НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ імені О.В.ПАЛЛАДІНА
Хмель Тетяна Олексіївна
УДК 577.115.3: 616-006.6
ВПЛИВ N-СТЕАРОЇЛЕТАНОЛАМІНУ НА ЛІПІДНИЙ СКЛАД ЗЛОЯКІСНИХ ТА УМОВНО НОРМАЛЬНИХ КЛІТИН
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.
Науковий керівник ─ доктор біологічних наук, професор,
член-кор. НАН та АМН України
Гула Надія Максимівна ,
завідувач відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії
ім.О.В.Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
Дмитренко Микола Петрович,
завідувач відділу регуляції обміну речовин Інституту
біохімії О.В.Палладіна НАН України;
доктор медичних наук
Абраменко Ірина Вікторівна,
Головний науковий співробітник лабораторії
молекулярної біології відділу клінічної радіології
Науковий центр радіаційної медицини АМН України.
Захист відбудеться „ 2 ” червня 2008 року о 14 годині на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім.О.В.Палладіна НАН Україниза адресою: 01601, Київ-30, вул.Леонтовича,9.
З дисертацією можна буде ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН Україниза адресою: Київ, вул.Леонтовича,9.
Автореферат розіслано: „ 24” квітня 2008 року.
Вчений секретар
спеціалізованої ради
кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми . До числа регуляторних систем, що приймають участь в контролюванні канцерогенезу, належить „ендоканабіноїдна система”, до складу якої входить група біологічно активних ліпідів – N-ацилетаноламінів (NAE) [HeatherB. etal., 2005]. Численні дослідження щодо з’ясування біологічної активності NAE демонструють широкий спектр їх біологічних ефектів та вказують на значну регуляторну роль цих сполук. Вже в ранніх роботах було показано, що антизапальна дія яєчного жовтку пов’язана з наявністю в ньому N-пальмітоїлетаноламіну (NPE) [KuehlF.A.etal., 1957]. Пізніше стало відомо, що N-арахідоноїлетаноламін (АЕА, анандамід) гальмує рухливість сперматозоїдів [Schuel H. etal., 1994], підвищує рівень апоптозу [Contassot E.etal., 2004; Patsos H.A. etal., 2005]. Показано, що NPE пригнічує процеси вільнорадикального окислення ліпідів гіпоксичних тканин [GulayaN.M.etal., 1998], а також виявляє синергічну дію в індукції апоптозу анандамідом [De Petrocellis L.etal., 2002]. Відомо, що N-олеоїлетаноламін запобігає впливу оксидативного стресу на сперматозоїди [Ambrosini A. etal., 2006], а N-стеароїлетаноламін (NSE) відіграє протекторну роль за умов постішемічної реперфузії міокарда [Фролькіс В.В. та ін., 2000] та сприяє збільшенню секреторної активності надниркової залози [Жуков О.Д. та ін., 2000]. Ймовірно, що біохімічні функції різних NAE відрізняються або ж залежать від певних умов реалізації ефекта NAE. У відділі біохімії ліпідів
Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАНУ під керівництвом професора Н.М. Гулої в клітинах нейробластоми C1300 N18 вперше ідентифікували наявність NAE, а також було показано, що NAE з насиченими ланцюжками, і зокрема N-стеароїлетаноламін, здатні пригнічувати пухлинний ріст карциноми Льюїс і гальмувати розвиток метастазів в легенях хворих мишей [GulayaN.M. etal., 1993, Гулая Н.М. и др., 1993]. Сьогодні вже чітко встановилося уявлення про те, що NAE здатні впливати на процеси розвитку пухлини: виявляють антипроліферативний ефект [DePetrocellisL. etal., 1998], інгібують адгезію і міграцію ракових клітин [Grimaldi C. etal., 2006]. Механізми, за якими реалізуються ефекти NAE і досі з’ясовуються. Більшість наукових праць присвячена ненасиченим представникам цього класу, дія яких реалізується зв’язуванням з рецепторами. Не дивлячись на великий фактичний матеріал, на сьогодні залишається невідомим, яку ж роль відіграють NАЕ з насиченими вуглецевими ланцюжками у функціонуванні організму за умов розвитку в ньому пухлини. Відомо, що малігнізація нормальної клітини супроводжується глибокими порушеннями в структурі клітинних мембран. Адгезивні взаємодії та локомоторні властивості неопластичних клітин, умови транспорту речовин, активність ферментів та процеси ангіогенезу у значній мірі залежать від ліпідних компонентів мембран. Тому постало актуальне питання щодо впливу NSE на ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних тканин в організмі пухлиноносія, вивчення якого поширить наші уявлення про механізми дії NSE.
