Експериментальні дослідження ефективності тіотриазоліну за умов доксорубіцинової кардіоміопатії

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Трофімова Тетяна Сергіївна

УДК 615.22 + 615.274:

616.127 – 092.9 – 02 : 615.33.099

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ТІОТРИАЗОЛІНУ ЗА УМОВ ДОКСОРУБІЦИНОВОЇ КАРДІОМІОПАТІЇ

14.03.05 – фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університетіімені О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ.

Науковий керівник :

- член-кореспондент НАН і АМН України, доктор медичних наук, професор Чекман Іван Сергійович, Національний медичний університет імені О.О. Богомольця МОЗ України, м. Київ, завідувач кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Сотнікова Олена Петрівна, Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України, м. Одеса, завідувач лабораторії фармакології та тканинної терапії;

- доктор медичних наук, професор Піняжко Олег Романович, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, м. Львів, завідувач кафедри фармакології.

Захист відбудеться 09.04.2008 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).

З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).

Автореферат розісланий 07.03.2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

к. мед. н., доцентВ.В. Годован

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Протипухлинні антибіотики із групи антрациклінів (доксорубіцин, даунорубіцин, епірубіцин та ін.) широко застосовують для лікування гемобластозів та інших злоякісних новоутворень. Однак терапія цими препаратами супроводжується розвитком багатьох ускладнень, в тому числі і кардіальних. Клінічний досвід свідчить, що доксорубіцин є одним з найбільш активних і широко застосовуваних антрациклінових антибіотиків (Лосєва М.П., 2000; Шарикіна Н.І., 2004; Исмаил-Заде Р.С., 2005; Berry G.І. et al., 2005; Dalen E.C. et al., 2006).

Особливості хімічної будови, фармакокінетики, фармакодинаміки доксорубіцину зумовлюють виражену кардіотоксичність, яка призводить до розвитку дилятаційної кардіоміопатії, що вимагає відміни препарату ще до досягнення оптимального клінічного ефекту (Коваленко В.М., 2002; Bertіnchard І.P. et al., 2003; Калінкіна Н.В., 2004; Dudka І., 2006). Для попередження токсичного впливу антрациклінів на міокард застосовується дексразоксан (кардіоксан). Однак, останніми роками встановлені побічні ефекти препарату: апоптогенна дія на кардіоміоцити, мієлотоксичність, що значно обмежує його застосування (Sromova T. et al., 2002).

Кардіотоксична дія властива також препаратам, що містять фтор: фторвміщуючі цитостатики, натрію фторид, фторвмісні глюкокортикоїди. Засоби для запобігання кардіотоксичному впливу останніх не розроблені і в клініці відсутні (Kolarіc K. et al., 1995; Head K. et al., 2001; Коваленко В.М. та ін., 2002).

Обмежена можливість лікування цих патологічних станів обґрунтовує необхідність пошуку та впровадження ефективних та безпечних медикаментів для попередження їх виникнення.

В цьому плані особливу увагу привертає метаболітний препарат тіотриазолін. Як представник групи метаболітних препаратів, завдяки наявності в хімічній структурі сірки, тріазолового кільця й метильної групи тіотриазолін має широкий спектр фармакологічної активності, що є особливо важливим для клінічного застосування. Унікальні фармакологічні властивості, безпечність при застосуванні, зручні лікарські форми обумовили широке застосування препарату в медичній практиці (Сапегин И.А., 2000; Бибик О.Ю., 2002; Степанюк Г.І., 2002; Тереховський А.І., 2003; Мазур І.А. і співавт., 2005; Чекман І.С., 2007). Встановлення нових аспектів фармакодинаміки тіотриазоліну по попередженню кардіотоксичності доксорубіцину є актуальним і обґрунтовує доцільність проведення даного дослідження, яке має теоретичне і практичне значення.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом НДР МОЗ України, яка виконується кафедрою фармакології з курсом клінічної фармакології Національного медичного університету (НМУ) імені О.О. Богомольця за темою: “Вивчення кардіопротекторної дії лікарських засобів за умов токсичного ураження міокарда” (№ державної реєстрації 01.03 U005667). Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є експеримен­тальне обґрунтування доцільності застосування тіотриазоліну для попередження токсичних уражень міокарда, викликаних доксорубіцином та натрію фторидом.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

1. Дослідити антитоксичні властивості тіотриазоліну при гострій токсичності доксорубіцину та натрію фториду в експериментах на білих мишах.

