МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

БУХТІЯРОВА ІРИНА ПЕТРІВНА

УДК: 615.24.244

Фармакологічне обґрунтування використання препарату “рексод” при цукровому діабеті

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеню кандидата фармацевтичних наук

за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія

Харків – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакології Національного фармацевтичного університету, Міністерство охорони здоров’я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, Деримедвідь Людмила Віталіївна.

Національний фармацевтичний університет, професор кафедри фармакотерапії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Маслова Наталія Федорівна, ДП “Державний науковий центр лікарських засобів” МОЗ України, завідувачка лабораторії біохімічної фармакології, доктор біологічних наук, старший науковий співробітник.

Горбенко Наталія Іванівна

завідувачка відділом експериментальної фармакології та токсикології Інституту проблем ендокринної патології ім. В.Я. ДанилевськогоАМН України.

Захист відбудеться ”” лютого 2008 року о год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “” грудня 2007 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Цукровий діабет (ЦД) визнано у світі неінфекційною епідемією, що належить до 5 головних причин смертності населення в більшості країн світу (Zimmet P.Z., 1999). За останні 10 років кількість хворих на цукровий діабет в Україні збільшилась більш ніж у 1,5 рази і складає близько 1 млн. чоловік. У той же час при активних масових обстеженнях населення на кожного раніше виявленого хворого на ЦД виявляють 3-4 нових, раніше не зареєстрованих хворих (Тронько Н.Д., 2005).

Серед значної кількості факторів, які сприяють розвитку ЦД та його ускладнень, особливе місце приділяється розвитку оксидативного стресу (Baynes J.W., Thorpe J.W., 1999). Утворення продуктів вільнорадикального окислення (ВРО) та пероксинітриту спричиняє розвиток ендотеліальної дисфункції, призводить до активації тромбоцитів та моноцитів, проліферації гладко-м’язових волокон, що викликає прогресування діабетичних ангіопатій (Балаболкин О.А., 2005). В останні роки процес ВРО розглядають у якості універсального механізму, що об'єднує основні біохімічні шляхи токсичного впливу гіперглікемії на судини (Brownlee M., 1995; Bonnefont-Rousselot D., Bastard J.P., Jaudon M.C., 2000). Залежно від місця утворення вільні радикали можуть пошкоджувати як внутрішньоклітинні структури (мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум, ДНК та ін.), так і мембрани клітин (Пасечник И.Н., 2004).

Для запобігання ВРО- обумовлених пошкоджень при цукровому діабеті виправданим є використання лікарських препаратів, здатних коригувати розвиток цукрового діабету шляхом послаблення токсичної дії вільних радикалів кисню та продуктів ВРО. Тому в комплексну фармакотерапію ЦД включають антиоксиданти (Траєшко А.В. 2006), що дозволяє знизити надмірну активність процесів ВРО, зокрема в b-клітинах підшлункової залози та клітинах ендотелію.

Найчастіше при лікуванні ЦД та його ускладнень використовують тіоктову кислоту, кверцетин, б-токоферолу ацетат. Однак, ці антиокисники переважно гальмують перекисне окислення ліпідів і майже не впливають на ініціацію ВРО. Головна ж роль у захисті клітин на початкових стадіях ВРО від активних форм кисню відводиться ферментам супероксиддисмутаз (СОД), які перетворюють супероксидний аніон-радикал (О₂ ^· ) в менш реакційно-здатний перекис водню. На сьогодні клас ферментів супероксиддисмутаз є єдиними серед інших антиокисних ферментів, які безпосередньо гальмують вільнорадикальні реакції на так званій “нульовій” стадії. Тому, зважаючи на значну роль вільнорадикальних механізмів розвитку інсулінової недостатності та ускладнень діабету, є патогенетично обґрунтованим використання препаратів супероксиддисмутази, зокрема препарату рекомбінантної Cu-Zn СОД – рексод, у комплексній фармакотерапії ЦД.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету (НФаУ) “Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної та природної сировини, зокрема продуктів бджільництва, для дорослих та дітей” (№ державної реєстрації 0198U007008), а також госпбюджетної тематики кафедри фармакології "Створення на основі супероксиддисмутази препарату для корекції цукрового діабету і його ускладнень" (№ Державної реєстрації 0198U007001).

