Київський національний університет імені Тараса Шевченка
Мазур Оксана Євгенівна
УДК: 617- 089.843:611-013:612.015.1.331]-074
Активність ферментів енергетичного обміну ембріональних трансплантатів
03.00.04-біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Äèñåðòàö³ºþ º ðóêîïèñ.
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.
Науковий керівник:
доктор медичних наук, профессор Скляров Олександр Якович,
Львівський національний медичний університет
імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біологічної хімії.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук, профессор Великий Микола Миколайович,
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України,
провідний науковий співробітник відділу біохімії коферментів;
доктор біологічних наук, старший науковий співробітник
Хижняк Світлана Володимирівна,
Київський національний університет імені Тараса Шевченка,
біологічний факультет, провідний науковий співробітник
лабораторії фізико-хімічної біології.
Захист відбудеться 20.05.2008 р. о 13-30 год.
на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.
З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: м. Київ, вул. Володимирська 58.
Автореферат розісланий 17.04.2008р.
Вчений секретар Т.Р. Андрійчук
спеціалізованої вченої ради.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Ембріональним тканинам властиві характерні морфологічні та біохімічні особливості. Вони складаються, в основному, з бластних та стовбурових клітин, яким притаманні низька антигенність та високий проліферативний і енергетичний потенціал [Грищенко В.І. та ін., 2004].
Cаме ці властивості зумовили широке використання ембріональних тканин і клітин у експериментальній та клінічній медицині для трансплантації з метою стимуляції регенерації, оскільки на основі трансплантованих тканин створюють модель для регенераційних процесів [Азолов В. В и др., 1989].
Регенераторні процеси не лише забезпечують відновлення дефекту тканин при їх пошкодженні, але також є структурною основою відновлення клітинних та тканинних функцій [TiboniG. M. etal., 1999]. У зв’язку з цим інтенсивність і характер регенераційних процесів суттєво впливають на резистентність організму. Одним із визначальних шляхів впливу на регенераційні процеси є модифікація енергетичного обміну як в тканині, так і на рівні організму [BackstromS. etal.,1996, LeBrasS., 1998], враховуючи його значення для регулювання проліферативної активності.
Широке застосування трансплантації ембріональних тканин і клітин у медицині обумовило дослідження ряду питань, які пов’язані з визначенням їх впливу на перебіг різноманітних захворювань та вивчення протікання метаболічних процесів (зокрема енергообміну) у трансплантатах.
Таким чином, вивчення метаболізму ембріональних тканин та клітин має подвійну мету – з однієї сторони це виявлення біохімічних особливостей енергетичного обміну ембріональних тканин і клітин, з іншої - визначення метаболічних взаємовідносин ембріональних трансплантатів і тканин організму реціпієнта, що може бути використане у практичній медицині.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисетаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт кафедри факультетської хірургії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького у рамках теми “Вивчити ступінь операційного ризику в адомінальній хірургії з метою попередження ускладнень” № д/р ВН. 21. 00. 000189.
Мета та завдання дослідження.
Метою роботи було дослідити активність ферментів енергетичного обміну ембріональної очеревини, шкіри та остеобластів до та після алотрансплантації зрілому реціпієнту.
У зв'язку з цим поставлено такі завдання:
1. Визначити активність ферментів гліколізу, циклу трикарбонових кислот, пентозофосфатного шляху ембріональної очеревини та шкіри.
2. Визначити активність ферментів лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, сукцинатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази ембріональних остеобластів.
3. Провести гісто-морфологічні дослідження вільно пересаджених зрілому реціпієнту алогенних трансплантатів ембріональної очеревини та шкіри.
4. Дослідити активність ферментів енергетичного обміну (сукцинатдегідрогенази, лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази) та вміст лактату й пірувату в ембріональних трансплантатах очеревини та шкіри після алотрансплантації зрілому реціпієнту.
5. Дослідити активність ферментів енергетичного обміну ембріональних остеобластів після алотрансплантації зрілому реціпієнту.
6. Провести порівняльний аналіз біохімічних показників енергетичного обміну в трансплантованій ембріональній очеревині, шкірі та остеобластах з використанням факторного та кластерного аналізу.
Об’єкт дослідження: процеси енергетичного обміну ембріональної очеревини, шкіри та остеобластів до та після алотрансплантації зрілому реціпієнту.
