Обмінні процеси в організмі щурів при отруєнні цезієм і стронцієм та зміні кислотно лужного стану

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

КЛІХ ЛАРИСА ВОЛОДИМИРІВНА

УДК 577.12:543.554.2:546.36/42:636.028

ОБМІННІ ПРОЦЕСИ В ОРГАНІЗМІ ЩУРІВ ПРИ ОТРУЄННІ ЦЕЗІЄМ І СТРОНЦІЄМ ТА ЗМІНІ КИСЛОТНО-ЛУЖНОГО СТАНУ

03.00.04 – біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ – 2008

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Інтенсивністьобмінних процесів у клітинах залежить від багатьох факторів і, в тому числі, від екологічної ситуації, в якій перебуває організм. Відомо, що в цих процесах, які відповідають за енергозабезпечення організму, беруть участь системи, до складу яких входять велика кількість ферментів, їх інтермедіати, нікотинамідні і залізопорфіринові комплекси, флавопротеїди, убіхінони, інші структури, що є складними хімічними сполуками, чутливими до будь-яких зовнішніх змін. Саме тому активність функціонування обмінних процесів залежить від хімічного складу внутрішнього середовища, його кислотно-лужного стану, вмісту відповідних субстратів, активаторів, інгібіторів каталізу тощо.

Солі важких металів за своїми властивостями є хімічно активними речовинами. Токсичність їх визначається здатністю впливати на динамічну хімічну рівновагу в системі живих організмів, що зумовлено утворенням міцних зв’язків із хімічними компонентами клітини, головним чином з біологічними молекулами. Проникаючи в організм тварин і людини, вони діють на клітинні мембрани, впливають на структуру та інтенсивність функціонування внутрішньоклітинних органел і біологічних молекул, спричиняють пошкодження мітохондрій – структур, в яких активно протікають окисно-відновні процеси (Мудрий І.В., Короленко Т.К., 2002; Гудков І.М., Вінничук М.М., 2003). Результатом цього є підвищення проникності мітохондріальної мембрани, що призводить до втрати нікотинамідних коферментів, адже тільки окиснена форма нікотинамідаденіндинуклеотиду може проникати через пошкоджену мембрану, а відновлена - залишається фіксованою всередині мітохондрій
(Ленінджер А., 1985). Це змінює співвідношення окиснених та відновлених форм нікотинамідних коферментів і впливає на стан обмінних процесів, гальмуючи реакції енергозабезпечення в організмі отруєних тварин.

Важкі метали цезій і стронцій у великій кількості потрапляють у навколишнє середовище в зв’язку з інтенсивним антропогенним забрудненням і, особливо, під час техногенних викидів підприємствами атомної, гірничо-видобувної, металургійної, хімічної, машинобудівної, паливно-енергетичної промисловості і комунального господарства. Накопичення цих металів призводить до розвитку ряду біохімічних змін в організмі, а період їх виведення є досить тривалим (Єршов Ю.О., Плетньова Т.В., 1989; Власик Л.І., 2000).

Дослідження механізмів токсичної дії важких металів на різні сторони обміну речовин та перетворення енергії багато років проводяться на кафедрі біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету під керівництвом академіка Д.О. Мельничука. Вони спрямовані на вивчення порушень метаболізму, що виникають під впливом важких металів, з метою їх корекції і створення на цій основі методів лікування, а також орієнтовані на пошук ефективних способів прискореного виведення їх сполук з організму тварин (Мельничук Д.О., 1989; Мельникова Н.М. та ін., 2005).

У сучасній науковій літературі недостатньо вивчені питання впливу цезію та стронцію на стан обмінних процесів в організмі отруєних тварин. Не досліджено вплив цезієвої і стронцієвої інтоксикації на показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну та способи корекції метаболічних порушень шляхом зміни параметрів кислотно-лужного стану організму. Цим зумовлена пріоритетність досліджень стану обмінних процесів в організмі щурів при введенні солей цезію і стронцію та виявлення впливу змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність їх накопичення, а також на пошук способів прискореного виведення цих металів з організму тварин.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною науково-дослідної роботи кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого Національного аграрного університету: «Вивчити біохімічну характеристику тканин організму тварин, токсикованих важкими металами та розробити способи їх елімінації» (номер державної реєстрації 0106U003874) (2006 - 2010 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було дослідити обмінні процеси в тканинах і органах щурів при отруєнні цезієм і стронцієм та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану організму на інтенсивність їх накопичення.