Мета і завдання дослідження. Метою досліджень є фармакологічне обґрунтування доцільності застосування рексод на різних етапах розвитку інсулінової недостатності. Для досягнення поставленої мети були визначені та вирішені такі завдання :

1. Теоретично обґрунтувати доцільність застосування препарату супероксиддисмутази – рексод при цукровому діабеті.

2. З’ясувати доцільність використання рексод за умов первинної інсулінорезистентності на стадії переддіабету.

3. Дослідити ефективність рексод при відносній інсуліновій недостатності.

4. Визначити ефективність рексод при абсолютній інсуліновій недостатності.

5. Встановити оптимальні комбінації рексод з традиційними цукрознижувальними препаратами та антиоксидантами за умов первинної інсулінової резистентності.

Об'єкт дослідження. Препарат рекомбінантної супероксиддисмутази –рексод.

Предмет дослідження. Фармакологічна активність рексоду тварин з відносною та абсолютною інсуліновою недостатністю.

Методи дослідження . При виконанні роботи були використані фармакологічні, патофізіологічні, біохімічні, статистичні методи досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів . Уперше експериментально встановлено ефективність використання рексод на різних етапах формування інсулінової недостатності. Експериментально доведена ефективність комбінованого застосування рексод з антиоксидантами та пероральними цукрознижувальними препаратами. На основі комплексних досліджень встановлено, що рексод відновлює про/антиоксидантний баланс, зменшує прояви інсулінорезистентності та інтолерантності до вуглеводів, виявляє ангіопротекторні і мембранопротекторні ефекти.

Практичне значення отриманих результатів .На підставі фармакологічних досліджень рексод доведено перспективність її застосування у комплексній терапії різних проявів інсулінової недостатності. Дані дослідження є фрагментом звіту про доклінічне вивчення рексод. Результати проведених досліджень впроваджено в науково-педагогічну діяльність кафедр фармакології, клінічної фармакології та фармакотерапії, ендокринології НФаУ, ХДМУ, ДонНМУ, ХМАПО.Результати дисертації з комбінованого застосування рексод з цукрознижувальними препаратами та антиоксидантами увійшли до інформаційних листів №350/07 “Критерії використання антиоксидантів при цукровому діабеті” та №22-2007 “Можливості використання препарату рекомбінантної супероксиддисмутази – рексод – при цукровому діабеті” і можуть бути експериментальним обґрунтуванням для подальших досліджень з оптимізації лікарської профілактики та фармакотерапії оксидативного стресу при цукровому діабеті.

Особистий внесок дисертанта. Дисертація є самостійною завершеною науковою працею. Автором був здійснений патентно-інформаційний пошук, проведений аналіз даних літератури за темою дисертації, експериментальні дослідження, статистична обробка отриманих даних, аналіз і систематизація отриманих результатів, сформульовані висновки. Разом з науковим керівником розроблена програма, визначені мета і завдання досліджень, методичні підходи до експериментальних досліджень. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, дисертантом наведені результати власних досліджень.

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на: Міжнародній науково-практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок” (м. Харків, 2006); Міжвузівській науковій конференції “Актуальні питання створення нових лікарських засобів” (м. Харків, 2006 р.); Всеукраїнській науково-практичної конференції “Підготовка клінічних провізорів в Україні: досвід, проблеми та перспективи” (м. Чернівці, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті в центральних наукових журналах, 3 тези, 2 інформаційних листки.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках машинописного тексту і складається з огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, аналізу результатів досліджень, висновків, списку джерел літератури. Робота містить 8 рисунків, 40 таблиць, 3 схеми. Бібліографія включає 252 джерела інформації, з них 72 – іноземною мовою.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження . Об’єктом дослідження був препарат рексод, що містить рекомбінантну людську Cu-Zn СОД, отриману у ВАТ "РЭСБИО” (м. Санкт-Петербург) методом генної інженерії з культури штаму дріжджів-продуцентів Saccharomyces cerevisiae Y 2134. Рексод являє собою ліофільно висушений білий порошок із блакитнуватим відтінком, без запаху і смаку, гігроскопічний, розчинний у воді та етанолі.

Для вирішення поставлених завдань використовували таку схему дослідження (схема 1):

Усі досліди на тваринах проводили згідно з вимогами Європейської конвенції із захисту тварин, що використовуються для експериментальних і наукових цілей (м. Страсбург, 1985), та національних “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах” (Україна, 2001).

