Надалі (на 45 і 70 доби експерименту) спостерігали ознаки регенерації острівкової тканини. І хоча кількість острівців на одиницю площі не змінилася, у самих острівцях залишався високим процент клітин, що проліферують (табл.2,3), він був менший ніж на 30 добу, але значно вищий (в 4,3 рази на 45 добу і в 3,1 рази на 70 добу), ніж в інтактних тварин. Але прискорення проліферації клітин не відобразилося на питомому об’ємі острівкової тканини. Істотні зміни відбувалися у клітинному складі острівців. Якщо на 30 добу відносна кількість бета-клітин дорівнювала 34,0±2,7%, то на 45 добу вона вже була на рівні 45,9±3,8% (p<0,05), а на 70 добу – 60,2±3,9% (p<0,05). Тобто в острівцях відбувалося зменшення відсотку альфа-клітин, місце яких займали бета-клітини. Це призвело до зростання середньої кількості ІСК на одиницю площі залози в 1,3 рази (p<0,05) на 45 добу і в 1,9 рази (p<0,05) на 70 добу. Майже у стільки ж разів підвищився і рівень інсуліну в крові на 70 добу – в 2,0 рази. Результатом цього стало зменшення гіперглікемії на 45 добу у 1,1 рази (p<0,001) у порівнянні з 30 добою, та у 1,3 рази (p<0,001) на 70 добу, але цей рівень був набагато більше рівня глюкози у інтактних тварин – в 2,2 рази (p<0,001). При дослідженні показників жирового обміну встановлено достовірне збільшення рівня ТГ (в 2,7 рази, p<0,001), ЗХ (в 1,6 рази, p<0,001) і холестерину ЛПНЩ (в 1,9 рази, p<0,001), зниження рівня ЛПВЩ (в 1,6 рази, p<0,01). ІА був вище в 4,1 разів (p<0,001) ніж в інтактних тварин. Ступінь дисліпідемії практично не змінився, достовірної різниці між відповідними показниками не було. Тривала гіперглікемія і дисліпідемія призвели до прогресування мікроангіопатії: спостерігали різке потовщення стінки артерій усіх калібрів, стінки артеріол і дрібних артерій гіалінізовані. Збільшення абсолютної і відносної товщини стінки судин різного калібру склало від 1,9 до 2,3 рази у порівнянні із інтактними щурами (для всіх судин p<0,001). При порівнянні даних на 30 і 70 добу наявною є значна прогресія мікроангіопатії – відносна товщина судин достовірно зросла у 1,3-1,4 рази (p<0,01). Таким чином, незважаючи на деяке покращання показників вуглеводного обміну, наявною була прогресія мікроангіопатії.
Таблиця 1
Показники обміну вуглеводів у тварин різних експериментальних груп на 70 добу експерименту
 Група тварин |
Глюкоза, ммоль/л | Інсулін, мкг/л |
| Контрольна (інтактні тварини) | 4,31±0,48 | 1,03±0,25 |
| Тварини на 30 добу експерименту | 12,94±1,47 | 0,02±0,01 |
| 1 група | 9,68±1,23 | 0,04±0,02 |
| 2А група | 6,65±0,61## | 0,24±0,08## |
| 2Б група | 6,14±1,11## | 0,43±0,09## |
| 3 група | 7,68±1,78# | 0,14±0,05## |
| 4 група | 5,82±0,80## | 0,63±0,14## |
Примітки: 1. Відмінності всіх показників у всіх експериментальних групах із відповідними показниками інтактних тварин достовірні при p<0,001, із показниками тварин, яких вивели з експерименту на 30 добу при p<0,05.
2.Вірогідність відмінностей показників із 1 групою тварин: # – p<0,05, ## – p<0,001.