Длядосягнення мети роботи необхідно було вирішити такі завдання:

- розробити біологічні моделі введення щурам цезію і стронцію хлоридів;

- визначити особливості розподілу і накопичення цезію та стронцію в тканинах та органах отруєних щурів;

- з’ясувати вплив солей цезію і стронцію на вміст натрію, калію, магнію, кальцію в тканинах та органах отруєних щурів;

- дослідити стан окисно-відновних систем гліколізу й циклу трикарбонових кислот у печінці щурів, отруєних цезію і стронцію хлоридами;

- провести дослідження показників азотного обміну в крові щурів за умов уведення солей стронцію і цезію;

- дослідити показники кислотно-лужного стану крові в щурів за умов уведення їм солей цезію і стронцію;

- дослідити вплив зміни параметрів кислотно-лужного стану крові на вміст цезію і стронцію в органах щурів за умов уведення їх солей.

Об’єкт дослідження – біохімічні механізми регуляції обмінних процесів в організмі щурів за умов уведення тваринам солей цезію і стронцію та вплив змін параметрів кислотно-лужного стану на інтенсивність накопичення цих важких металів.

Предмет дослідження - показники вуглеводного, азотного, мінерального обміну і кислотно-лужного стану, кров, печінка, нирки, м’язи та кістки білих лабораторних щурів.

Методи дослідження - ферментативні (показники гліколізу та циклу трикарбонових кислот), спектрофотометричні (показники мінерального, азотного, вуглеводного обміну, активність ферментів), потенціометричні (показники кислотно-лужного стану) та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Показані особливості розподілу та накопичення солей стронцію і цезію в серці, нирках, печінці, м’язах та кістках щурів при внутрішньочеревному їх введенні. Вперше встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів спричиняє зміни рівня основних інтермедіатів, які характеризують стан обмінних процесів. Виявлено зниження інтенсивності окисно-відновних процесів у їх організмі, що зумовлює виникнення явища субкомпенсованого метаболічного ацидозу. Введення щурам солей вказаних металів призводить до зниження активності лактатдегідрогенази і амінотрансфераз у печінці та крові. Виявлено, що в умовах in vitro стронцій та цезій знижують активність лактатдегідрогенази, ізоцитратдегідрогенази і малатдегідрогенази. Встановлено, що введення щурам цезію і стронцію хлоридів призводить до зниження в крові вмісту аміаку та глутаміну за одночасної активації процесів сечовиноутворення. Поряд з цим, в організмі таких тварин спостерігається порушення мінерального обміну. Показано, що експериментальні зміни параметрів кислотно-лужного стану крові в бік метаболічного ацидозу сприяють прискоренню перерозподілу та зменшенню накопичення цезію й стронцію в організмі піддослідних щурів.

Наукова новизна одержаних результатів дисертаційної роботи підтверджена чотирма патентами на корисні моделі.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень поглиблюють сучасні уявлення про механізм негативної дії стронцію та цезію на внутрішньоклітинний метаболізм. Встановлено закономірності перерозподілу і накопичення цих важких металів у внутрішніх органах тварин, а також характер змін показників мінерального, вуглеводного, азотного обміну та параметрів кислотно-лужного стану в організмі щурів. Результати досліджень впроваджені в навчальний процес Дніпропетровського державного аграрного університету, Білоцерківського державного аграрного університету, Київського національного університету імені Тараса Шевченка, використовуються в науковій роботі Інституту екогігієни і токсикології
ім. Л.І. Медведя, Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, Інституту медицини праці Академії медичних наук України.

Отримані результати можуть стати фундаментальним підґрунтям для розробки нових ефективних способів профілактики та лікування продуктивних тварин за умов отруєння солями цезію та стронцію.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана автором під керівництвом доктора біологічних наук, академіка НАН України та УААН, професора Д.О. Мельничука. Разом із керівником сформульовано завдання роботи, сплановано напрями досліджень та проаналізовано отримані результати.