На першому етапі дослідження оцінювали антиокислювальні та цукрознижувальні ефекти рексод у інтактних тварин. Рексод щоденно вводили внутрішньом’язово у дозі 0,065 мг/кг протягом 2-х місяців. Контрольна група тварин отримувала внутрішньом’язово 0,2 мл ізотонічного розчину натрію хлориду (що був аналогічним об’єму введеної рексод).

Наступним етапом експериментальних досліджень було встановлення впливу рексод на основні метаболічні прояви первинної інсулінорезистентності на стадії переддіабету.

Інсулінорезистентність відтворювали у безпородних білих щурів - самців шляхом перорального введення фруктози (200 г/л) з питною водою протягом 2 місяців. Дана модель відображає метаболічні зміни, які характерні для метаболічного синдрому (МС): гіпертригліцеридемію, інсулінорезистентність та зниження толерантності до глюкози. Рексод вводили внутрішньом’язово у лікувально-профілактичному режимі протягом 2-х місяців.

Для відтворення первинної інсулінорезистентністі іншого ґенезу використовували дексаметазонову модель шляхом введення щурам віком 3 місяці дексаметазону у дозі 0,125 мг/кг підшкірно протягом 13 діб (Okamoto H., 1981). Рексод вводили внутрішньом’язово у лікувально-профілактичному режимі протягом 15 діб.

Для дослідження ефективності рексод при відносній інсуліновій недостатності використовували модель неонатального стрептозотоцинового діабету (Portha В., 1985), яку відтворювали шляхом внутрішньоочеревинного одноразового введення стрептозотоцину у дозі 100 мг/кг щурам на другу добу після народження. Для вивчення терапевтичної дії рексод на розвиток даної патології тварини отримували препарат впродовж 60 діб, починаючи з п’ятого дня після ін’єкції стрептозотоцину.

Для відтворення абсолютної інсулінової недостатності використовували моделі високодозового стрептозотоцинового діабету (дорослим щурам одноразово внутрішньоочеревинно вводили 1% розчин стрептозотоцину у дозі 70 мг/кг) та модель дитизонового діабету (внутрішньовенне одноразове введення дитизону в дозі 35 мг/кг маси тіла самцям кролів породи "Шиншила").

Стан глюкозного гомеостазу оцінювали за показниками базальної глікемії, інсулінемії та внутрішньовенного тесту толерантності до глюкози – ВВТТГ (0,5 г глюкози на кг маси тіла у кролів) та внутрішньоочеревинного тесту толерантності до глюкози у щурів – ВЧТТГ (3,0 г/кг). Вміст глюкози у крові визначали глюкозооксидазним методом за допомогою ферментативного аналізатора глюкози "Ексан-Г". Площину під глікемічними кривими при проведенні ВВТТГ розраховували за допомогою комп'ютерної програми "Mathlab". Базальну інсулінемію визначали радіоімунологічним методом "подвійних антитіл", використовуючи набори “Беларіс”. Коефіцієнти інсулінорезистентності та функції b-клітин розраховували за допомогою алгоритму "HOMA" (математичної моделі інсуліно-глюкозного зв’язку). Рівень глікозильованого гемоглобіну (HbA_1c ) досліджували колориметричним методом, а фруктозаміну – за методом Johnson R.N. (1982). Рівень мікроальбумінурії в сечі визначали імуноферментним методом (Пушкарев И.А., 1985), креатиніну – за методом Кондрахина И.П. (Кондрахин И.П. и др., 1985).

Активність процесів ВРО досліджували за вмістом ТБК-активних продуктів (Стальная И.Д., Гаришвили Г.Т., 1977) та дієнових кон’югатів (ДК). Стан антиокисної системи оцінювали за рівнем відновленого глутатіону (Beutler E. еt аl., 1963), активністю каталази (Королюк М.А. и др., 1988) глутатіон-пероксидази (Герасимов А.М. и др., 1976). СОД-подібну активність вивчали за реакцією окислення кверцетину. Активність аланін- та аспартатамінотрансфераз визначали за методом Reitman S., Francel S. (1957). У гомогенатах печінки активність глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Ф) визначали за методом Swanson М. (1950).