Таблиця 2
Провідні морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 45 добу експерименту
| Показник | Інтактні тварини (n=10) |
На 30 добу експери-менту (n=3) | На 45 добу експерименту | ||||
| 1 група (n=3) | 2А група (n=3) | 2Б група (n=3) | 3 група (n=3) | 4 група (n=3) | |||
| Клітини, що проліферують, % | 1,04±0,14 | 6,20±2,07† | 4,44±0,62† | 16,73±3,67† , § ,* | 21,79±2,19† , § ,* | 15,42±1,09† , § ,* | 44,13±4,85† , § ,* |
| Питомий об’єм острівкової тканини, % | 0,93±0,10 | 0,10±0,01† | 0,10±0,01† | 0,18±0,03† , § ,* | 0,22±0,33† , § ,* | 0,14±0,02† , § ,* | 0,31±0,04† , § ,* |
| Середня кількість острівців на 10 мм2 | 11,70±1,62 | 2,21±0,37† | 1,99±0,14† | 4,00±0,51† , § ,* | 4,14±0,32† , § ,* | 3,70±0,16† , § ,* | 4,11±0,23† , § ,* |
| Середня кількість ІСК на 1 мм2 | 69,03±8,50 | 3,37±0,10† | 4,82±1,56† | 7,03±1,08† , § | 8,48±0,52† , § ,* | 5,89±0,23† , § | 11,02±1,77† , § ,* |
| Середня площа острівця, мкм2 | 8110,6±1056,6 | 4803,1±652,1† | 5554,6±604,6† | 5992,6±953,4† | 7435,6±614,8§ ,* | 4271,8±337,9† ,* | 6178,0±482,3† , § |
| Інсулін-позитивні клітини, % | 77,5±2,1 | 34,0±2,7† | 45,9±3,8† , § | 32,4±5,5† ,* | 34,1±2,5† ,* | 40,4±2,7† , § | 22,1±2,6† , § ,* |
| Глюкагон-позитивні клітини, % | 21,9±2,1 | 58,6±1,2† | 49,7±2,8† , § | 60,1±4,5† ,* | 52,1±5,0† , § | 51,3±0,9† , § | 31,5±1,1† , § ,* |
| Інсулін- і глюкагон-негативні клітини, % | 0,54±0,20 | 7,35±1,56† | 7,09±1,01† | 7,38±1,21† | 13,66±2,67† , § ,* | 8,22±3,30† | 46,09±3,32† , § ,* |
| Відношення інсулін+ до глюкагон+ клітин | 3,57±0,39 | 0,58±0,06† | 0,93±0,13† , § | 0,55±0,13† ,* | 0,66±0,11† ,* | 0,79±0,05† , § ,* | 0,70±0,07† , § ,* |
| Середня кількість кластерів інсулін-позитивних ацинарних клітин на 10 мм2 | - | 2,96±0,59 | 3,15±0,58 | 3,07±0,47 | 3,54±0,23 | 3,65±0,45 | 3,41±0,28 |
| Середня кількість клітин в кластері | - | 4,42±0,51 | 4,68±0,40 | 4,25±0,53 | 4,15±0,59 | 4,23±0,34 | 4,34±0,70 |
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із групою інтактних тварин: † – p<0,05. 2. Вірогідність відмінностей із групою тварин, які були виведені із експерименту на 30 добу: § – p<0,05. 3. Вірогідність відмінностей із 1 групою: * – p<0,05.
