МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я уКРАЇНИ
оДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
фесюнова Галина Степанівна
УДК 615.322-092.9
Основні фармакологічні ефекти кумаринв місного засобу – водного екстракту з трави буркуну
14.03.05 – фармакологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Одеса – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор СОТНІКОВА ОЛЕНА ПЕТРІВНА, Інститут очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П. Філатова АМН України, м. Одеса, завідувач лабораторії фармакології і тканинної терапії
Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор РОЖКОВСЬКИЙ ЯРОСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, Одеський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри фармакогнозії
доктор біологічних наук, професор МАСЛОВА НАТАЛІЯ ФЕДОРІВНА, Державне підприємство „Державний науковий центр лікарських засобів” МОЗ України, м. Харків, завідувач лабораторії ферментних і антиферментних препаратів
Захист відбудеться “19” березня 2008 року об 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 при Одеському державному медичному університеті МОЗ України (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 2).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеського державного медичного університету МОЗ України (65082, м. Одеса, пров. Валіховський, 3).
Автореферат розісланий “18” лютого 2008 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
к.мед.н., доцент В.В. Годован
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ДИСЕРТАЦІЇ
Актуальність теми. Актуальність застосування лікарських рослин незмірно зросла в останні десятиріччя. Висока потреба медицини у відносно нешкідливих препаратах природного походження, що мають специфічну фармакологічну активність, диктує необхідність розробки і впровадження їх у лікувальну практику. Стійкість ряду хронічних хвороб до синтетичних лікарських засобів, а також важкі побічні, у тому числі алергійні реакції на їх застосування, змушують клініцистів все частіше використовувати препарати з рослинної сировини (В.Ф. Корсун та ін., 2003; Т.В.Звягінцева та ін., 2006; І.С. Чекман, 2007).
Збільшується кількість осіб з поєднанною патологією, що потребує одночасного призначення ряду лікарських засобів. Фармакологічна активність лікарських рослин залежить від складу біологічно активних речовин. Перевагу їх становлять мала токсичність і можливість тривалого застосування без істотних побічних явищ. Вони широко використовуються для профілактики і лікування ряду патологічних станів, а також для підвищення терапевтичної ефективності специфічного лікування. Тканинні препарати незамінні при функціональних розладах і начальних формах патології для проведення підтримуючої терапії (Ю.Л. Курако, 2005; О.П. Сотнікова, 2006; А.П. Левицький, 2007).
Найбагатший хімічний склад рослин дозволяє комплексно впливати на весь організм, не порушуючи природного плину фізіологічних процесів, тонко регулюючи патологічні зрушення. Експериментальні дослідження і клінічне застосування лікарських засобів рослинного походження свідчать про велику цінність їх при лікуванні багатьох, особливо хронічних захворювань, коли необхідний тривалий, іноді протягом усього життя прийом лікарських препаратів (І.С. Чекман, 2003; 2007; Н.Ф. Маслова, 2007).
У зв’язку з зазначеним, нашу увагу привернув буркун лікарський - відома лікарська рослина, що має велику кількість БАР та широко використовується в народній медицині. Трава буркуну містить в собі глікозиди, при розщепленні яких звільнюються кумарин, мелілотол, цимарин, мелілотова і кумарова кислоти, а також похідні пурину, холіну, флавоноїди, аскорбінову кислоту, токоферол, каротин, цукри тощо (А.М. Носов, 2005; Н.Н. Сафонов, 2006). Його широко застосовують у вигляді настоїв, відварів як седативний засіб, для лікування застудних захворювань, при алергійних дерматозах та ін. (О.С. Товстуха, 1995; П.А.Кьосев, 2000). Завдяки протизапальним, спазмолітичним властивостям буркун лікарський рекомендують застосовувати при ішемічній хворобі серця – стенокардії, тромбозі коронарних судин і гіпертонії (А.О. Гуков, О.Д. Гукова, 1992; В.Н. Вишнев, 2004). Окремі роботи стосуються вивчення сполук трави буркуну (В.Н. Бубенчикова и др. 1998; В.Н. Бубенчикова, И.Л. Дроздова, 2004), а саме ідентифіковано 18 сполук фенольної природи.