2. Вивчити вплив тіотриазоліну на показники кардіо- та систем­ної гемодинаміки у кролів за умов моделювання доксорубіцинової кардіоміопатії та при фторидній інтоксикації.

3. Дослідити вплив тіотриазоліну на основні показники ліпідного обміну та антиоксидантного захисту міокарда та печінки щурів за умов моделювання доксорубіцинової кардіоміопатії.

4. Проаналізувати вплив тіотриазоліну на жирнокислотний склад ліпідів печінки та міокарда щурів з доксорубіциновою кардіоміопатією.

5. Вивчити дію тіотриазоліну на біохімічні показники енергетичного обміну міокарда щурів.

6. Оцінити морфологічні та гістохімічні показники тканин серця у щурів із досліджуваною патологією та при застосуванні тіотриазоліну.

Об’єкт дослідження: лікувально-профілактична ефективність метаболітних препаратів за умов токсичного ураження міокарда.

Предмет дослідження: кардіопротекторні ефекти тіотриазоліну при моделюванні доксорубіцинової кардіоміопатії та фторидної інтоксикації.

Методи дослідження: фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, фізіологічні, морфологічні, гістохімічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлена захисна дія тіотриазоліну за умов доксорубіцинової і фторидної інтоксикації, що проявляється дозозалежним зменшенням токсичності даних препаратів.

Вперше досліджено захисний вплив тіотриазоліну на стан кардіо- та системної гемодинаміки у кролів з доксорубіциновою кардіоміопатією та фторидною інтоксикацією. Показано, що за умов доксорубіцинової кардіоміопатії вірогідно зменшується максимальний тиск в лівому шлуночку, робочий індекс лівого шлуночка та робочий ударний індекс лівого шлуночка, системний артеріальний тиск. Встановлений виражений протекторний вплив тіотриазоліну на показники скоротливої активності міокарда; препарат запобігає зниженню показників кардіо- та системної гемодинаміки.

Вперше отримані результати щодо антигіпоксантних властивостей тіотриазоліну за умов модельованої патології. Препарат корегує дисбаланс в системі АТФ–АДФ–АМФ, нормалізує рівень ніко­тинамідних коферментів, що свідчить про позитивний вплив на процеси енергозабезпечення міокарда за умов токсичної дії доксорубіцину. Вперше з’ясовано, що провідним у механізмах кардіотропної дії тіотриа­золіну за умов доксорубіцинової кардіоміопатії є антиоксидантний та антитоксичний ефекти. Медикамент гальмує надмірне утворення продуктів пероксидного окислення ліпідів (спонтанний та ферментативнозалежний вміст малонового диальдегіду) у патологічно змінених тканинах серця й печінки щурів, проявляє індукуючий вплив на систему антиоксидантного захисту (активність супероксиддисмутази та каталази), тим самим захищає структурно-функціональну цілісність біомембран клітин, а також проявляє антитоксичну дію. Вперше показано, що мембранопротекторна дія тіотриазоліну є взаємопов’язаною зі структурою поліненасичених жирних кислот. Тіотриазолін при курсовому застосуванні нормалізує рівень ПНЖК і співвідношення насичених і ненасичених жирних кислот як у ліпідах тканин печінки, так і у ліпідах тканин серця щурів з доксорубіциновою кардіоміопатією, забезпечуючи стабільність клітинних мембран за умов оксидантного стресу. Вперше встановлений протекторний вплив медикаменту на морфологічну і гістохімічну структуру міокарда при доксорубіциновій кардіоміопатії: профілактичне введення тіотриазоліну зменшує ступінь енергетичних і структурних порушень кардіоміоцитів.

Новизна роботи підтверджена патентом України №78551 від 29.09.04 р. “Спосіб корекції доксорубіцинової кардіоміопатії тіотриазоліном” та патентом РФ №2285532 від 28.10.04 р. “Способ коррекции токсических поражений, вызванных доксорубицином”.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані розкривають нові аспекти фармакодинаміки тіотриазоліну і є експери­мен­тальним обґрунтуванням доцільності клінічного застосування тіо­триа­золіну для попередження розвитку доксорубіцинової кардіоміопатії.