Для оцінки ліпідного та білкового обміну використовували біохімічні набори фірми “Lachema” (Чехія). Креатинін крові та сечі досліджували за реакцією Яффе, загальний білок визначали біуретовим методом (камышников В.С., 2003). Усі досліди проводили відповідно до методик і вимог ДФЦ МОЗ України з доклінічного дослідження лікарських засобів (Київ, 2001).

На всіх етапах дослідження рексод вводили внутрішьом’язово у дозі 0,065 мг/кг (ЕД₅₀ за антиоксидантною активністю). Як препарат порівняння використовували класичний антиоксидант (Сало Н.Д., 2001) – a-токоферолу ацетат (виробник ІCN “Октябрь”, РФ), який вводили внутрішьом’язово в дозі 50 мг/кг (ЕД₅₀ за антиоксидантною активністю). Вибір інших препаратів порівняння (нікотинамід, емоксипін, корвітин, розиглітазон, метформін) було обумовлено характером патології та вимогами ДФЦ МОЗ України з доклінічного вивчення лікарських засобів.

Статистичну обробку отриманих результатів здійснено методами варіаційної статистики за допомогою стандартних пакетів програм Exсel на персональному комп’ютері Pentium ІІІ. При порівнянні результатів між двома групами використовували модифікований параметричний t- критерій Ст’юдента для виборок з нерівними дисперсіями.

Усього відтворено 5 експериментальних моделей інсулінової недостатності та інсулінорезистентності, використано 310 щурів та 48 кролів.

Результати досліджень та їх обговорення

Одним із розповсюджених патологічних станів, пов'язаних з порушеннями вуглеводного обміну, є метаболічний синдром. Зважаючи на те, що складовою метаболічного синдрому є активація ВРО та інсулінорезистентність, нами проводилося порівняльне дослідження ефективності використання рексод і a- токоферолу ацетату при метаболічних ознаках інсулінорезистентності щурів.

Встановлено, що при використанні рексод порівняно з нелікованими тваринами спостерігалось достовірне зменшення рівнів ТБК-АП, АлАТ та тригліцеридів в 1,3 рази (р≤0,05). Ці зміни супроводжувались збільшенням рівня ВГ на 35% (р≤0,05), що свідчить про збереження функціональної активності антиокисної системи при застосуванні рексод, що опосередковано призвело до поліпшення вуглеводного обміну. Останнє підтверджується зменшенням в 1,5 рази в порівнянні з нелікованим контролем базальної інсулінемії та зменшенням активності Г-6-Ф в 1,6 рази (р≤0,05).

Також слід зазначити, що при ЦД підвищений рівень АлАТ свідчить не тільки про активність цитолітичних процесів, але й є непрямим маркером розвитку печінкової інсулінорезистентності (Колб В.Г., Камышников В.С., 2001; Балаболкин О.А., 2005). Отже зменшення рівня АлАТ на фоні використання рексод свідчить про зменшення проявів інсулінорезистентності, зокрема в печінці.

Таким чином, результати дослідження свідчать про зниження оксидативного стресу при даній патології на фоні використання рексод, що в свою чергу підвищує чутливість периферичних тканин до дії інсуліну. Слід зазначити, що ефективність рексод була в середньому на 20% вище ефективності a-токоферолу ацетату.

Дезадаптація антиокисних систем, інсулінорезистентність та інтолерантність до глюкози може виникати також внаслідок тривалого використання глюкокортикостероїдів (Buren J., Ereksson J., 1999).

Встановлено, що використання рексод за рахунок зниження виразності окидативного стресу гальмує розвиток інсулінорезистентності, індукованої введенням дексаметазону (ДМ). Так, рівень ТБК-АП при введенні препарату рексод знизився порівняно з нелікованим контролем у 1,7 разів (р≤0,05). Аналогічною була дія і на рівень ДК: рексод зменшувала цей показник у 1,4 рази.

При цьому спостерігається достовірне (р≤0,05), в порівнянні з нелікованими тваринами, збільшення рівня ВГ та збереження СОД - подібної активності (рис. 1). Встановлено, що у тварин, яким вводили рексод, спостерігалось зниження інтолерантності до глюкози, про що свідчили результати тесту ВЧТНГ: площина під глікемічною кривою при лікуванні рексод була достовірно нижче (р≤0,05) відносно показників групи контрольної патології. Крім того, коефіцієнт чутливості до інсуліну при застосуванні рексод збільшився на 35%.

