МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
СЕЛЕЗНЬОВА Олена Вікторівна
УДК 616.379-008.64-028.77+616.37-018-089.843]-092
Вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету
14.03.04 – патологічна фізіологія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
ЛУГАНСЬК – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України і Інституті невідкладної та відновної хірургії ім. В.К. Гусака АМН України
Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Зінкович Ігор Іванович, Донецький національний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, завідувач Центральної науково-дослідної лабораторії
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Комаревцев Віталій Миколайович, Луганський державний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедрою хірургії та урології;
доктор медичних наук, старший науковий співробітник Нещерет Олександр Павлович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України (м. Київ), провідний науковий співробітник відділу епідеміології ендокринних захворювань
Захист відбудеться 04.04.2008 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.02 при Луганському державному медичному університеті (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Луганського державного медичного університету (91045, м. Луганськ, кв. 50-річчя Оборони Луганська, 1).
Автореферат розісланий 03.03.2008 року.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доцент Шанько В.М.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Поширеність цукрового діабету у світі зростає з кожним роком, причому багато ендокринологів указують на те, що захворюваність на цукровий діабет уже сьогодні носить характер пандемії. Кількість хворих на цукровий діабет подвоюється кожні 10-15 років (Ковальська І.О., 2000). Вважається, що поширеність цукрового діабету становить близько 10 %. В Україні кількість хворих на цукровий діабет становить близько 5 млн осіб (Ефимов А. и др., 2004). Цукровий діабет призводить до зменшення тривалості життя, зниження його якості, високої інвалідизації. Проблеми забезпечення стабільності перебігу цукрового діабету і боротьба з вторинними ускладненнями залишаються актуальними.
Найважливішою ланкою патогенезу цукрового діабету є загибель бета-клітин. Останні дослідження in vitro показують, що бета-клітини мають достатньо високу здатність до регенерації (Dor Y. et al., 2004), але, з іншого боку, in vivo в умовах діабету ці клітини практично не відновлюються (Jonas J.-C. et al., 1999). У світовій літературі описано багато досліджень, спрямованих на пошук засобів, здатних активувати регенерацію бета-клітин (Rooman I. et al., 2002; Pospisilik J.A et al., 2003).
Одним із перспективних методів є трансплантація бета-клітин (Hussain M.A. et al., 2004; Kin T. et al., 2005). Живі бета-клітини забезпечують адекватну регуляцію рівня глюкози у крові відповідно до потреб організму, чого неможливо досягти замісною терапією інсуліном. Перші результати клінічних випробувань трансплантації культур бета-клітин виявилися неоднозначними. З одного боку, її ефективність спочатку є високою, потім, у результаті природного імунологічного відторгнення, трансплантат гине, але тяжкість діабету знижується, тобто трансплантація має і деякий період післядії. Деякі автори (Mickel R. et al, 2005) припускають, що трансплантація культур клітин може активувати регенерацію збережених острівців у підшлунковій залозі реципієнта.
Крім того, відомо, що стовбурові клітини організму мають здатність до специфічної міграції в місця ушкодження тканин, прискорюють проліферацію клітин, сприяють ангіонеогенезу, можують диференціюватися у різні типи клітин як паренхіми, так і строми (Miranda D. et al., 2002). Деякі автори (Goto M. et al., 2004; Wang J. et al., 2004) припускають, що стовбурові клітини можуть брати участь у регенерації острівкових клітин.
Тому було вирішено розширити знання про вплив трансплантації острівкових клітин на регенерацію бета-клітин у реципієнта і ступінь корекції метаболічних і морфологічних порушень в організмі щурів з алоксановим діабетом. Встановлення характеру патофізіологічних змін в організмі після трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин допоможуть довести або спростувати доцільність даних методів лікування.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом комплексної теми “Дослідження імунонейроендокринних порушень при ендокринній недостатності підшлункової залози і її корекція трансплантацією фетальних тканин”, № держреєстрації 0101U007988, шифр МК 02.1.07, що виконувалась на кафедрі мікробіології, вірусології і епідеміології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького. У рамках цієї НДР здобувачка виконала дослідження змін показників вуглеводного й жирового обміну при експериментальному цукровому діабеті після трансплантації культури клітин підшлункової залози.