Результати дисертаційної роботи впроваджені в учбовий процес кафедри фармакології Вінницького Національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедри фармакології з курсом клінічної фармакології Івано-Франківського державного медичного університету, кафедри фармакології Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри фармакології Луганського Державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана здобувачем самостійно. Особисто проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз наукової літератури за темою дисертації, визначено мету та основні завдання дослідження. Дисертантом безпосередньо відтворені моделі, проведені експериментальні дослідження, систематизація, статистична обробка даних та оформлення їх у вигляді таблиць і рисунків, проаналізовано результати досліджень, сформульовані висновки, опубліковані основні положення дисертації. Біохімічні дослідження проведені в лабораторії біохімії (зав. лаб. – к.х.н. Юрженко Н.М.), лабораторії газової хроматографії (зав. лаб. – к.т.н. Брюзгіна Т.С.), лабораторії метаболічного і структурного аналізу (зав. лаб. – д.мед.н., професор Колєсова Н.А.) Науково-дослідного лабораторного центру НМУ імені О.О. Богомольця. Дисертант висловлює щиру вдячність завідувачам лабораторій НДЛЦ за методичну та консультативну допомогу.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на: науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання тканинної терапії та перспективи застосування природних біологічно активних речовин у сучасній медицині” (Одеса, 2003); V науково-практичній конференції “Сучасні проблеми клінічної фармакології, імунопрофілактики та імунотерапії” (Київ, 2004); ІV Українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології (Вінниця, 2004); ІІ Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі “Ліки та життя” (Київ, 2005); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Нове в офтальмології”, присвяченій 130-річчю з дня народження академіка В.П. Філатова (Одеса, 2005); Міжнародному медико-фармацевтичному конгресі “Ліки та життя” (Київ, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Сучасні досягнення фармацевтичної науки та практики” (Запоріжжя, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових робіт, з них – 6 статей у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 2 Деклараційні патенти на винахід та 7 тез у матеріалах з’їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 156 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, основних методів дослідження, 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, загальних висновків, практичних рекомендацій і списку використаних джерел, перелік яких містить 329 найменувань, з них 219 кирилицею та 110 – латиною. Робота ілюстрована 27 рисунками і 24 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проведені на 120 статевозрілих білих щурах обох статей лінії Вістар масою 170-230 г, 100 білих нелінійних мишах масою 18-22 г, на 36 кролях породи Шиншила масою 2,6-4,5 кг, які утримувалися в стандартних умовах віварію при вільному доступі до води і їжі та згідно протоколу №13 від 31.10.2006 р. Комісії з питань етики НМУ імені О.О. Богомольця.Для проведення досліджень застосовували препарати: доксорубіцин-КМП (ВАТ “Київмедпрепарат”, Україна, з 2006 р. – корпорація “ARTERІUM”), натрію фторид (“Гриндекс”, Латвія), тіотриазолін (АТ “Галичфарм”, Україна, з 2006 р. – корпорація “ARTERІUM”).

Визначення гострої токсичності доксорубіцину і натрію фториду проводили при внутрішньоочеревинному (в/о) введенні мишам після попереднього розчинення у воді для ін’єкцій. Для визначення ДЛ₅₀ засто­совували метод В.Б. Прозоровського (1998). Враховували показники, які можуть бути застосовані для оцінки токсичного ефекту відповідно до Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).

Вибір режиму дозування доксорубіцину, натрію фториду був обґрунтований результатами пошукової роботи і літературних даних (Гольдберг Л.Е. и соавт., 1983; Дьяченко В.Ю., 1990; Капелько В.И. и соавт, 1990; Shan K. et al., 1996; Head K. et al., 2001; Давыдова Е.В., 2003). Дози тіотриазоліну були також визначені здобувачем на підставі аналізу даних наукової літератури (Беленичев И.Ф., 1991; Визир А.Д., 1997; Піняжко О.Р., 1998; Болгов Д.М., 2002; Мазур И.А. и соавт., 2005).

