення дослідних протитуберкульозних засобів обидва показники ЛЗХЛ збільшувалися в обох видів тварин. В експериментальних групах тварин, яким вводили рифабутин і офлоксацин, досліджуваний показник практично не відрізнявся від аналогічного в групі інтактних тварин або наближався до них.

Дослідження рівню циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові щурів показало, що у всіх експериментальних групах, крім щурів, яким вводили канаміцин, спостерігали підвищення цього показника. У групі тварин “після зараження” цей показник підвищувався найбільше у порівнянні з іншими групами – на 33,3%. Дещо менше рівень ЦІК підвищувався після введення офлоксацину і рифампіцину. Результат, близький до інтактних щурів, отриманий у групі, яку лікували рифабутином. А ось після введення рифампіцину досліджуваний параметр знижувався, на відміну від усіх інших препаратів на 16,7%. Таким чином, в експерименті з вивченням ЦІК результати на рівні контролю спостерігали після введення рифабутину, що свідчить про його позитивний вплив на імунні процеси в організмі тварин.

У серії аналогічних експериментів, проведених на морських свинках, дані трохи відрізнялися від таких у щурів. Після зараження рівень ЦІК збільшувався в 5,25 рази. Після лікування він знижувався тільки у групі морських свинок, які приймали офлоксацин. Лікування іншими препаратами не справляло істотного впливу на ЦІК. Тобто імунотропна активність була виявлена в офлоксацину.

Рівень гетерофільних гемолізинів, який дає можливість судити про наявність інфекційного процесу, також вивчали на морських свинках і щурах. Встановлено, що після зараження тварин рівень гетерофільних гемолізинів підвищувався на 45,5% у щурів і на 51,8% у морських свинок. Після введення антибіотиків показник в основному знижувався. При цьому в групах тварин, які одержували рифабутин і офлоксацин, параметр прагнув до контрольного рівня, а у тих, хто одержував канаміцин і рифампіцин, – до рівня після зараження. Це свідчить про мінімальний пригнічюючий вплив на імунітет.

Встановлено також, що у групах тварин, що піддалися зараженню мікобактеріями туберкульозу і не одержували лікування, рівень Т-лімфоцитів знижувався на 36,7% і 33,4%, відповідно для щурів і морських свинок. Антибактеріальна терапія сприяла збільшенню цього показника. Найкращі результати щодо збереження імунної активності організму були отримані у тварин, лікованих рифабутином, і трохи гірше – при введенні офлоксацину.

Визначення рівня В-лімфоцитів показало, що у всіх дослідних групах тварин, у порівнянні з контрольною, рівень В-лімфоцитів знижувався. Найбільш значуще зменшення рівня розеткоутворюючих клітин (РУК) у ЕАС-реакції у щурів було після введення рифампіцину –19,0%. Після лікування рифабутином і канаміцином результати мало відрізнялися від контрольних. Отже, у даному експерименті мінімальний вплив на рівень В-лімфоцитів у щурів мали канаміцин і рифабутин. Дослідження, проведені в експериментах на морських свинках, підтвердили дані, отримані у дослідах на щурах.

Визначення рівня лімфоцитів за реакцією авторозеткоутворення (ауто-РУК) показало, що у щурів рівень Ауто-РУК був однаковим у чотирьох групах тварин (заражених і нелікованих; а також після введення офлоксацину, канаміцину, рифампіцину). У порівнянні з інтактною групою він був менше на 22,2%. Відмінність склав рифабутин: його рівень Ауто-РУК склав 8%, тобто на 11,1% менше, а ніж у контролі. Тобто мінімальний вплив на клітинний імунітет у щурів спостерігався під впливом рифабутину. В другій серії дослідів, проведених на морських свинках, ми одержали результати, аналогічні попереднім.

На наступному етапі досліджень був вивчений вплив комбінацій протитуберкульозних препаратів на імунітет морських свинок.

Вивчення показників периферичної крові у морських свинок після комбінованої протитуберкульозної терапії показало, що після застосування комбінації ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином показники периферичної крові були на рівні контрольних або наближалися до них. Комбінація ізоніазиду з канаміцином і рифампіцином пригнічувала кровотворення.