Мета дослідження: удосконалити знання про вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових гемопоетичних клітин на патогенез експериментального цукрового діабету на підставі вивчення особливостей вуглеводного, жирового обміну і морфологічних змін в ендокринній частині підшлункової залози, вираженості діабетичної мікроангіопатії після трансплантації.
Для досягнення поставленої мети сформульовані наступні завдання дослідження:
Вивчити вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на вуглеводний обмін в умовах експериментального цукрового діабету.
Дослідити морфологічні зміни острівкового апарату підшлункової залози після трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин в умовах експериментального цукрового діабету.
З'ясувати особливості жирового обміну в умовах експериментального цукрового діабету після трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин.
Встановити морфологічні особливості стану дрібних артеріальних судин у щурів в умовах експериментального цукрового діабету після трансплантації культур клітин підшлункової залози й стовбурових клітин.
Об'єкт дослідження: патогенез експериментального алоксанового цукрового діабету, відтвореного на щурах.
Предмет дослідження: вплив трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових клітин на патогенез експериментального цукрового діабету.
Методи дослідження: дослідження проведене комплексно із використанням біохімічних, морфологічних, імуногістохімічних, морфометичних методів, виконано статистичну обробку отриманих даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені закономірності впливу трансплантації культур клітин підшлункової залози і стовбурових гемопоетичних клітин на основні механізми розвитку експериментального цукрового діабету та його ускладнень.
Доведено, що внутрішньочеревна трансплантація культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин і культури ксеногенних клітин підшлункової залози призводить до поліпшення перебігу експериментального алоксанового цукрового діабету. Удосконалені знання щодо розвитку компенсаторних процесів у підшлунковій залозі при експериментальному алоксановому діабеті, встановлена можливість синтезу інсуліну деякими ацинарними і протоковими клітинами підшлункової залози. Вперше одержані відомості про характер і вираженість компенсаторних процесів у підшлунковій залозі, що виникають після виконання трансплантації культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин і культури ксеногенних клітин підшлункової залози. Встановлено, що трансплантація клітинних культур прискорює регенераторні процеси в острівковому апараті підшлункової залози, що відображається у збільшенні питомого об’єму острівкової тканини, збільшенні кількості інсулін-позитивних клітин на одиницю площі, прискорення проліферації острівкових клітин, збільшення кількості і розміру острівців за рахунок збільшення кількості клітин, частки інсулін-позитивних клітин у складі острівців. Вперше встановлено, що трансплантація культури клітин підшлункової залози призводить до прискорення поділу зрілих бета-клітин реципієнта, а трансплантація культури стовбурових клітин призводить до активації проліферації прогеніторних незрілих клітин із наступним їх дозріванням у бета-клітини. Показано, що така перебудова ендокринної частини підшлункової залози призводить до зменшення порушень вуглеводного і ліпідного обмінів та призупинення розвитку мікроангіопатії судин серця.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані можуть бути використані для подальшої розробки трансплантологічних методів лікування цукрового діабету у людей. Нові ланки патогенезу цукрового діабету після трансплантації клітинних культур, встановлені під час здійсненого дослідження, зазначили нові можливості корекції інсулінової недостатності: стимулювання проліферації клітин, що синтезують інсулін, стимулювання проліферації клітин-попередників підшлункової залози та їх подальшої трансформації у бета-клітини. Швидкий позитивний ефект від трансплантації культури клітин підшлункової залози та віддалений, але більш виразний, ефект від трансплантації культури стовбурових клітин надає можливість вибору найбільш раціонального напрямку терапії хворих на цукровий діабет. Відмінність механізмів впливу цих методів на регенерацію острівкових клітин визначає можливість отримання більш виразного ефекту від комбінованого їх застосування.