Відповідно до поставленої мети та завдань дисертаційної роботи автором проведено аналіз даних наукової літератури, виконано експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних результатів, написано і оформлено дисертаційну роботу.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися на II і III Міжнародних наукових конференціях студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (2006 - 2007 р. р., м. Львів), наукових конференціях професорсько-викладацького складу і аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва НАУ (2006 - 2007 р. р., м. Київ), IX Українському біохімічному з’їзді (2006 р., м. Харків), V Державній науково-практичній конференції «Аграрна наука виробництву» (2006 р., м. Біла Церква), V Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини (2007 р., м. Київ), II Міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (2007 р., м. Харків).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 18 робіт, з них - 6 статей у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України, 12 тез у наукових збірниках конференцій та 4 патенти на корисні моделі.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду наукової літератури, матеріалів і методів досліджень, результатів експериментальних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, 8 додатків та списку використаних джерел, що включає 258 найменувань, з яких 73 латиницею. Робота викладена на 145 сторінках комп’ютерного тексту, ілюстрована 32 таблицями та 10 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Дослідження виконувалив науковій проблемній лабораторії кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого НАУ, в віварії факультету ветеринарної медицини, Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК, а також у відділі регуляції обміну речовин Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.Для цього використали клінічно здорових самців білих лабораторних щурів 3-місячного віку, масою тіла 150 – 200 г, яких утримували в віварії на стандартному раціоні в клітках по 6 голів. Під час експерименту використано 240 тварин.

Отруєння щурів проводили впродовж 14 діб, шляхом щоденного внутрішньочеревного введення цезію та стронцію хлоридів у дозі 1/15 , із розрахунку 0,006 г стронцію хлориду або 0,01 г цезію хлориду на 0,1 кг маси тіла (Філов В.А., 2004). З метою моделювання стану метаболічного ацидозу і алкалозу щурам дослідних груп per os уводили 2%-ний розчин HCl - 4 мг на 0,01 кг маси тіла та NaHCO₃ - 5 мг на 0,01 кг маси тіла (Мельничук Д.О. та ін., 1995).

Піддослідних тварин розділили на 9 груп по 8 особин у кожній. Досліди проводили згідно зі схемою: I - інтактні щури (контроль); II - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид; ІІІ - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням НСl; ІV - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням розчину NaHCO₃ ; V - щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид, після чого впродовж 20 діб вводили розчин НСl; VI - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид; VII - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину НСl; VIII - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину NaHCO₃ ; IX - щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид, після чого впродовж 20 діб - розчин НСl.

Для проведення біохімічних досліджень від щурів відбирали зразки печінки, нирок, серця, кісток, м’язів та крові.

Вміст цезію, стронцію, калію, натрію, магнію і кальцію в органах визначали спектрохімічним методом (Бруцке М.Е., 1982), використовуючи режим абсорбції в повітряно-ацетиленовому полум’ї на атомно-абсорбційному спектрофотометрі ААS–30, фірми «Карл Цейс» (Німеччина). Контролем слугували стандартні зразки розчинів металів, виготовлені в Інституті фізичної хімії НАН України (м. Одеса).

Показники кислотно-лужного стану рН, парціальний тиск вуглекислого газу (р СО₂ ) і кисню (р О₂ ), концентрацію бікарбонатів [НСО₃ ^- ], загальну вуглекислоту (СО₂ заг.) та зсув буферних основ (ЗБО) в крові визначали на мікроаналізаторі Blood Gas Analyzer фірми «Rоdelkis» (Угорщина) за методом Зіггард-Андерсена (1964).

Активність ферментів лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37), ізоцитратдегідрогенази (ІДГ, КФ 1.1.1.41) визначали в цитозольній фракції печінки та in vitro за рівнем поглинання НАД⁺ та НАДН (фірма «Merkck» та «Reanal»), на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм.