В офіцинальній медицині трава буркуну входить до складу лікарських зборів (детоксифіт, антистрес, кардіофіт), гелів (цикло 3 крем, тигрове око, ревентон). Однак готових лікарських засобів з цієї сировини досі не існує.
Дані літератури про широкий спектр фармакологічних властивостей трави буркуну та наявність вітчизняної сировинної бази з’явились обгрунтуванням для створення нового рослинного препарату, виготовленого за методом академіка В.П. Філатова (1953). Враховуючи, що трава буркуну містить кумариноподібні речовини представляє значний інтерес для лікувальної медицини визначення впливу екстракту буркуну на систему згортання крові, тобто антикоагулянтних властивостей в порівнянні з відомим тканинним препаратом ФіБСом, до складу якого входять синтетичні кумарин і корична кислота.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках НДР АМН України лабораторії фармакології і тканинної терапії Інститута очних хвороб і тканинної терапіі ім. В.П. Філатова (ІОХіТТ) АМН України за темою: “Изучить специфическую фармакологическую активность и механизм действия экстракта донника” (№ державної реєстрації – 0102U002746). Дисертант є співвиконавцем даної НДР.
Мета та задачі дослідження. Мета роботи – з’ясувати основні фармакологічні ефекти водного екстракту буркуну і експериментально обгрунтувати доцільність застосування його у лікувальній медицині та геріатрії.
Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні задачі:
1. Розробити методи ідентифікації екстракту буркуну за вмістом кумаринів.
2. Вивчити гостру і субхронічну токсичність екстракту буркуну і з’ясувати його вплив на ультраструктуру гепатоцитів кролів при тривалому введенні та рівень фармакобіологичної активності на спеціальних біотестах.
3. Дослідити особливості фармакодинаміки та механізм гепатозахисної дії екстракту буркуну.
4. Провести порівняльне вивчення антитоксичних, мембраностабілізуючих та антиоксидантних властивостей екстракту буркуну у кролів різного віку.
5. Визначити антиагрегаційні властивості екстракту буркуну in vitro та вплив на ступінь прояву антикоагулянтної і фібринолітичної дії invivo.
6. Вивчити вплив екстракту буркуну на перебіг експериментальної гіфеми.
Об'єкт дослідження: експериментальна фармакологія фітозасобу– регулятора метаболічних процесів.
Предмет дослідження: основні фармакологічні ефекти кумаринвмісного водного екстракту буркуну в нормі у тварин різного віку та при моделюванні гіфеми, токсичного гепатиту.
Методи дослідження: – фармакологічні, токсикологічні, біохімічні, гематологічні, морфологічні, статистичні.
Наукова новизна отриманих результатів. За допомогою методів хроматографії та спектрофотометрії вперше ідентифіковано та кількісно визначено суму кумаринів, що входять до складу екстракту буркуну. На всіх етапах дослідження встановлено, що за фармакологічними властивостями та біорегулюючою дією екстракт буркуну значно перевищує кумаринвмісний тканинний препарат ФіБС. На фармакологічних тестах для біостимуляторів з природної сировини виявлені антитоксична та антигіпоксична дії. За даними електронно-мікроскопічних досліджень клітин печінки вперше встановлено, що екстракт буркуну підвищує резистентність гепатоцитів шляхом активації білоксинтезуючої та енергоутворюючої функцій.
Вперше встановлено, що екстракт буркуну підвищує детоксикаційну функцію та надає захисну дію тваринам з токсичним ураженням печінки при профілактичному та профілактично-лікувальному застосуванні. Вперше виявлено, що екстракт буркуну надає мембраностабілізуючу дію за рахунок подовження діапазону функціональної стійкості еритроцитів за даними їх осмотичної та перекисної резистентності. Вперше виявлено позитивний біорегулюючий вплив екстракту буркуну на метаболічні процеси старих тварин, що дозволяє віднести його до потенційних геріатричних засобів.
Вперше визначено та експериментально обгрунтовано специфічну фармакологічну активність екстракту буркуну за параметрами впливу на систему гемостазу у кролів. Вперше виявлено високу антиагрегаційну активність екстракту буркуну на крові людини. Встановлено його виразні гіпокоагулянтні властивості за впливом на коагуляційний гемостаз експериментальних тварин. Виявлено, що екстракт буркуну активує фібринолітичну систему, сприяє зниженню фібриногену, чим забезпечує нормалізацію реології та мікроциркуляції крові.