Встановлені знання про вплив трансплантації клітин ксеногенної культури підшлункової залози та алогенної культури гемопоетичних стовбурових клітин на перебіг експериментального цукрового діабету можуть бути використані при подальших фундаментальних дослідженнях, доопрацюванні методів із метою їх використання в комплексній терапії захворювання у людей. Також ці дані можливо використовувати у процесі навчання студентів медичних ВНЗ на кафедрах патологічної фізіології для більш глибокого розуміння впливу цих методів на патогенез цукрового діабету 1 типу.
Отримані результати впроваджені у навчальний процес кафедр патофізіології Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського, Запорізького державного медичного університету, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, кафедри фізіології Буковинського державного медичного університету, кафедри фармакології Харківського медичного університету.
Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведені наступні види робіт: патентний та інформаційний пошук, виконання експериментальних досліджень, збір матеріалу для подальшого аналізу, морфометричне дослідження стану острівкового апарату підшлункової залози, статистичний аналіз одержаних даних біохімічних, морфологічних і морфометричних методів дослідження, оформлення наукових статей до друку, що відображають основні наукові положення дослідження, написання всіх розділів дисертаційної роботи, представлення результатів дослідження на наукових з’їздах і конференціях.
Сумісно із науковим керівником здійснено вибір теми дисертаційної роботи, постановка мети і завдань дослідження, планування експерименту, інтерпретація одержаних результатів і формулювання висновків.
У роботах, виконаних у співавторстві, реалізовані наукові ідеї здобувачки. Співавторами здійснювалося допомога у виконанні біохімічних, морфологічних і морфометричних методів дослідження, консультація щодо статистичної обробки результатів дослідження та їх інтерпретації. Дисертантом не були використані результати та ідеї співавторів публікацій.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові положення та висновки дисертаційної роботи доповіданні і обговорювані на: науковій конференції “IV читання ім. В.В. Підвисоцького” (м. Одеса, 26-28 травня 2005 р.), II Міжнародній науково-практичній конференції “Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка” (м. Одеса, 8-9 вересня 2005 р.), XVII з’їзді Українського фізіологічного товариства (м. Чернівці, 18-20 травня 2006 р.), науковій конференції “Актуальні питання патофізіології” (мм. Симферополь-Ялта, 5-6 жовтня 2006 р.), IX Українському біохімічному з’їзді (м. Харків, 24-27 жовтня 2006 р.), VII з’їзді асоціації ендокринологів України (м. Київ, 15-18 травня 2007 р.), Науковій конференції “VI читання ім. В.В. Підвисоцького” (м. Одеса, 31 травня – 1 червня 2007 р.).
Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в 13 наукових працях, з них 6 – у фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 1 – стаття у збірнику, 6 – у матеріалах конференцій.
Структура дисертації. Робота викладена на 158 сторінках, з них на 19 сторінках наведено 15 таблиць і 47 рисунків. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків і переліку використаних літературних джерел. Перелік містить 172 джерела, з них 52 – вітчизняної та 120 – іноземної літератури.
Основний зміст
Матеріал і методи дослідження. Експеримент проводили на 85 лабораторних білих щурах (самцях). Середня маса тварин перед початком експерименту становила 235,4±24,5 г. Контрольну групу склали 10 тварин, які утримувалися в тих же умовах, що й тварини експериментальних груп.
Цукровий діабет моделювали на 75 тваринах шляхом внутрішньочеревного введення водного розчину алоксану (Fluka, Німеччина) в дозі 200 мг/кг. Після введення алоксану у 3 (4,0%) тварин розвинувся вкрай тяжкий стан із гіперглікемією вище 30 ммоль/л, тому вони були виведені із експерименту на 3-4 добу. На 30 добу після розвитку в щурів цукрового діабету для подальшого експерименту було відібрано 65 щурів зі станом середньої тяжкості (з рівнем глюкози крові натще від 8 до 16 ммоль/л). З них 3 тварини виведені з експерименту для одержання даних про зміни у структурі підшлункової залози перед трансплантацією (контроль моделі).