Вивчення показників фагоцитарної активності нейтрофілів у хворих тваринпісля комбінованої антибіотикотерапії показало, що показники фагоцитарної активності нейтрофілів були найбільш наближеними до контрольної групи після застосування комбінації ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.

При вивченні фагоцитуючої активності клітин у морських свинок за допомогою НСТ-тесту встановлено, що імунотропна дія була виявлена при використанні комбінації ізоніазиду з рифабутином і офлоксацином.

Дослідження ЛЗХЛ показало, що застосування ізоніазиду разом з офлоксацином і рифабутином сприяло збереженню імунітету у тварин. Встановлено також, що найбільш сприятливий вплив на рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові морських свинок мала комбінація ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.

Визначення рівня гетерофільних гемолізинів свідчить про те, що імунотропну дію має комбінація ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.

При вивченні впливу поєднаного застосування протитуберкульозних засобів на рівень Т-лімфоцитів мінімальний негативний вплив на імунітет справляла та сама комбінація антибіотиків.

Встановлено також, що поєднання ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином в експерименті виявила імунотропну дію при визначенні рівня В-лімфоцитів і в реакції авторозеткоутворення.

Таким чином, в експериментах на тваринах виявлена найбільш сприятлива комбінація препаратів для раціональної антибіотико терапії туберкульозу. Це поєднання ізоніазиду з офлоксацином і рифабутином.

Заключним етапом наших досліджень було вивчення впливу протитуберкульозних препаратів на імунітет людей.

У всіх пацієнтів відзначалися зміни гематологічних показників: лейкоцитоз, палочкоядерний зсув нейтрофілів, лімфопенія (табл. 3). Рівномірне підвищення ШОЕ і збільшення палочкоядерних нейтрофілів у крові. Вивчення показників імунітету в хворих на ТБ легенів виявило істотні зміни у всіх ланках імунного статусу. При усіх формах ТБ легенів поряд з достовірним наростанням лейкоцитозу спостерігалося зниження відносного числа лімфоцитів. Вміст CD3-клітин був знижений на 65,8%. У хворих виражене пригнічення функціональної активності Т-клітин встановлене в 73,1% випадків, зниження показників специфічної клітинної відповіді – у 61,8% пацієнтів. Одночасно відзначене підвищення CD25⁺ - маркерів і особливо показників гуморального імунітету. Число CD19⁺ і CD21⁺ було збільшено у 70,7% хворих. При оцінці фагоцитарної ланки виявлялося зниження середніх величин фагоцитарного індексу, спонтанної й індукованої ЛЗХЛ, індексу стимуляції.

Таблиця 3

Лейкоцитарна формула крові хворих на туберкульоз людей, що брали участь в експерименті

Примітка. ^* – Достовірність у порівнянні з контрольною групою (р < 0,05); ^* - Достовірність у порівнянні з контрольною групою (р < 0,05); ^** – достовірність у порівнянні з рівнем до лікування (р < 0,05).

Таким чином, у хворих усіх груп виявлене глибоке порушення вихідного імунного статусу, що супроводжується чітким зменшенням у крові CD³ +, CD⁴ +, CD⁸ +, збільшенням CD¹⁶ +, CD¹⁹ +, CD²¹ +, CD²⁵ +, зниженням фагоцитарного індексу, спонтанної й індукованої ЛХЗЛ, індексу стимуляції. Одночасно з цим збільшувалася кількість ЦІК.

Для визначення впливу рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину на клітинну системну імунну відповідь досліджували цільну кров 60 хворих на ТБ легенів до початку протитуберкульозної терапії.