При моделюванні гіфеми у кролів вперше встановлено, що застосування екстракту буркуну підвищує фібринолітичний потенціал слізної рідини, нормалізуючи її коагуляційну активність, що значно скорочує строки розсмоктування крововиливу. При цьому визначено однакову лікувальну ефективність екстракту буркуну незалежно від способу застосування.
Практичне значення отриманих результатів. На підставі експериментальних досліджень обґрунтована доцільність клінічного випробування нового рослинного засобу – екстракту буркуну (Патент України на корисну модель № 3544 „Спосіб одержання водного екстракту буркуну” від 15.11.04 р.), що має специфічні антиагрегаційні, гіпокоагулянтні, фібринолітичні властивості, які є фрагментом матеріалів доклінічного вивчення для подання до Державного фармакологічного центру МОЗ України з метою застосування в офтальмології та геріатрії.
Визначені антиоксидантні і мембраностабілізуючі властивості екстракту буркуну при експериментальному токсичному гепатиті, що дозволить рекомендувати його для комбінованої терапії при зниженні функціональної активності печінки.
Виявлене збільшення детоксикаційної функції печінки та функціональної стійкості еритроцитів у старих тварин надає можливість застосовувати препарат при прискореному старінні, для підвищення резистентності організму до несприятливих впливів зовнішнього середовища.
Отримані дані про механізм дії екстракту буркуну за результатами біологічних методів дослідження впроваджено в практичні заняття кафедри фізіології людини і тварин біологічного факультету ОНУ ім. І.І. Мечнікова.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто були здійснені патентно-інформаційний пошук та аналіз наукової літератури за темою дисертації. Визначена мета і задачі дослідження, методичні підходи, опрацьовані моделі, за якими особисто виконані експериментальні дослідження. Здійснена статистична обробка отриманих результатів і оформлення їх у вигляді таблиць та графиків, аналіз і узагальнення результатів, сформульовано висновки, опубліковані основні матеріали дисертації.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені і знайшли позитивну оцінку на IV українській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології: “Актуальні питання фармакології” (Вінниця, 2004); XII Російському Національному конгресі “Человек и лекарство” (Москва, 2005); IV національному конгресі геронтологів і геріатрів України (Київ, 2005); XI з’їзді офтальмологів України (Одеса, 2006); сімпозіумі “Рослинні поліфеноли та неспецифічна резистентність” (Одеса, 2006); III національному з’їзді фармакологів України “Фармакологія 2006 – крок у майбутнє” (Одеса, 2006); І-ої науково-практичній конференції „Безопасность лекарств: от разработки до медицинского применения” (Київ, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 20 наукових робіт, з яких 9 статей у наукових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 патент України, 10 тез доповідей на наукових форумах різних рівнів.
Структура й обсяг дисертації. Дисертація викладена на 170 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 6 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел із 342 найменувань (284 вітчизняних і країн СНД та 58 іноземних). Робота ілюстрована 30 таблицями і 21 рисунком.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи дослідження. Дослідження проводили в лабораторії фармакології і тканинної терапії (ІОХіТТ) ім. В.П. Філатова АМН України, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 31 від 2006 р.) у повній відповідності з вимогами Комісії з біоетики ІОХіТТ (протокол № 8 від 7.11.2006 р.) та Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Київ, 2001).
Роботу виконано на 159 кролях породи Шиншила масою 1,8– 6,0 кг (різного віку), 120 білих щурах лінії Wistar масою 180–220 г, 94 нелінійних білих мишах масою 20–22 г, 35 жабах, вирощених у розплідниках віваріїв Одеського державного медичного університету та ІОХіТТ. Всі тварини були статевозрілі, обох статей, знаходились в умовах віварію ІОХіТТ на стандартному раціоні за встановленими нормами.
Водний екстракт буркуну для ін'єкцій виготовлено з трави буркуну лікарського в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ за методом академіка В.П. Філатова, технологію запатентовано (Патент України на корисну модель № 3544 „Спосіб одержання водного екстракту буркуну” від 15.11.04 р.).