Тварини були поділені на 4 експериментальні групи. Тваринам 1 групи (14 щурів) трансплантацію клітинних культур не проводили, на 30 добу експерименту їм внутрішньочеревно вводили 1 мл стерильного фізіологічного розчину натрію хлориду. Тваринам 2 групи (24 щура) на 30 добу вводили внутрішньочеревно культуру острівкових клітин підшлункової залози (ПШЗ). На 38 добу 12 тваринам цієї групи повторно ввели аналогічну культуру (група 2Б), тварини, що залишися, склали групу 2А. Тваринам 3 групи (12 щурів) на 30 добу експерименту вводили внутрішньочеревно зруйновану шляхом дворазового циклу заморожування-розморожування культуру острівкових клітин ПШЗ. Тваринам 4 групи (12 щурів) на 30 добу однократно внутрішньочеревно вводили культуру гемопоетичних стовбурових клітин. Для отримання проміжних морфометричних результатів на 45 добу експерименту по 3 тварини з кожної групи виводили з експерименту. Всі інші тварини були виведені з експерименту на 70 добу. В усі терміни тварин виводили з експерименту шляхом декапітації під загальною анестезією кетаміном в дозі 75 мг/кг.
Культури алогенних гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) і ксеногенних кролячих ендокринних клітин підшлункової залози були отримані у лабораторії клітинного та тканинного культивування Інституту невідкладної і відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України. Приготування культури алогенних ГСК включало наступні етапи: вилучення ембріонів 14 днів гестації, вилучення ембріональної печінки, механічну дезагрегацію та фільтрацію через декілька фільтрів, висів на культуральні флакони з поживним ростовим середовищем DMEM/F12, культивування протягом 1 години при 37°С, відбір надосадової рідини із клітинами, що не прикріпилися до флакону. Гемопоетична популяція клітин залишалася у надосадній рідині через свої неадгезивні (субстрат-незалежні) властивості. Отриману суспензію розділяли на порції об’ємом 0,3 мл і терміново вводили щурам-реципієнтам. Для детекції ГСК використовували імунотипування клітин на проточному цитометрі FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Було встановлено, що клітинна суспензія ембріональної печінки містила 61 млн. клітин, які містили ядро, на 1 мл, серед яких CD90(Thy-1.1)+/CD3–/CD45RC– клітини склали 0,27% (за свідченням багатьох авторів (Castagnola C. et al., 1982, McCarthy K.F. et al., 1987), саме ця популяція клітин щурів містить велику кількість ГСК), тобто у одній трансплантаційній порції містилося біля 50 тис. ГСК.
Культуру острівкових клітин кроля отримували за наступною схемою (Шумаков В.И. и др., 1995): видалення у кроля віком 2 тижні підшлункової залози, пунктирування протоку із введенням 0,25% розчину трипсину, механічна дезагрегація і глибока трипсинізація, центрифугування. Після видалення супернатанту у клітинний осад додавали поживне середовище Ігла. Життєздатність клітин перевіряли у камері Горяєва із одномоментним підрахунком їх кількості. Концентрація життєздатних клітин в 1 мл суспензії становила 2,5 млн/мл. Далі первинну суспензію розводили та розділяли на порції по 0,3 мл, кожна з котрих містила 50 тис. клітин. Культуру терміново вводили щурам-реципієнтам. Встановлено, що культура острівкових клітин ПШЗ містила 73,7% бета-клітин, 20,6% – альфа-клітин і 5,7% інших клітин.
Визначення рівня глюкози, ТГ, ЗХ і холестерину ЛПНЩ і ЛПВЩ проводили на напівавтоматичних біохімічних аналізаторах. Індекс атерогенності (ІА) розраховували за стандартною формулою: ІА=(ЗХ–ЛПВЩ)/ЛПВЩ. Вміст інсуліну визначали за допомогою імуноферментного аналізу.