У хворих туберкульозом при стимуляції тільки з рифампіцином при зіставленні зі зразками групи порівняння знижувався вміст CD3⁺ , CD16⁺ і CD25⁺ відповідно на 5.4, 4.0 і 6,5%, при цьому рівень CD4⁺ і CD8⁺ -клітин практично не відрізнявся від відповідних показників групи порівняння. У дослідній групі, де використовували рифабутин, відзначається тенденція до підвищення CD4⁺ (2,5%) і CD8⁺ (2,6%), рівномірне зниження CD16⁺ (4,0%) і помітне зниження активованих клітин – 11,3%. У хворих, лікованих офлоксацином, не виявлені розходження із вмістом CD3, CD8 і CD25. Цей препарат також як і рифабутин, сприяв зниженню концентрації CD16⁺ (6,3%) і зростанню CD4⁺ (3,3%). При стимуляції лімфоцитів канаміцином спостерігалося зниження CD3⁺ на 3,6%, CD16⁺ - на 13,1%, CD25 - на 4,0% і CD4⁺ -на 2,1%. Канаміцин впливав тільки на рівні субпопуляцій, і його імунотропна дія носила імунодепресивний характер. У хворих, який був призначений рифабутин, збільшення CD3⁺ носило виражений характер. У хворих з інфільтративною формою ефект офлоксацину помітно відбивався на концентрації CD4. Аналогічно цьому відзначалося підвищення CD8⁺ у пробах у хворих з інфільтративним туберкульозом, які вживали офлоксацин.

На підставі отриманих результатів і наявних літературних даних ми не виключаємо вплив ПТП на апоптоз при ТБ легенів. Можна припустити, що, ефективно впливаючи на МБТ, знищуючи інфіковані макрофаги, рифампіцин і рифабутин могли б сприяти посиленню імунної відповіді. Однак, зрушення в імунній системі, зокрема низькі рівні CD3⁺ , CD4⁺ і CD8⁺ і поєднаний з ними високий вміст CD25⁺ , очевидно, є результатом посиленого апоптозу і мають визначену причетність до порушень імунної відповіді (табл. 4).

Таблиця 4

Вміст рецепторів активаціївобстежених груп

Примітка. * – достоверные отличия у больных с контрольной группой (p<0,05).

У пацієнтів обстежених груп у периферичній крові виявлялися Т-лімфоцити з фенотипом CD3⁺ CD25⁺ , CD4⁺ CD25⁺ , CD8⁺ CD25⁺ , CD3⁺ CD69⁺ , CD4⁺ CD69⁺ і CD8⁺ CD69⁺ . У хворих ТБ легень дані показники в периферичній крові значно зростають у середньому в 2,5 рази. Відповідно змінювалися співвідношення CD4⁺ CD25⁺ /CD8⁺ CD25⁺ і CD4⁺ CD69⁺ /CD8⁺ CD69⁺ . У хворих на ТБ у порівнянні з контролем ці показники вірогідно зростають.

В осіб контрольної групи в культурі лімфоцитів стимульованих ФГА in vitro прогресивно зростало кількість клітин, які несуть одночасно диференційовані CD4⁺ або CD8⁺ і маркер активації CD25⁺ . У популяції CD3⁺ -лімфоцитів виявлялося виражене зростання вмісту активованих клітин. Пік співвідношення CD4⁺ CD25⁺ /CD8⁺ CD25⁺ спостерігався до 4 годин культивування, проте через 24 години зменшувався.

При інфільтративній формі до лікування вміст CD3⁺ , CD4⁺ і CD8⁺ Т-клітин, експресуючих CD25⁺ , був у середньому в 1-1,5 рази вище, а ніж у крові осіб контрольної групи. Концентрація активаційних маркерів CD3⁺ CD69⁺ , CD4⁺ CD69⁺ , CD8⁺ CD69⁺ у хворих ТБ перевищувала контрольні показники в 1,3 рази.

Аналіз отриманих результатів культивування показав зміну вмісту CD8⁺ CD69⁺ -маркерів у залежності від ваги туберкульозного процесу, а також від тривалості культивування.