В якості референтного препарату використовували тканинний препарат ФіБС, який відноситься до фармакотерапевтичної групи біогенних стимуляторів, що регулюють метаболичні процеси (М.Д. Машковский, 2005).
Визначення в екстракті буркуну кумарину і двох оксікумаринів (скополетин, умбеліферон) проводилося після екстракції їх із препарату хлороформом з наступною хроматографією на пластинках Сорбфіл у суміші розчинників циклогексан Р – ацетон Р – 2–пропанол Р (20:4:1). Наявність кумаринів встановлювалася в УФ світлі при довжині хвилі 366 нм після обробки лужним розчином (ДФУ, 2001). Кількісне визначення суми кумаринів і дослідження спектрів поглинання проводилося на спектрофотометрі СФ–46 у кюветі з товщиною шару 1 см при довжинах хвиль 240–360 нм.
Гостру та субхронічну токсичність вивчали на 3-х видах лабораторних тварин (миші, щури, кролі) згідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001). Використовувалися дози з урахуванням максимально припустимих фізичних обсягів введення рідин (К.К. Сидоров, 1973). Для патоморфологічних досліджень тканини міокарда, легень, печінки, нирок були фіксовані в 10 % розчині нейтрального формаліну, піддавалися спиртовій проводці, заливці в парафін. Оглядові препарати фарбувалися гематоксилін-еозином (Г.А. Меркулов, 1969). Ультратонкі зрізи тканини печінки фарбували розчинами уранілацетату і цитрату свинцю. Переглядали і фотографували зразки в електронному мікроскопі ПЭМ–100.
Експериментальні дослідження рівня біологічної активності екстракту буркуну на скринінгових біотестах (дріжджовому, парабіотичному, стрихніновому, антигіпоксичному) виконані відповідно Методичним рекомендаціям ДФЦ України (2001).
Вплив екстракту буркуну і ФіБСу на детоксикуючу функцію печінки оцінювали на моделі гексеналового сну у кролів. Гексенал вводили внутрішньовенно в дозі 35 мг/кг маси у вигляді 5 % водного розчину. Тривалість сну в контрольній групі приймали за 100 %.
Гепатозахисну дію екстракту буркуну і ФіБСу вивчали в умовах токсичного ураження печінки тетрахлорметаном (CCl4 ), який вводили внутрішньошлунково у вигляді 50 % олійного розчину з розрахунку 0,5 мл на 100 г маси тіла протягом двох днів (Ю.И. Губский, 1989).
Для оцінки профілактично-лікувальної дії екстракту буркуну і ФіБСу на хід експериментального токсичного ураження печінки вивчали активність маркерних ферментів цитолізу: аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ) – за Райтман і Френкель у модифікації В.Г. Колб і В.С. Камишніков (1986), кількість загального білка в сироватці крові – біуретовим методом (А.М. Горячковский, 1998). Антиоксидантну дію препаратів визначали за вмістом дієнових кон’югатів (ДК) (В.А. Костюк та ін., 1984) і малонового діальдегіда (МДА) у сироватці крові (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977).
Антитоксичні та мембраностабілізуючі властивості екстракту буркуну вивчали у кролів різного віку, масою від 3,6–6,0 кг, при 30-денному курсовому введенні. Для оцінки антитоксичної функції печінки використовували бромсульфалеїнову пробу за методикою В.В. Меньшикова (1971), осмотичну за М.А. Базарновою (1982) і перекисну резистентність еритроцитів (М. Mino, 1978). Визначали вміст водо- і жиророзчинних антиоксидантів в крові (J. Glavind, 1963) і активність каталази (М.А. Королюк та ін., 1988) в плазмі крові та печінці.
Вивчення антиагрегаційної активності екстракту буркуну і ФіБСу проведено в дослідах in vitro за методом Борна на багатій тромбоцитами плазмі крові людини на агрегометрі THROMLITE – 1006 А (“Биохиммак”, Росія) на базі Фізико-хімічного інституту ім. А.В. Богатського НАН України. Виражаємо щиру вдячність проф. Карасьовій Т.Л. за надання консультативно-методичної допомоги при виконанні досліду. Суть методу полягає в перевірці здатності досліджуваних об'єктів інгібувати АДФ – викликану агрегацію тромбоцитів крові після їхньої попередньої інкубації з плазмою крові людини (G.V. Born, 1962). Об'єктами даної перевірки були 3 серії екстракту буркуну – лабораторні зразки і препарат порівняння біогенний стимулятор ФіБС з урахуванням розведення в кюветі агрегометра в 7 разів. Антиагрегаційна активність наведена у відсотках інгібування (I %) агрегації тромбоцитів у порівнянні з контролем.