Предмет дослідження: активність ферментів енергетичного обміну; вміст лактату та пірувату ембріональної очеревини, шкіри та остеобластів до та після трансплантації зрілому реціпієнту.
Методи дослідження: біохімічні, спектрофотометричні, гістологічні, математичної варіаційної статистики та факторний і кластерний аналізи.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено порівняння біохімічних шляхів енергозабезпечення ембріональної очеревини, шкіри та ембріональних остеобластів. Встановлено, що особливості метаболізму ембріональних тканин визначаються морфологічною структурою тканини й ступінню її диференціації. Показано, що після алотрансплантації зрілому реціпієнту метаболічні зміни в пересаджених тканинах визначаються рівнем розвитку тканини, вихідною функціональною активністю та структурними перетвореннями, що відбуваються в трансплантатах. Встановлено, що різні ембріональні тканини характеризуються відмінністю перебігу метаболічних процесів після вільної алотрансплантації зрілому реціпієнту, а їх адаптивні можливості до метаболічних умов дорослого організму залежать від морфологічної зрілості. Вперше, на основі отриманих результатів, показано, що перебіг енергетичних процесів у вільно трансплантованих ембріональних тканинах є відмінним від такого у тканинах зрілого реціпієнта.
Практичне значення отриманих результатів. Вперше обгрунтовано застосування вільної алотрансплантації ембріональних тканин для активної безпосередньої корекції процесів тканинної репарації з метою підвищення надійності та ефективності загоєння ран. Результати роботи підтверджені патентом на винахід України (Патент 6755, Україна, МКВ 5 А61В 17/00, А61К 35/00, 1994 р.) „Спосіб перитонізації кукси дванадцятипалої кишки”.
Результати досліджень впроваджені в навчальний процес на кафедрах нормальної фізіології, біохімії, факультетської хірургії Львівського національного медичного університету, а також у клінічну практику хірургічних відділів Львівської обласної клінічної лікарні.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто виконано забір та попередню обробку клітинного та тканинного експериментального матеріалу, проведено біохімічні дослідження, обробку та теоретичне обгрунтування результів досліджень. Клініко-морфологічне обстеження оперованих тварин проведено разом з доцентом кафедри гістології та ембріології к. мед. н. Вишемірською Л. Д.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на XVIII з’їзді Європейського товариства штучних органів (Відень, 1991), IV конгресі світової федерації українських лікарських товариств (Харків, 1992), на І національному конгресі анатомів, гістологів, ембріологів та топографоанатомів України (Івано-Франківськ, 1994), VII Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), VII з’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Тернопіль, 2003), International conference “Neuro - humoral and cellular regulatory mechanism of digestion processes” (Львів, 2003).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 робіт, з них 4 статті у фахових виданнях, визначених ВАК України, 10 тез доповідей у збірках матеріалів міжнародних та вітчизняних конференцій, симпозіумів, конгресів та 1 патент на винахід України.
Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, додатків, списку використаних літературних джерел, що містить 165 найменувань. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 149 сторінках машинописного тексту, ілюстровані 49 таблицями, 30 рисунками та 15 фотографіями.
Матеріали та методи досліджень
Робота виконана на 110 статевозрілих самцях кролів, яких було розділено на 5 груп. Першій групі тварин (28 кролів) виконано аллотрансплантацію ембріональної очеревини, другій (28 кролів) — алотрансплантацію ембріональної шкіри. Кожній тварині пересаджено 3 препарати ембріональної тканини на незашиту рану тонкої кишки за загальноприйнятою методикою.Третю групу (контроль) склали тварини які утримувалися за стандартних умов віварію (12 кролів), четверту — тварини, яким виконано ентеротомію за прийнятою методикою з однорядним швом рани кишки (12 кролів). Тваринам 5-ї групи (30 кролів) пересаджено ембріональні остеобласти в кісткову рану.
Тварини виводились з експерименту шляхом пропускання електричного струму через спинний та довгастий мозок. Експерименти проводились у відповідності до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних та інших наукових цілях.
Тварин оперували під комбінованим дом’язовим наркозом. Виконували повздовжню ентеротомію (1,5-2,0 см). Рану кишки або залишали відкритою, або зашивали вузловими серозно-м’язовими однорядними повздовжніми швами [Мазур Ю. І., 1996].