З метою оцінки дії кожного препарату окремо на активаційні маркери ми провели культивування лімфоцитів із включенням у зразки розчинів ПТП: рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину. Порівняння даних показало, що рифампіцин не впливав на активність CD4⁺ CD25⁺ -маркерів і пригнічував активність CD3⁺ CD25⁺ і CD8⁺ CD25⁺ -клітин в усі години культивування, а також CD3⁺ CD69⁺ -маркерів до 96 години, однак потім препарат підсилював їх активність. Виявлено незначну стимуляцію рифампіцином CD4⁺ CD69⁺ -Т-клітин. Ми спостерігали збільшення кількості CD8⁺ CD69⁺ -маркерів через 24 і 96 годин культивування, але підйом до 120 годин перемінився зниженням даної субпопуляції. У зразках з рифабутином зареєстроване посилення активності CD3⁺ CD25⁺ , CD3⁺ CD69⁺ і CD8⁺ CD25⁺ -клітин. Пік активності CD3⁺ CD25⁺ і CD8⁺ CD25⁺ -маркерів відзначався через 120 годин культивування, і був вищим за аналогічні показники без стимуляції ПТП відповідно на 12,9 і 7,4%. Максимальна активність CD3⁺ CD69⁺ -клітин, зареєстрована до 96 годин, перевищувала порівняльні значення на 3,0%. Менш виражена стимуляція активності імунної відповіді відзначалася серед CD4⁺ CD69⁺ -маркера. Пік активності спостерігався між 8-24 годинами (20,0% і 28,8% проти порівняльних 15,4% і 27,7%). В інші години рівень не відрізнявся від показників у зразках, що не містять препарат. Препарат не впливав на активність CD8⁺ CD69⁺ - і пригнічував функціональну активність CD4⁺ CD25⁺ -клітин. На відміну від рифабутину, офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3⁺ CD25⁺ , CD3⁺ CD69⁺ , CD4⁺ CD25⁺ і CD4⁺ CD69⁺ -клітин, різниця між порівняльними даними склала відповідно 16,1%, 15,1%, 10,6% і 7,6%. При цьому концентрація CD8⁺ -фенотипу, експресуючого CD25⁺ і CD69⁺ -маркери під дією ФГА й офлоксацину, тільки до 24 годин підвищувалася відповідно на 29,6 і 34,0%, а потім поступово знижувалася і після 120 годин культивування була нижче вихідних величин. Вивчення функціональної активності CD3⁺ , CD4⁺ і CD8⁺ -лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери, показало пригнічення їх активності під дією канаміцину. Зростання активності відзначалося тільки до 24 годин культивування CD4⁺ CD25⁺ і CD8⁺ CD25⁺ відповідно на 13,4% і 14,5% при порівнянні зі зразками без препарату. Отже, найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів справляв офлоксацин і найменшу – канаміцин.

У процесі культивування з рифампіцином і офлоксацином відбувалося збільшення кількості CD8⁺ -клітин, експресуючих CD69⁺ -маркер, особливо між 4 і 96 годинами, тоді як рифабутин у процесі культивування сприяв експресії CD8⁺ -фенотипом крім CD69⁺ і CD25⁺ -маркера. При порівнянні співвідношень між CD4⁺ CD25⁺ /CD8⁺ CD25⁺ у зразках лімфоцитів без препаратів і з рифампіцином, офлоксацином і канаміцином виявлене зростання, у той час як з рифабутином відзначається зменшення цього показника. Порівняльний аналіз співвідношення CD4⁺ CD69⁺ /CD8⁺ CD69⁺ показав його збільшення у всіх зразках. Очевидно, порушення імунної відповіді в хворих ТБ пов’язано не тільки зі зміною кількості клітин, але і з порушенням процесів їх активації. На підставі отриманих результатів можна констатувати у хворих на ТБ зниження кількісного вмісту Т-лімфоцитів та їх регуляторних субпопуляцій різних фенотипів не тільки в крові, але й у процесі індукованої активації in vitro.

Таким чином, отримані результати експресії активаційних маркерів на поверхні CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів під дією рифампіцину, рифабутину, офлоксацину і канаміцину розширюють уявлення про активовані Т-клітини у розвитку туберкульозного процесу і зіграють позитивну роль у визначенні нових підходів до корекції порушень імунної системи на рівні активації імунорегуляторних субпопуляций.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі проведено порівняльне вивчення впливу протитуберкульозних препаратів (рифампіцину, рифабутину, офлоксацину, канаміцину та ізоніазиду) та їх комбінацій на стан імунологічної реактивності організму in vitro та in vivo , проаналізований вплив вище названих препаратів та їх комбінацій на показники імунітету, встановлені їх імунотропні властивості з метою оптимізації хіміотерапії туберкульозу. Дослідження проводили на до клінічному рівні (на щурах та морських свинках), а такою у клініці серед людей, хворих на туберкульоз легенів.