Вивчення впливу екстракту буркунуі ФіБСу на коагуляційний гемостаз при курсовому введеннібуло проведено на 51 кролі породи Шиншила, масою 3,0–4,7 кг, розподілених на 9 піддослідних груп: 3 контрольних (по 5 кролів) і 6 піддослідних (по 5–7 кролів). Показники гемостазу у тварин вивчали до початку досліду (вихідний рівень), на 7, 14, 21 дні введення, через 1 і 2 тижні після закінчення курсу. Екстракт буркуну і ФіБС вводили тваринам підшкірно в дозах: 0,3; 1,0і 3,0 мл/кг для кожної піддослідної групи, відповідно. Контрольним тваринам вводився фізіологічний розчин в аналогічних об’ємах. Визначали наступні показники коагулограми: тромбіновий, протромбіновий, активований парціальний тромбопластиновий час і вміст фібриногену оптичним методом на турбідиметрічному гемокоагулометрі фірми "Солар" (Мінськ) з використанням реактивів фірми "НПО Ренам" (Москва) згідно стандартним методикам (З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) з урахуванням методичних рекомендацій до приладу (В.В. Дмитриев, 1997). Хагеман-залежний фібриноліз визначали за Kowalski, Kopec, час лізису еуглобулінового зсідка за Kowarzyk, Buluk(З.С. Баркаган, А.П. Момот, 2001) та показник фібринолітичної активності згідно методичним рекомендаціям (Ю.О. Киселевский и др., 1997).
Вплив екстракту буркуну на перебіг експериментальної гіфеми – крововиливу у передню камеру ока (Г.В. Самсонов та ін., 1985) проводили на кролях породи Шиншила, статевозрілих, масою 3,6–5 кг. Усього використано 15 кролів (30 очей), розподілених нарівно на 3 групи: 1 група –контрольна патологія (без лікування); 2 і 3 групи –модель гіфеми з наступним введенням екстракту підкон’юнктивально і підшкірно, відповідно. Екстракт буркуну вводився через 4 години після створення гіфеми в дозі 0,3 мл/кг протягом 10 днів.
Оцінку коагуляційної і фібринолітичної активності слізної рідини проводили за Е.Г. Сомовим, В.В. Бржеским (1992). Внутрішньоочний тиск вимірювали за допомогою тонометра Маклакова масою 7,5 г у ті ж терміни.
Статистичну обробку даних проводили з використанням методів параметричної і непараметричної статистики за допомогою програми ”MicrosoftExcel для Windows – 2000, Statistica5.5 (С. Гланс, 1999).
Результати досліджень та їх обговорення. Наявність кумарину виявляли шляхом зіставлення на хроматограмах зон випробуваного розчину і свідка – синтетичного кумарину. При цьому кумарин виявляється у вигляді зони, що флуоресцирує зеленувато-жовтим кольором. Наявність оксикумаринів підтверджено зіставленням хроматограм випробуваного розчину з достовірними речовинами-свідками – скополетином і умбеліфероном, що подані таким чином: умбеліферон – зона, що флуоресцирує яскраво-блакитним кольором (у середній частині хроматограми), скополетин – зона, що флуоресцирує блакитним кольором (у нижній частині хроматограми).
Спектри поглинання випробуваних розчинів мають виражений максимум, що однозначно дозволяє проводити кількісне визначення кумаринів при довжині хвилі поглинання кумарину, яка дорівнює 272 нм. На підставі фактичних даних встановлено, що вміст суми кумаринів у екстракті буркуну (у перерахунку на кумарин) складає не менше 0,09 %.
Дані, отримані при вивченні гострої токсичності, дозволяють віднести екстракт буркуну до практично нетоксичних препаратів (LD50 >50 мл/кг) за класифікацією К.К. Сидорова (1973).
Тривале введення на
8-09-2015, 20:02