Визначення концентрації інтермедіатів гліколізу та ЦТК (ізоцитрату, малату, лактату, пірувату, б-кетоглутарату і оксалоацетату) та глутамату в екстракті печінки проводили з використанням відповідних ферментів ЛДГ (із м’язів свині, «Fluka» (Німеччина)), МДГ (із серця свині, «Sigma» (США)), ІДГ (із печінки великої рогатої худоби, «Sigma» (США)). Оптичну густину дослідної проби вимірювали на спектрофотометрі СФ-46, при
л 340 нм (Комаров Ф.М. та ін., 2002).

Зміну величини співвідношення НАД⁺ /НАДН та НАДФ⁺ /НАДФН у цитозолі та мітохондріях клітин печінки з метою виявлення інтенсивності окисно-відновних процесів в отруєному організмі тварин розраховували за номограмним методом (Мельничук Д.О., 1987).

Рівень аміаку і глутаміну в крові визначали на спектрофотометрі СФ-46, при л 340 нм (Силакова А.І., Корнюшенко Н.П., 1969).

Концентрацію глюкози, сечовини, активність аланінамінотрансферази (АлАТ, КФ 2.6.1.2) і аспартатамінотрансферази (АсАТ, КФ 2.6.1.1) у крові визначали на біохімічному аналізаторі Microlab-200 фірми «AVL» (Німеччина), з використанням реактивів фірми «Human» (Німеччина).

Експерименти проводили відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в наукових цілях.

Результати досліджень обробляли статистично, з використанням комп’ютерної програми MS Excel (Кучеренко М.Є. та ін., 2001).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Результати проведених досліджень свідчать про значне накопичення цезію та стронцію в досліджуваних органах щурів (табл.1).

Таблиця 1. Вміст стронцію і цезію в тканинах та органах отруєних щурів, мг/кг (М ± m, n = 8)

Примітка. Тут і далі * - Р < 0,05, результати вірогідні порівняно зі значеннями в групі інтактних тварин.

Показано, що в м’язах щурів, отруєних цезієм, його вміст зростає в середньому в 37, у печінці – в 228, у серці – в 67, у нирках – у 29,
у кістках – у 38 разів, а вміст стронцію у тварин, отруєних стронцію хлоридом, підвищується в середньому відповідно в 1,7; 1,5; 2; 1,7 і 5,1 рази.

Особливості перерозподілу цезію в організмі тварин визначаються тим, що він є хімічним аналогом калію і, потрапивши в організм, вступає в конкурентні відносини з останнім за включення в біохімічні процеси. Основна маса калію знаходиться в м’язах, що пояснює накопичення солей цезію в м’язовій тканині (Власик Л.І., 2000).

Відомо, що стронцій є природним аналогом кальцію і конкурує з ним за включення в остеобласти кісткової тканини організму отруєних тварин (Засєкін Д.А., 2004).

Встановлено, що надлишок важких металів змінює макроелементний склад внутрішніх органів піддослідних тварин (табл. 2).

Таблиця 2. Вміст натрію і калію у тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)

У м’язах, нирках та кістках щурів, отруєних цезію хлоридом, вміст натрію знижується в середньому відповідно в 1,7; 1,6 та 2,3 рази, а в печінці та серці - підвищується в 1,5 та 1,4 рази. Аналогічні зміни спостерігаються і в перерозподілі калію та магнію (табл. 3). Вміст кальцію знижується в кістках у 2,7 рази та збільшується в м’язах, печінці, серці і нирках відповідно у 2,2; 3,6; 1,4 та 1,3 рази.

Таблиця 3. Вміст магнію та кальцію в тканинах та органах щурів, отруєних цезію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)

Інший розподіл елементів спостерігається в організмі щурів, отруєних стронцієм: у кістках підвищується вміст натрію, калію та магнію в 1,6 рази і знижується - кальцію в 1,7 рази (табл. 4,5).

Таблиця 4. Вміст натрію та калію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)

В інших органах вміст цього елементу підвищується: в м’язах – у 2,0 рази, печінці – в 3,5, серці - в 1,8, нирках – у 1,5 рази. У м’язах вміст калію та магнію знижується відповідно в 1,3 та 1,7 рази, а натрію не змінюється.

Таблиця 5. Вміст магнію та кальцію у тканинах та органах щурів, отруєних стронцію хлоридом, мг/кг (М ± m, n = 8)