Таблиця 3
Провідні морфометричні показники підшлункової залози у щурів різних груп на 70 добу експерименту
 Показник |
На 70 добу експерименту | ||||
| 1 група (n=9) | 2А група (n=8) | 2Б група (n=9) | 3 група (n=8) | 4 група (n=9) | |
| Клітини, що проліферують, % | 3,20±0,41†††,§ | 8,64±1,37†††,*** | 11,47±2,26†††,***,§ | 7,12±1,28†††,*** | 17,48±3,80†††,***,§ |
| Питомий об’єм острівкової тканини, % | 0,11±0,02††† | 0,28±0,05†††,***,§ | 0,36±0,03†††,***,§ | 0,17±0,03†††,***,§ | 0,55±0,10†††,***,§ |
| Середня кількість острівців на 10 мм2 | 1,96±0,42††† | 4,30±0,56†††,***,§ | 3,93±0,67†††,***,§ | 3,82±0,93†††,***,§ | 4,41±1,13†††,*** |
| Середня кількість ІСК на 1 мм2 | 6,41±0,66†††,§ | 11,06±2,55†††,***,§ | 26,02±2,29†††,***,§ | 7,50±1,25†††,*,§ | 39,90±7,79†††,***,§ |
| Середня площа острівця, мкм2 | 6066,4±1342,4†† | 6288,7±1567,8† | 9310,7±1257,8† , ***,§ | 4681,9±790,9†††,* | 13890,3±5305,8†††,*** |
| Інсулін-позитивні клітини, % | 60,2±3,9†††,§ | 46,1±7,8†††,***,§ | 71,7±2,4†††,***,§ | 51,5±6,1†††,**,§ | 77,6±1,7***,§ |
| Глюкагон-позитивні клітини, % | 33,1±3,4†††,§ | 53,4±7,8†††,*** | 22,3±3,5***,§ | 39,8±6,1†††,*,§ | 19,5±2,2†,***,§ |
| Інсулін- і глюкагон-негативні клітини, % | 6,75±2,52†††,§ | 0,45±0,12***,§ | 6,04±1,54††† | 8,67±2,55†††,§ | 2,93±1,17†††,***,§ |
| Відношення інсулін+ до глюкагон+ клітин | 1,85±0,32†††,§ | 0,90±0,32†††,***,§ | 3,30±0,60***,§ | 1,34±0,37†††,**,§ | 4,03±0,54†,***,§ |
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із групою інтактних тварин: † – p<0,05, †† – p<0,01, ††† – p<0,001. 2. Вірогідність відмінностей із групою тварин, які були виведені із експерименту на 30 добу: § – p<0,05. 3. Вірогідність відмінностей із 1 групою: * – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001.
Таблиця 4
Основні показники ліпідного обміну у щурів різних груп
 Показник |
Інтактні щури (n=10) | На 30 добу експерименту (n=3) | На 70 добу експерименту | ||||
| 1 група (n=9) | 2А група (n=8) |
2Б група (n=9) |
3 група (n=8) |
4 група (n=9) |
|||
| ТГ, ммоль/л | 0,47±0,07 | 1,23±0,10† | 1,27±0,20††† | 0,68±0,15††,§,*** | 0,65±0,13††,§,*** | 0,87±0,22†††,§,** | 0,54±0,09§,*** |
| ЗХ, ммоль/л | 1,03±0,12 | 1,69±0,04† | 1,69±0,16††† | 1,35±0,16†††,§,*** | 1,32±0,14††,§,*** | 1,50±0,29†† | 1,10±0,13§,*** |
| ЛПВЩ, ммоль/л | 0,46±0,07 | 0,26±0,05† | 0,29±0,08†† | 0,37±0,11 | 0,41±0,10§ ,* | 0,33±0,06†† | 0,42±0,07§ ,** |
| ЛПНЩ, ммоль/л | 0,37±0,06 | 0,77±0,05† | 0,72±0,08††† | 0,64±0,17†† | 0,57±0,10†††,§ ,** | 0,71±0,21†† | 0,44±0,08†,§ ,*** |
| ІА | 1,27±0,18 | 5,69±1,36† | 5,25±1,49††† | 2,96±1,15†††,§ ,** | 2,34±0,59†††,§ ,*** | 3,67±0,98†††,§ | 1,62±0,21††,§ ,*** |
Примітки: 1. Вірогідність відмінностей із інтактними тваринами: † – p<0,05, †† – p<0,01, ††† – p<0,001. 2. Вірогідність відмінностей із групою тварин, які були виведені із експерименту на 30 добу: § – p<0,05. 3. Вірогідність відмінностей із 1 групою: * – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001.