Зв ’ язок роботи із науковими програмами, планами, темами. Дисертація відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України в рамках наукової тематики 2.2.10 №15 за проблемою „Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування” (I кв. 2002 р. – IV кв. 2006 р. науковий керівник – академік С.В.Комісаренко), держ. рег. № 0102U006218 „Вміст вільних амінокислот, в тому числі інтермедіатів орнітинового циклу як показник інтенсивності злоякісного росту при карциномі Льюїс”, за проблемою „Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій” (I кв. 2007 р. – IV кв. 2011 р. науковий керівник – академік С.В.Комісаренко), держ. рег. № 0107V007187 „Вплив N-ацилетаноламінів на ріст, проліферацію, апоптоз та включення мітки в ДНК трансформованих клітин”, а також в рамках наукового напряму „Біологічно активні речовини для здоров’я людини” програми „Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини”, держ. рег. № 0107V007191 „Застосування біологічно активного ліпіду, N-стеароїлетаноламіну як засобу для підвищення ефективності та зниження побічної дії протипухлинних препаратів”, (I кв. 2007 р. – IV кв. 2009 р. науковий керівник – чл.-кор. НАН України Н.М. Гула), затверджених Президією НАН України.
Мета та задачі дослідження. Вивчити вплив NSE на розвиток неопластичних клітин invivo та invitro і дослідити ліпідний склад злоякісних та умовно нормальних клітин за канцерогенезу для з’ясування можливих шляхів реалізації біологічних ефектів NSE. Для досягнення мети були поставлені такі задачі:
1) Вивчити ефект NSE на розвиток трансформованих клітин in vivo та in vitro ; 2) Вивчити вплив NSE на ліпідний склад і рівень пероксигенації в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині, що межує з метастазами, у мишей з карциномою Льюїс; 3) Дослідити стан NO-сигнальної системи за умов розвитку пухлини та за дії NSE у мишей пухлиноносіїв; 4) Дослідити ефект NSEin vitro на пухлинну тканину надниркових залоз людини; 5) З’ясувати можливість застосування NSE в комбінації з цитостатичними препаратами в хіміотерапії онкозахворювань.
Об’єкти дослідження – біохімічні показники і процеси в тканинах пухлин та пухлиноносіїв.
Предмет дослідження – вплив NSE на розвиток злоякісних клітин in vivo та in vitro .
Методи дослідження: методи експериментальної онкології, культивування клітин, спектрофотометричний, методи ліпідного аналізу (тонкошарова та газорідинна хроматографія), електрофорез.
Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що пероральне введення NSE на різних стадіях розвитку пухлини гальмує ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей.
Вперше встановлено, що NSEвиявляє різноспрямовану дію на злоякісні та умовно нормальні тканини в організмі пухлиноносія. Введення NSE призводить до зменшення активності каталази в метастазах у мишей з карциномою Льюїс, що порушує антиоксидантний захист пухлини і робить її більш вразливою до дії захисних реакцій організму. В той же час в умовно нормальній тканині легенів NSEпідвищує активність каталази і гальмує накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів, що сприяє нормалізації окисних процесів в легенях.
Також встановлено здатність NSE коригувати ліпідний склад умовно нормальної тканини легенів в бік нормалізації вмісту фосфоліпідів і вільного холестеролу. Одночасно NSE змінює ліпідну організацію злоякісних клітин: спостерігається підвищення рівня вільного холестеролу та зростає відсоткове співвідношення поліненасичених жирних кислот ω-6 / ω-3 рядів в сумарних фосфоліпідах. Встановлено здатність NSEзменшувати вміст сумарних поліамінів, відомих активаторів проліферації
Показано, що в сумісній антипухлинній терапії з Цисплатином NSE знижує рівень сечовини, що вказує на послаблення токсичної дії Цисплатину.