У гострому експерименті (наркоз – уретан 1 мг/кг) у всіх кролів проведено комплексне дослідження функціонального стану системи кровообігу з використанням метода катетеризації лівого шлуночка серця (ЛШС) для визначення максимального тиску лівого шлуночка (Р_max ) та метода термодилюції для визначення хвилинного об’єму крові (ХОК). Ці показники, а також системний артеріальний тиск (САТ) у стегновій артерії та частоту серцевих скорочень (ЧСС) реєстрували на приладі НР VІRІCUAComponentMonitoringSystem, HewlettPackard (США). Серцевий індекс (СІ мл/м² /хв), систолічний індекс (СиІ мл/м² ), загальний периферичний опір судин (ЗПО дин/сек/см³ ), робочий індекс лівого шлуночка (РІЛШ кгм/м² ), робочий ударний індекс лівого шлуночка (РУІЛШ кгм/м² ), дебіт серця (Д мл/с) визначали розрахунковим методом.

Модель антрациклінового ушкодження серця у кролів здійснювали шляхом в/в введення (у вушну вену) доксорубіцину в дозі 3 мг/кг маси один раз на тиждень протягом 4-х тижнів (Капелько В.И., Попович М.И., 1990; Ниженковская И.В., 1999). Тіотриазолін вводили за 1 год до введення доксорубіцину в/м щоденно у дозі 125 мг/кг маси протягом 4-х тижнів. Така доза тіотриазоліну була визначена на основі аналізу даних наукової літератури (Стец В.Р., Мазур И.А., 1993; Піняжко О.Р., 1998; Бибик В.В. и соавт., 2000) та проведених досліджень з антитоксичних властивостей препарату.

Доксорубіцинову кардіоміопатію на щурах моделювали в/м введенням доксорубіцину в дозі 5 мг/кг 1 раз на тиждень протягом 4-х тижнів. Тіотриазолін вводили щоденно в/м у дозі 150 мг/кг маси за 1 год до доксорубіцину протягом вказаного терміну.

Гостру фторидну інтоксикацію в експериментах на кролях здій­сню­вали в/в введенням натрію фториду в дозі 10 мг/кг та визначенням показників діяльності серця та стану гемодинаміки через 40 хв. Тіотриазолін вводили в дозі 125 мг/кг в/м за 1 год до натрію фториду.

Біохімічні дослідження проведені на інтактних щурах та тваринах при моделюванні доксорубіцинової кардіоміопатії і при попередньому введенні тіотриазоліну на фоні патології. В міокарді та печінці щурів визначали рівень малонового диальдегіду (МДА) – Стальная Ю.И. и соавт., 1977, активність супероксиддисмутази (СОД) – Чевари С.Т. и соавт., 1991 та каталази – Мещищен І.Ф., 1998.

Визначення основних показників енергетичного обміну міокарда проводили згідно загальноприйнятим біохімічним методам
(Прохорова М.И., 1982). Ідентифікацію аденілових нуклеотидів проводили методом електрофорезу на папері з наступною спектрофотометрією (Sato T.R. et al., 1963).

Визначення вмісту окислених нікотинамідних коферментів (НАД⁺ + НАДФ⁺ ) та їх відновлених форм проводили за загальноприйнятим флюорометричним методом (Huff І.M., Perlzweіg W.A., 1947) і виражали в мкмоль/кг вологої тканини. Газохроматографічний аналіз ліпідів тканин печінки та серця щурів проводили за методикою (Гичка С.Г., Брюзгіна Т.С. і співавт., 1998).

Визначення патоморфологічних і гістохімічних показників при відтворенні антрациклінової кардіоміопатії на щурах проводили, досліджуючи міокард лівого шлуночка (Ватутин Н.Т., Калинкина Н.В. и соавт., 2001),

Серійні парафінові зрізи товщиною 7 мкм виготовляли на санному мікроскопі, забарвлювали гематоксилін-еозином за Ван-Гізоном.

Вивчення основних закономірностей процесів оксидоредукції проведене на кріостатних зрізах серця товщиною 10 мкм. Активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) визначали – за Нахласом і співавт., малатдегідрогенази – МДГ – за Гесс, Скарпеллі і Пірс; цитоплазматичної б-гліцерфосфатдегідрогенази і лактатдегідрогенази – ЛДГ – за Гесс, Скарпеллі і Пірс; глюкозо-6-фосфатдегідрогенази – Г-6-ФДГ – пентозний цикл – за Гесс, Скарпеллі, Пірс; НАДФ-Н ДГ, – як показника активності всієї НАДФ-Н генеруючої системи дегідрогеназ, – за Фарбером.

Застосовані гістохімічні методики виконані за Е. Пірс (1962), патоморфологічні – за Б. Ромейс.