Ці зміни супроводжувались не тільки покращенням стану вуглеводного обміну на фоні використання рексод, але й покращенням стану білкового обміну (збільшенням рівня білка в крові 1,2 рази) та зменшенням рівня тригліцеридів в 1,4 рази (р≤0,05).

Як відомо, підвищена концентрація вільних жирних кислот (ВЖК) чинить токсичний вплив на b-клітини (феномен ліпотоксичності) та асоціюється з інсулінорезистентністю, метаболічним синдромом і цукровим діабетом ІІ типу (Heijer T., Vermeer S.E., van Dijk E.J., 2003).

Крім того, ВЖК як інгібітори активності піруватдегідрогенази знижують утворення АТФ (головного регулятора секреції інсуліну), викликаючи порушення функції b-клітин (Ceriello A., Motz E., 2004). Встановлено, що при застосуванні рексод рівень тригліцеридів зменшився в 1,4 рази (р≤0,05) в порівнянні з нелікованими тваринами, що свідчить про нормалізацію ліпідного обміну.

Ефективність a-токоферолу ацетату при даній патології була на 25% меншою, ніж рексод.

Дослідження, проведені на тваринах з неонатально-індукованим діабетом, викликаним введенням стрептозотоцину, показали, що антиоксидантний механізм дії рексод є основним в її лікувальних властивостях при відносній інсулінової недостатності.

Встановлено, що на 8 тиждень після індукції діабету (на цей час у дослідних тварин розвивається відносна інсулінова недостатність з помірною базальною гіперглікемією та порушенням толерантністі до глюкози, що за патогенетичними ознаками наближається до ЦД ІІ типу у людини) використання рексод у лікувальному режимі на 2-й місяць експерименту призвело до зменшення інтенсивності процесів ВРО на 55% (р£0,05) та покращення антиоксидантного захисту в середньому на 30-45% (р£0,05).

Наступним етапом наших досліджень стало вивчення впливу рексод на інтенсивність процесів ВРО та стан вуглеводного обміну в умовах абсолютної інсулінової недостатності, викликаної введенням дитизону у кролів. Як відомо, дитизон утворює хелатні комплекси з іонами цинку, блокуючи утворення проінсуліну (Полторак В.В., Горбенко Н.И., 2000).

В результаті проведених дослідів встановлено, що лікувальна дія рексод при даній патології реалізується шляхом зниження інтенсивності вільно-радикального окислювання та покращення функціональної активності антиокисних систем. Так, на фоні використання рексод рівень ТБК-АП в порівнянні з нелікованим контролем зменшився у 1,2 рази (через 1 міс.) і 2,1 рази (через 2 міс.); рівень ДК зменшився у 1,2 та 1,9 разів, відповідно. Також при застосуванні рексод спостерігалось достовірне (р£0,05) збільшення рівня відновленого глутатіону, який відіграє важливу роль у регуляції секреції інсуліну, зростання СОД-подібної активності протягом всього терміну експерименту (протягом 2 місяців).

Зменшення інтенсивності процесів ВРО-деструкції опосередковано призвело і до покращення функції панкреатичних b-клітин. Про це свідчить поступова динаміка процесу відновлення їх функціональної активності (рис. 2).

Слід зазначити (рис. 2), що починаючи з 6 тижня застосування рексод, у кролів з дитизоновим діабетом (ДД) спостерігалось зниження базальної гіперглікемії на 36%, а через 8 тижнів від початку експерименту рівень глікемії при введенні рексод зменшився на 61% (р£0,05).

Також через 8 тижнів застосування рексод в порівнянні з нелікованим контролем зареєстровано підвищення в 1,7 разів базальної інсулінемії (p<0,05) та коефіцієнта функції панкреатичних в-клітин в 6 разів (p<0,02) (табл. 1). Про поліпшення толерантності до вуглеводів під впливом 2-місячного застосування рексод також свідчило вірогідне зменшення площини під глікемічними кривими на 50,5% відносно нелікованих тварин та збільшення коефіцієнта функції b- клітин у 6,1 рази (табл. 1).

Таблиця 1. Показники глюкозного гомеостазу у кролів з дитизоновим діабетом, які отримували рексод та a-токоферолу ацетат протягом 2-х місяців, (М±м)