Морфологічне і морфометричне дослідження проведене у лабораторії фундаментальних досліджень Інституту невідкладної і відновної хірургії ім.. В.К.Гусака АМН України. З видалених тканин виготовляли забарвлені гематоксиліном та еозином препарати за стандартною методикою (Меркулов Г.А.., 1969). При імуногістохімічному забарвленні використовували первинні антитіла проти інсуліну (поліклональні, мурчакові), глюкагону (поліклональні, кролячі) та ядерного антигену клітин, що проліферують, – PCNA (моноклональні, клон PC10). Первинні антитіла виявляли за допомогою системи візуалізації “LSAB 2 for rat” (всі реактиви фірми DAKO, Данія).
Для підтвердження припущень щодо механізму впливу клітинних культур на острівковий апарат ПШЗ було виконано потрійне імунофлюоресцентне фарбування тканини залози у 3 тварин кожної групи на 45 та 70 добу експерименту.. Для цього використовували антитіла проти інсуліну, PCNA, а також DAPI в якості ядерного барвника. Первинні антитіла виявляли за допомогою вторинних із флуоресцентними мітками таким чином, щоб ядра клітин, що діляться, забарвлювались у червоний колір, інших клітин – у синій, цитоплазма інсулін-позитивних клітин – у зелений колір.
Дослідження препаратів здійснювали на мікроскопі Axiostar (Carl Zeiss, Німеччина). Мікрофотографування проводили на дослідницькому мікроскопі Olympus AX70 (Японія) цифровою камерою Olympus DP50, морфометрічне дослідження – з використанням програми AnalySIS Pro 3.2 (фірма SoftImaging, Німеччина).
Морфометричне дослідження стану острівкового апарату проводили на забарвлених імуногістохімічно препаратах. Підраховували загальну кількість клітин в острівцях, кількість клітин, в ядрах яких експресується PCNA-антиген (клітини, що знаходяться у процесі поділу), кількість клітин, що містять у цитоплазмі інсулін і глюкагон, виміряли розмір кожного острівця. Для вивчення мікроангіопатії було обрано серце. Під час морфометричного дослідження судин серця вимірювали мінімальний внутрішній і зовнішній діаметри певної судини і вираховували радіус, абсолютну та відносну товщину стінки судини. Оскільки діаметр вивчених судин коливався від 10 до 150 мкм, то вони було розподілені на три групи: а) дрібні артерії з діаметром від 75 до 150 мкм; б) артеріоли з діаметром від 25 до 75 мкм; в) прекапілярні артеріоли з діаметром менше 25 мкм.
Статистичну обробку проводили за допомогою програми статистичного аналізу Primer of Biostatistics 4.03 (США) і Statistica 6.0 (StatSoft, США). Розбіжності між групами розраховувалися із використанням непараметричного критерію Крускала-Уолліса. Зв'язок між параметрами оцінювали за допомогою коефіцієнту рангової кореляції Спірмена.
Результати досліджень. Після введення алоксану через 30 діб у тварин розвивалася типова картина інсулін-залежного цукрового діабету із підвищенням середнього рівня глюкози до 12,52±2,02 ммоль/л (табл.1), що в 2,9 рази вище в порівнянні з контролем (p<0,05). Ці зміни обумовлені масовою загибеллю клітин, що синтезують інсулін. Так, при морфометричному аналізі ПШЗ було встановлено, що середня кількість острівців на 10 мм2
зрізу зменшилась у 5,3 разів (p<0,05) (табл.2,3), а ті, що залишилися, стали маленькими, в 1,7 рази менше, ніж у нормі (p<0,05), що призвело до зменшення питомого об’єму острівкової тканини в 9,3 разів (p<0,05). У складі острівців, що збереглися, було лише 34,0±2,7% бета-клітин. Це знайшло
8-09-2015, 21:55