Оцінка показників периферичної крові (рівня гемоглобіну, ШОЕ, лейкоцитарної формули) у щурів і морських свинок показала, що рифабутин і офлоксацин сприяють поверненню їх до початкового рівня у експериментальних тварин: підвищені у заражених туберкульозом тварин рівні гемоглобіну, ШОЕ та лейкоцитів знижувалися.

В експерименті при модельному туберкульозі у морських свинок і щурів встановлено, що офлоксацин і рифабутин мають більш виражені імунотропні властивості, ніж рифампицин і канаміцин. Аналогічна закономірність виявлялася і у впливі даних препаратів на показники імунітету у людини.

Показники фагоцитарної активності нейтрофілів, рівень циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові щурів і морських свинок, рівень Т- і В-лімфоцитів після лікування канаміцином і рифампіцином знаходилися на рівні заражених тварин. Показники гуморального і клітинного імунітету, отримані після застосування рифабутину і офлоксацину, були аналогічними або наближалися до норми, що свідчить про позитивний вплив даних препаратів на імунні механізми експериментальних тварин і людей.

В периферичній крові хворих на туберкульоз легенів виявлено глибоке порушення початкового імунного статусу з чітким вторинним імунодефіцитом, що супроводжувався зменшенням в крові CD3+ у 65,8% хворих, CD4+ у 73,1% і CD8+ у 61,8%, збільшенням CD16+, CD19+ і CD21+ у 70,7%, CD25+, пониженням фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа, спонтанної та індукованої ЛХЗЛ.

У хворих на туберкульоз легенів стимуляція рифампіцином знижувала вміст CD3 на 5,4%, CD16 - на 4,0% і CD25 - на 6,5%; рифабутином підвищує CD4 (2,5%) і CD8 (2,6%), знижує CD16 (4,0%) і CD25 (11,3%); офлоксацином знижує концентрацію CD16 (6,3%) і збільшує CD4 (3,3%); канаміцином знижує CD3 на 3,6%, CD16-на 13,1%, CD25-на 4,0% і CD4- на 2,1%.

Ріфампіцин не впливав на активність CD4+CD25+-маркерів і пригнічував активність CD3+CD25+ і CD8+CD25+-клітин у весь час культивування, а також CD3+CD69+-маркерів до 96 годин in vitro. Ріфабутін посилював активність CD3+CD25+, CD3+CD69+ і CD8+CD25+-клітин і пригнічував функціональну активність CD4+CD25+-клітин. Офлоксацин позитивно впливав на рівень CD3+CD25+, CD3+CD69+, CD4+CD25+ і CD4+CD69+-клітин. Канаміцин пригнічував функціональну активність CD3+, CD4+ і CD8+-лімфоцитів, експресуючих активаційні маркери. Найбільш виражену дію на експресію активаційних маркерів мав офлоксацин, а якнайменш виражену – канаміцин.

При комбінованій терапії експериментальних тварин, заражених туберкульозом, введення в схеми лікування рифабутину, офлоксацину та ізоніазиду сприяло прояву імунотропних властивостей. Серед вивчених комбінацій найкращий імунозбережуючий ефект виявило поєднання ізоніазиду з офлоксацином та рифабутином.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛИКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Абу-Кешк Талат Хафиз. Современный взгляд на химиотерапию туберкулеза и иммунитет // Azerbaijan medical journal. – 2003. – № 1. – С. 124-127.

2. Абу-Кешк Талат Хафиз. Т-клеточная защита у больных туберкулезом легких при воздействии рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина // Здоровье. – 2003. – № 9. – С. 11-14.

3. Абу-Кешк Талат Хафиз. Уровень маркеров активации у больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Azerbaijan medical journal. – 2004. – № 1. – С. 69-71.

4. Абу-Кешк Талат Хафиз. Динамика маркеров активации in vitro у больных туберкулезом легких // Фармацевтический бюлетень. – 2004. – № 1. – С. 34-36.

5.Абу-Кешк Талат Хафиз. Показатели иммунной системы больных туберкулезом легких на фоне противотуберкулезной терапии // Здоровье. – 2004. – № 6. – С. 26-29.

6. Абу-Кешк Талат Хафиз, Деримедведь Л.В. Действие рифампицина, рифабутина, офлоксацина и канамицина на экспрессию Т-клеток // Актуальні


8-09-2015, 22:49