Всі використані при виконанні даної роботи одиниці виміру і параметри приведені у відповідність МСО (Липперт Г., 1980). Отримані результати обробляли статистично на персональному комп’ютері з використанням стандартного пакету програм “Statіstіca ver. 5.0”, “Statgraphіcs”, оцінювали вірогідність на рівні значимості не менше 95,0% (р≤0,05) з використанням критерію t Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Метою проведення першого етапу досліджень було визначення параметрів гострої токсичності доксорубіцину і натрію фториду. ДЛ₅₀ доксорубіцину становила 12,9 (6,5ч20) мг/кг. При попередньому в/о введенні тіотриазоліну в дозі 100 мг/кг ДЛ₅₀ доксорубіцину зростала у 1,8 рази і становила 23,5 (8,5ч44,5) мг/кг. При попередньому застосуванні тіотриазоліну в дозі 150 мг/кг ДЛ₅₀ доксорубіцину зростала у 2,2 рази і становила 28,2 (17,8ч45,5) мг/кг. При введенні тіотриазоліну в дозі 250 мг/кг ДЛ₅₀ доксорубіцину зростала в 2,8 рази і дорівнювала 35,7 (20ч87) мг/кг. Таким чином, тіотриазолін знижував токсичний ефект доксорубіцину в експериментах на мишах. Визначений ефект мав дозозалежний характер.

Гостра токсичність натрію фториду при в/о введенні склала 51,5 (29,7ч76,7) мг/кг; тіотриазолін при попередньому в/о введенні в дозі 100 мг/кг обумовив збільшення ДЛ₅₀ у 1,2 рази. При введенні тіотриазоліну в дозах 150 мг/кг та 250 мг/кг в/о відмічено зростання ДЛ₅₀ до 72,1 (45,1ч110,5) мг/кг та 118,4 (54,78ч180,11) мг/кг, тобто в 1,4 та 2,3 рази відповідно. Проведені експерименти показали, що протекторний ефект тіотриазоліну при фторидній інтоксикації дозозалежний.

Токсикологічні дослідження стали підставою для подальшого вивчення захисної дії тіотриазоліну відносно діяльності серця та стану гемодинаміки при модельованих патологічних станах. Тваринам вводили тіотриазолін у найменш ефективній дозі, при якій препарат проявляв антитоксичну дію. Результати проведених досліджень засвідчили зміни показників кардіо- і системної гемодинаміки, що характеризують скоротливу активність міокарда у кролів при доксорубіциновій кардіоміопатії: вірогідне падіння максимального тиску в лівому шлуночку, зниження робочого індексу лівого шлуночка на 29,0% та робочого ударного індексу лівого шлуночка на 26,5%. Інші показники, які характеризують кардіо- і системну гемодинаміку, мають тенденцію до зниження і підтверджують порушення скоротливості міокарда. Тіотриазолін за умов попереднього введення проявляє кардіопротекторну дію при доксорубіциновій кардіоміопатії стосовно зазначених показників скоротливої активності міокарда (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив тіотриазоліну на показники кардіо- та системної гемодинаміки у кролів при доксорубіциновій кардіоміопатії (М±m), n = 12

Примітки: у цій та наступних таблицях

* – р < 0,05 відносно групи інтактних тварин;

** – p < 0,05 відносно доксорубіцину.

За умов гострої фторидної інтоксикації пригнічується скоротлива активність міокарда. Так, відмічено вірогідне зниження максимального тиску у лівому шлуночку на 29,4%, УОК – на 22,5%, РУІЛШ – на 20,0%, РІЛШ – на 19,0%. Виявлені зміни показників центральної гемодинаміки: ХОК та СІ зменшуються на 23,0%, СиІ – на 24,0%, УОК – на 22,5%, ЗПО зростає на 30,0%. Тіотриазолін при попередньому в/м введенні вірогідно не відновлював показники кардіо- та центральної гемодинаміки.

У зв’язку з цим дослідження механізму кардіопротекторного впливу тіотриазоліну на біохімічні і морфологічні показники проводили лише при доксорубіциновій кардіоміопатії.

Аналіз отриманих даних показав, що при доксорубіциновій кардіоміопатії відбуваються зміни в системі макроергічних фосфатів і нікотинамідних коферментів. Рівень АТФ в


9-09-2015, 00:43