Донорами ембріональних тканин і клітин слугували ембріони самки кроля кінця другого – початку третього тижня вагітності. З черевної стінки ембріона сепарували препарати шкіри та м’язово-очеревинного пласту, котрий у подальшому умовно називали очеревиною. Препарати діаметром 1,5-2,0 см фіксували швами поверх рани тонкої кишки.
Для виділення остеобластів використовували росткові зони трубчатих кісток кінцівок трьохтижневого ембріона кроля. Під мікроскопом МБИ-6 при чотирьохразовому збільшенні в умовах темного поля локалізували росткові зони кісток і висікали їх [Созанский О.А. и др., 1998]. Одержаний матеріал гомогенізували в гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при 200 об/хв у трьох вертикальних ходах. Для одномоментної трансплантації використовували 200-300 мг клітинної суспензії [Дибас Б.В., 1996].
У подальшому досліджували препарати отримані з ембріональних тканин (очеревина, шкіра) та клітин (остеобласти) до та після алотрансплантації, а також препарати отримані з тонкої кишки реціпієта.
Виділення мітохондріальної та цитоплазматичної фракції здійснювали за методикою диференційного центрифугування [JohnsonD., LardyH.,1967].
Активність лактатдегідрогенази (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), сукцинатдегідрогенази (СДГ, КФ 1.3.99) визначали методом [Eщенко Н.Д., 1982], малатдегідрогенази (МДГ, КФ 1.1.1.37) – згідно [Ещенко Н.Д., Вольский Г.Г., 1982], глюкозо - 6 – фосфатдегідрогенази (Гл -6- ФДГ, КФ 1.1.1.49) – згідно [Путилин Ф.Е., Зоидзе С.Д., 1982], визначення активності кислої фосфатази (КФ, КФ 3.1.3.2) проводили з використанням стандартних наборів реактивів „LACHEMA” (Чехія).
Визначення кількості піровиноградної кислоти в тканинах здійснювали за методом [Czok R., Lamprecht W., 1970]. Вміст молочної кислоти в тканинах визначали згідно з [Hohorst H., 1970].
Гістологічні препарати забарвлювали гематоксилін-еозином за загальноприйнятою методикою [Ромейс В., 1953] й вивчали під світловим мікроскопом.
Статистичну обробку результатів досліджень проводили згідно зі загальноприйнятими методами варійційної статистики за допомогою пакету прикладних програм STATGRAFICS, а також з використанням факторного та кластерного аналізу [ХарманГ., 1972, Лакин Г.Ф., 1990].
Результати досліджень та їх обговорення
Морфологічна характеристика вільно алотрансплантованих ембріональних тканин. Внаслідок трансплантації ембріональних тканин в організмі реціпієнта виникає реакція на трансплантат, однак вона маловиражена й перебігає дуже повільно. Імунна реакція на трансплантацію ембріональних тканин не має характерних ознак реакції відторгнення трансплантата, інтенсивність її не залежить від виду пересадженої тканини, морфологічними проявами її є лімфоїдна інфільтрація пересадженої тканини з повнокрів’ям судин.
Після трансплантації ембріональна очеревина зтретьої доби набуває сполучнотканинної будови. У трансплантаті протягом двох тижнів спостерігається значне зменшення кількості лімфоїдних елементів та повнокрів’я. Наприкінці 3-го місяця трансплантат має вигляд ледь помітної смужки й побудований зі сполучної та прошарку жирової тканини, частково з’єднаної зі стінкою кишки.
У випадку трансплантації ембріональної шкіри трансплантат з ранніх термінів спостереження має будову, що в цілому відповідає будові шкіри – зроговілий епітелій, волосяні фолікули. Сполучнотканинна основа пересадженої шкіри побудована з молодої грануляційної тканини. Характерними є крововиливи, лімфоїдна інфільтрація.
Протягом усього терміну дослідження після операції спостерігаються послідовні ознаки очищення сполучної тканини трансплантата, багатої на клітини фібробластичного ряду, від лейкоцитарної та еритроцитарної інфільтрації, перетворення зачатків і сформованих волосяних фолікулів у дрібні рогові кісти. Через 6 місяців після операції трансплантат має вигляд тонкого прошарку повнокровної сполучної тканини або повністю заміщується жировою тканиною.