Таблиця 5
Середня абсолютна товщина стінки судин у тварин різних груп на 70 добу експерименту
 Групи |
Дрібні артерії (діаметр більше 75 мкм) | Артеріоли (діаметр від 25 до 74 мкм) | Прекапілярні артеріоли (діаметр менше 25 мкм) |
| Інтактні щури | 15,29±2,25 | 9,05±2,83 | 3,27±0,98 |
| Тварини перед трансплантацією (30 доба) | 19,81±2,07*** | 14,47±3,07*** | 4,58±1,24* |
| Група 1 | 28,86±4,05*** ,††† | 17,05±5,45*** | 7,66±0,77*** ,† |
| Група 2А | 26,44±3,75*** ,††† , ## | 13,95±3,64***, # | 5,77±1,98*** |
| Група 2Б | 22,32±3,40*** ,†† , ### | 13,50±4,04***, ## | 4,76±1,66**, # |
| Група 3 | 26,15±3,72*** ,††† , ### | 15,18±4,09*** | 6,02±1,54*** |
| Група 4 | 19,03±2,68***, ### | 12,21±3,17***, †,### | 4,76±0,95***, ## |
Примітки: 1. * – вірогідність відмінностей від групи інтактних щурів: * – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001. 2. † – вірогідність відмінностей від групи тварин перед трансплантацією (30 доба експерименту): † – p<0,05, †† – p<0,01, ††† – p<0,001. 3. # – вірогідність відмінностей від 1 групи: # – p<0,05, ## – p<0,01, ### – p<0,001.
Таблиця 6
Середня відносна товщина стінки судин у тварин різних груп на 70 добу експерименту
| Групи |
Дрібні артерії (діаметр більше 75 мкм) | Артеріоли (діаметр від 25 до 74 мкм) | Прекапілярні артеріоли (діаметр менше 25 мкм) |
| Інтактні щури | 27,37±4,57 | 38,03±4,72 | 36,85±5,64 |
| Тварини перед трансплантацією (30 доба) | 37,38±5,77*** | 51,46±3,29*** | 49,33±5,85** |
| Група 1 | 51,19±7,27*** ,††† | 68,67±6,99*** ,††† | 68,46±2,05*** ,†† |
| Група 2А | 44,45±6,08*** ,††† , ### | 59,54±7,47*** ,††† , ### | 59,63±9,55*** ,†† |
| Група 2Б | 41,87±5,42*** ,†† , ### | 55,65±10,42***, †,### | 50,74±14,27***, ## |
| Група 3 | 47,21±5,93*** ,††† , ## | 62,51±7,89*** ,††† , ### | 58,66±7,57*** ,†† , # |
| Група 4 | 34,96±4,63***, ### | 51,05±9,01***, ### | 48,68±2,70***, ### |
Примітки: 1. * – вірогідність відмінностей від групи інтактних щурів: * – p<0,05, ** – p<0,01, *** – p<0,001. 2. † – вірогідність відмінностей від групи тварин перед трансплантацією (30 доба експерименту): † – p<0,05, †† – p<0,01, ††† – p<0,001. 3. # – вірогідність відмінностей від 1 групи: # – p<0,05, ## – p<0,01, ### – p<0,001.
Після одноразового введення культури острівкових клітин ПШЗ (група 2А) відмічали значне прискорення регенерації острівкової тканини. По-перше, підвищилась середня кількість острівців на одиницю площі: на 45 добу – в 2,0 рази (p<0,05), на 70 добу – 2,2 рази (p<0,001) у порівнянні із тваринами 1 групи. Основою цих змін було прискорення проліферації клітин в острівцях в 3,8 рази (p<0,05) на 45 добу і в 2,7 разів (p<0,001) на 70 добу. Але середній розмір острівців збільшився недостовірно, їхній розмір варіював від дрібних до середніх (до 7800 мкм2 ). Тобто, поява нових острівців малого розміру нівелює значне збільшення острівців, що вижили після введення алоксану. Прискорення проліферації клітин призвело до збільшення питомого об’єму острівкової тканини в 1,8 (p<0,05) і 2,5 рази (p<0,001) відповідно на 45 і 70 доби. По-друге, середня кількість ІСК збільшилася в 1,5 (p<0,05) на 45 добу і в 1,7 рази (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами 1 групи. Але аналіз відносного складу острівців виявив недовершеність їх складу. Питома частка інсулін-позитивних клітин в острівці була вкрай низька – лише 32,4±5,5% на 45 добу та 46,1±7,8% на 70 добу, тобто вона була меншою в 1,4 рази на 45 добу (p<0,05) і в 1,3 рази (p<0,001) на 70 добу експерименту ніж у тварин 1 групи. Питома частка глюкагон-позитивних клітин була високою. Прискорення регенерації острівкової тканини відобразилося у підвищенні рівня інсуліну крові і зменшенні гіперглікемії. Через добу після введення культури спостерігали різке падіння рівня глюкози в 1,5 рази (p<0,001), що є проявом функціонування трансплантату, потім до 39 доби спостерігали деяке підвищення рівня глюкози через загибель трансплантованих клітин, а після 39 – його зниження за рахунок синтезу інсуліну бета-клітинами підшлункової залози реципієнта; на 70 добу експерименту рівень