Морфо-функціональні особливості ембріональних трансплантатів зберігаються обмежений проміжок часу, а відтак пересаджені тканини поступово заміщуються сполучною чи жировою тканиною.
Характеристика процесів енергозабезпечення ембріональних тканин і клітин. Встановлено, що гліколіз найбільш інтенсивно протікає в ембріональній очеревині. Серед досліджуваних ембріональних об’єктів для ембріональної очеревини характерна висока активність ЛДГ (рис. 1) і значний вміст пірувату та лактату.
Активність ферментів циклу трикарбонових кислот (ЦТК) є найвищою в ембріональних остеобластах. Показники активності цитоплазматичної малатдегідрогенази (МДГ (ц)) (42,74±3,28 мкмоль НАДН/хв · мг білка) та мітохондріальної малатдегідрогенази (МДГ(м)) (38,93 ± 5,64 мкмоль НАДН/хв · мг білка) перевищують показники активності цих ферментів, які складають відповідно 30,7 ± 2,1 та 40,67 ± 2,74 мкмоль НАДН/хв · мг білка у досліджуваних препаратах ембріональної очеревини; відповідно 24,13 ± 2,22 та 23,65 ± 1,85 мкмоль НАДН/хв · мг білка у препаратах ембріональної шкіри.
Для ембріональної шкіри характерна висока (порівняно з іншими ембріональними об’єктами) активність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Гл-6-фДГ).
Для ембріональної очеревини, на відміну від ембріональної шкіри, притаманні вищі показники активності ферментів, що може характеризувати процеси як гліколізу, так і ЦТК при незначній активності глюкозо-6-фосфатдегідрогенази - регуляторного ферменту пентозофосфатного шляху. Оскільки ембріональна очеревина - мало диференційована тканина, то, імовірно, високі потенційні можливості реалізуються в подальшій диференціації тканини. Підвищення активності ферментів гліколізу та ЦТК в ембріональних остеобластах може бути пояснена значною енергоємністю пластичних процесів, що протікають в ембріональній кістці (розвиток і ріст кісткової тканини потребують великих енергетичних витрат).
Особливості енергозабезпечення ембріональних тканин після трансплантації . Протікання метаболічних процесів у препаратах тонкої кишки після ентеротомії в ранньому післяопераційному періоді супроводжується значним підвищенням активності ферментів ЦТК – на 3-ю добу активність МДГ(ц) зростає в середньому в 8,5 раза, МДГ(м) - у 3 рази та сукцинатдегідрогенази (СДГ) майже у в 2 рази (рис. 3, 4).
Одночасно, майже в 4 рази зменшується кількість пірувату та падає рівень лактату. Активність лактатдегідрогенази достовірно зростає, і становить 28,98 ± 1,44 мкмоль НАДН/хв. мг білка (р≤0,05). При цьому активність Гл-6-фДГ – ферменту окислювальної стадії пентозофосфатного шляху значно знижується впродовж 7-и днів після ентеротомії.
На 7-у добу після операції, за умов розвитку адаптаційно-компенсаторних реакцій спрямованих на поступове відновлення метаболізму клітини, рівень показників, що характеризують активність МДГ, повертається до вихідних величин. Водночас активність СДГ, ЛДГ та Гл- 6- фДГ - на 14-ту добу після операції перевищує контрольні значення.
При дослідженні показників енергообміну ембріональних шкіри, очеревини та остеобластів після алотрансплантації зрілому реціпієнту встановлено, що на третю добу після трансплантації ембріональної очеревини в пересадженій тканині знижується активність ЛДГ (у середньому на 33%), зменшується вміст метаболітів гліколізу (пірувату, лактату в тканині та крові), що може свідчити про інгібування процесів анаеробного гліколізу. Активність МДГ(м) знижується (у середньому на 49%) відносно вихідних показників ембріональної тканини, та відносно контрольних показників тонкої кишки (у середньому на 23%), активність МДГ(ц) зменшується відносно вихідної активності інтактної ембріональної тканини (у середньому на 46%), а активність СДГ достовірно зростає.
У перші три доби в умовах раннього післяопераційного періоду, за вираженої тканинної ішемії, активуються біосинтетичні процеси – спостерігається зростання (відносно вихідної активності інтактної ембріональної тканини), у середньому майже у 2 рази активності Гл- 6- ФДГ.
Через тиждень після алотрансплантації рівень досліджуваних показників енергообміну пересадженої тканини відповідає показникам притаманним для інтактної ембріональної очеревини.
Таким чином, протягом 7-ми діб, незважаючи на явища тканинної ішемії, які мали місце в ранньому післяопераційному періоді, відновилася її вихідна функціональна активність.
На третю добу після алотрансплантаціі ембріональної шкіри зменшується активність ферментів ЦТК, водночас зменшується, порівняно з інтактною ембріональною тканиною, (у середньому на 20%) активність ЛДГ, рівень пірувату залишається без змін, що характеризує стан тканинної ішемії.
Через тиждень після трансплантації ембріональної шкіри спостерігається подібна (як і для ембріональної очеревини) динаміка в змінах активності ферментів ЦТК; одночасно зростає рівень пірувату та лактату в крові. Проте, зміни у величинах досліджуваних показників менш виражені в порівнянні з ембріональною очеревиною.
У пізніші терміни спостереження зміни показників гліколізу, циклу трикарбонових кислот, пентозофосфатного шляху характеризуються подібністю: зростання на 7-му, з наступним зменшенням на 14-ту добу.
Через місяць після трансплантації ембріональних тканин, характерно наступне: кількість пірувату й лактату в тканині стабілізується й утримується на одному рівні, хоча показники дещо нижчі від контрольних показників тонкої кишки. У той же час активність ЛДГ змінюється – незначно зростає на 30-ту добу, падає на 60-ту й знову зростає на 90-ту добу спостереження (рис. 8). Регенераційні процеси, як і більшість метаболічних процесів у біологічних системах, мають фазовий характер.
Одночасно спостерігається ініціювання циклу трикарбонових кислот, активність ферментів якого зростає.
Встановлена динаміка змін досліджуваних показників характеризує особливості метаболізму, які виникають у зв'язку з морфологічною трансформацією пересаджених тканин, і, мабуть, втратою ними характерних для ембріональних тканин як структурних, так і метаболічних особливостей.
Особливості метаболічних процесів вільно алотрансплантованих ембріональних остеобластів. При вільній алотрансплантації ембріональних остеобластів пересаджені клітини опиняються в ситуації зумовленій ізольованістю трансплантата від оточуючих тканин, оскільки реваскуляризація неокістки здійснюється кістковою тканиною реціпієнта. Відсутність повноцінного судинного зв’язку з оточуючою тканиною визначає, по-перше, певну незалежність метаболічних процесів, по-друге, тканинну ішемію трансплантованих клітин.
У перші дні після трансплантації, спостерігається відносна стабільність активності ЛДГ (22,35 ± 6,01 мкмоль НАДН/хв · мг білка) порівняно з вихідним рівнем (26,14 ± 1,15 мкмоль НАДН/хв · мг білка).
Водночас, у ранньому післяопераційному періоді, спостерігається значне зменшення активності ферментів циклу трикарбонових кислот: МДГ (ц) у середньому більш аніж у 2 рази, МДГ (м) майже у 2 рази, сукцинатдегідрогенази — у 1,6 раза.
На сьому добу післяопераційного періоду в середньому в 2,5 раза зростає активність МДГ (ц), хоча й не досягає величин вихідних показників, і, що особливо важливо, СДГ (в середньому на 20%). Відомо, що активність СДГ зростає в екстремальних умовах, коли є необхідним продукування великої кількості енергії за короткий час. Завдяки зростанню активності ферментів циклу Кребса покращується енергозабезпечення репараційних процесів.
На 14-ту добу після алотрансплантації активність усіх досліджуваних ферментів порівняно з вихідними контрольними показниками значно зменшується: ЛДГ — у середньому 2,6 раза, МДГ(ц) — у 2,8 раза, МДГ(м) — у 5 разів, СДГ — у 3 рази, що може бути пояснене зменшенням енергетичних та пластичних потреб у зв’язку з відповідною морфологічною перебудовою трансплантованих остеобластів.
Активність Гл-6-ФДГ на третій день післяопераційного періоду зберігається практично на рівні вихідного показника,
8-09-2015, 21:47