глюкози був в 1,5 рази (p<0,001) нижче, ніж у тварин без трансплантації, а рівень інсуліну – в 6 разів вище (p<0,001). Значне підвищення рівня інсуліну призвело і до поліпшення показників жирового обміну. Відзначено достовірне зниження рівня ТГ (в 1,9 рази, p<0,001), ЗХ (в 1,3 рази, p<0,001) і ІА (в 1,8 рази, p<0,01), недостовірне (p>0,05) зниження рівня холестерину ЛПНЩ і підвищення рівня холестерину ЛПВЩ в 1,1 рази у порівнянні із тваринами 1 групи. Зниження рівня гиперглікемії і зменшення дисліпідемії відобразилися в уповільненні розвитку мікроангіопатії. У порівнянні з 1 групою спостерігалося зменшення абсолютної товщини стінок прекапілярних артеріол в 1,3 рази (p>0,05), артеріол були в 1,2 рази (p<0,05), дрібних артерій – в 1,1 рази (p<0,001); відносної товщини – в 1,1 рази (p>0,05), в 1,2 рази (p<0,001), в 1,2 рази (p<0,001), відповідно.
Одержані дані свідчать про те, що однократна трансплантація культури клітин підшлункової залози призводить до значного прискорення проліферації клітин в острівцях, що існували до трансплантації, і появи нових острівців, що у підсумку призводять до збільшення питомого об’єму острівкової тканини і кількості ІСК. Але склад острівкових клітин не є довершеним через малий процент бета-клітин. Відчутне прискорення синтезу інсуліну веде до зниження гіперглікемії і дисліпідемії, до гальмування розвитку мікроангіопатії, але жоден із вивчених показників не відповідає показникам інтактних щурів.
Після дворазової трансплантації культури острівкових клітин ПШЗ (група 2Б) спостерігали як збільшення кількості острівців на одиницю площі в 2,1 рази (p<0,05) на 45 добу і в 2,0 рази (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами без трансплантації, так і різке збільшення їхнього середнього розміру. Так, середній розмір острівців на 45 добу був в 1,3 рази (p<0,05), на 70 добу – в 1,5 рази (p<0,001) більше, ніж у тварин, яким трансплантацію не виконували. Зустрічалися як дрібні острівці, так і великі, на 70 добу експерименту деякі з них досягали площі 20000 мкм2 і містили більше 200 клітин. Вказані зміни призвели до значного росту питомого об’єму острівкової тканини – в 2,2 рази (p<0,05) на 45 добу і в 3,2 рази (p<0,001) на 70 добу, що було лише в 2,6 рази менше (p<0,001), ніж в інтактних тварин. Основою цих змін було прискорення проліферації клітин в острівцях – на 45 добу в 4,9 разів (p<0,05), на 70 добу – в 3,6 рази (p<0,001) у порівнянні з тваринами без лікування. Відносний склад клітин в острівці зазнає значних змін з 45 до 70 доби експерименту. На 45 добу середня кількість бета-клітин була в 1,3 рази (p<0,05) нижче ніж у тварин без трансплантації, але до 70 доби відбувалося різке збільшення частки бета-клітин до 71,7±2,4%, що в 1,3 рази (p<0,001) більше, ніж у тварин без лікування, і лише в 1,1 рази менше (p<0,001), ніж у інтактних тварин. Результатом цих змін було значне підвищення ІСК у залозі. Збільшення кількості ІСК на одиницю площі на 45 добу в 1,8 рази (p<0,05) та в 4,1 рази (p<0,001) на 70 добу відобразилося у рості рівня інсуліну на 70 добу у 11 разів (p<0,001) у порівнянні із тваринами 1 групи, а рівень глюкози впав в 1,6 рази (p<0,001). Значне поліпшення вуглеводного обміну привело і до поліпшення жирового обміну. При порівнянні із тваринами 1 групи встановлені достовірно менші рівні ТГ (в 2,0 рази, p<0,001), ЗХ (в 1,3 рази, p<0,001), холестерину ЛПНЩ (в 1,3 рази, p<0,01) і ІА (в 2,2 рази, p<0,001). Рівень холестерину ЛПВЩ був вищим в 1,4 рази (p<0,05) ніж у тварин 1 групи та не мав достовірних відмінностей від рівня інтактних тварин. Зменшення гіперглікемії і дисліпідемії призвело до відчутного гальмування розвитку діабетичної мікроангіопатії. Встановлено, що середня товщина стінки прекапілярних артеріол була в 1,6 рази менше (p<0,05), ніж у тварин без трансплантації, а відносна товщина стінки – в 1,3 рази менше (p<0,01). Середня і відносна товщина стінки артеріол були в 1,3 (p<0,01) і 1,2 рази (p<0,001) менше, середня й відносна товщина стінки дрібних артерій – в 1,3 і 1,2 рази (p<0,001) менше у порівнянні із тваринами 1 групи.
Отримані дані показують, що при дворазовому введенні культури клітин ПШЗ спостерігається виразне прискорення проліферації клітин, хоча кількість острівців залишається такою самою, як і після однократного введення, проте розміри деяких острівців набагато збільшуються. Тому питомий об'єм острівкової тканини і кількість ІСК стають значно більшими. Відсоток бета-клітини в острівці також зростає. Регенерація клітин у ПШЗ призводить до різкого зростання синтезу інсуліну, і, відповідно, зниженню рівня гіперглікемії, виразності дисліпідемії і різкому гальмуванню розвитку мікроангіопатії. Збільшення кількості бета-клітин відбувається, скоріше за все, за рахунок прискорення ділення диференційованих клітин, тобто за рахунок прискорення відновлення клітин за механізмом, подібним до фізіологічної регенерації. Підтвердженням цього припущення є результати потрійного імунофлуоресцентного забарвлення: на 45 і на 70 доби експерименту у тварин 2Б групи наявною є проліферація інсулін-позитивних клітин.
За результатами дослідження встановлено, що навіть введення зруйнованої шляхом двократного циклу замороження-розмороження культури острівкових клітин ПШЗ (3 група тварин) викликає невелике, однак статистично достовірне, збільшення проліферації клітин у ПШЗ (в 2,2 рази (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із 1 групою), зростання питомого об’єму острівкової тканини (в 1,6 рази, p<0,001) і кількості ІСК на одиницю площі залози (в 1,2 рази, p<0,05) за рахунок появи дрібних острівців, що призвело до зменшення середньої площі острівців в 1,3 рази (p<0,05) при далекому від оптимального складі острівкових клітин – на 70 добу питомий об'єм бета-клітин зменшився в 1,2 рази (p<0,01) у порівнянні із тваринами 1 групи. Ці зміни призводять до зменшення рівня глюкози в 1,3 рази (p<0,05) і підвищення рівня інсуліну в 3,5 рази (p<0,001) у порівнянні із тваринами без трансплантації. Також зменшилися вираженість дисліпідемії та уповільнився розвиток діабетичної мікроангіопатії.
При введенні культури гемопоетичних стовбурових клітин (4 група) спостерігалося різке збільшення проліферації клітин в ендокринній частині залози в 9,9 разів (p<0,05) на 45 добу і в 5,5 разів (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами 1 групи. Кількість острівців на одиницю площі на 45 і 70 добу збільшується у 2,1 (p<0,05) і 2,3 (p<0,001) рази у порівнянні із тваринами 1 групи, але статистично не відрізняється від інших груп. Така висока проліферативна активність у поєднанні з неогенезом острівців призвела до збільшення питомого об’єму острівкової тканини в 3,1 рази (p<0,05) на 45 добу і в 5,0 разів (p<0,001) на 70 добу у порівнянні із тваринами 1 групи. Також зросла й середня площа острівця: на 45 добу вона була в 1,1 рази (p<0,05) більше, на 70 добу – в 2,3 рази (p<0,001) більше у порівнянні з 1 групою, при цьому зустрічалися гігантські острівці із площею до 37000
8-09-2015, 21:55