Отже, вперше встановлено, що NSE змінює обмін речовин в пухлині та умовно нормальних тканинах, в результаті чого в організмі розвивається “послаблена” пухлина, більш вразлива до дії цитотоксичних факторів. В той же час NSE виступає як протектор тканини, де розвивається неоплазма, і покращує загальний стан пухлиноносія.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть бути використані для подальшого з’ясування механізмів дії NSEі для розробки нових лікувальних препаратів в комплексі лікувальних заходів онкологічних захворювань.
Особистий внесок здобувача. У відділі біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України під керівництвом чл.-кор. НАН та АМН України, професора Гулої Н.М. автором розроблено і відтворено експериментальні умови, за якими NSE виявляє гальмуючу дію на ріст та метастазування карциноми Льюїс у мишей. Проведено визначення вмісту вільного холестеролу та сфінгозину в метастазах та умовно нормальній легеневій тканині, аналіз фосфоліпідного спектру та складу жирних кислот сумарних фосфоліпідів досліджуваних тканин. Досліджено рівень перекисного окислення ліпідів за показниками каталазної активності та рівня продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реагуючі продукти). Дослідження стану NO-сигнальної системи за умов розвитку пухлини та за дії NSE проведені разом із м.н.с. відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України Косяковою Г.В. та описані в спільній публікації. Дослідження впливу NSE на інтенсивність фрагментації ДНК в тканинах надниркових залоз людини проводили за участі м.н.с. Левчук Н.І. (Інститут ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України). Дослідження росту клітин лінії L1210 за дії NSE вивчали у відділі регуляції проліферації клітин Інституту біології клітини НАН України під керівництвом чл.-кор. НАНУ, проф. Стойки Р.С.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи було представлено:
на 5-тій Парнасівській конференції „Molecularmechanismsofcellularsignaling”, 26-29 квітня 2005 р., м. Київ; на IX-му Українському біохімічному з’їзді, 24-27 жовтня 2006 р, м. Харків; на вчених радах Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в Українському біохімічному журналі, 2 тез доповідей на наукових конференціях та заявлено 1 патент на винахід.
Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 126 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає опис методів дослідження і викладення результатів експериментів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури, що містить 201 посилання на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Результати досліджень представлені в 10 таблицях і 25 рисунках.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури наведена інформація про наукові дослідження ендоканабіноїдної системи: описані фізико-хімічні властивості п’яти груп ендоканабіноїдів та відомі рецепторні та позарецепторні механізми реалізації їх біологічних ефектів. Показаний зв’язок ендоканабіноїдів з імунною системою, сигнальною системою NO та наведено дані про роль NAE в канцерогенезі. Описано особливості злоякісних клітин, їх характерні відмінності від нормальних клітин та взаємовідносини пухлини і організму.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження in vivo . Карцинома легень Льюїс (3LL) метастазує гематогенно в легені практично в 100 % випадків. Пухлину перещеплювали внутрішньом’язево в праву задню лапку миші (1,2 млн. клітин карциноми в 0,1 мл середовища 199). Досліди виконували на мишах-самцях лінії С57Bl/6 вагою 20-23г. Тварини утримувались на звичайному раціоні харчування. NSE (однорідна стабільна водна суспензія, що отримана за допомогою ультразвукового диспергування) вводили per os по 1мг на тварину (50 мг/кг маси тіла) та по 5 мг на тварину (250 мг/кг маси тіла) двічі на день, що в перерахунку на добу складає 100 мг/кг маси тіла та 500 мг/кг маси тіла відповідно. Початок введення препарату мишам в групі „Пухлина + NSEз 4 дня” — з 4 дня після перещеплення пухлини, а в групі „Пухлина + NSEз 21 дня” — з 21 дня після перещеплення до закінчення експерименту. Контрольним групам тварин –„Інтактні тварини”, „Пухлина” (миші, яким було перещеплено карциному Льюїс), вводили рівну кількість дистильованої води. Тварин декапітували на 33 добу після перещеплення. Кількість мишей в групах на кінець експерименту — 4-6.
Цисплатин (0,1 % водний розчин) готували безпосередньо перед використанням і вводили групі мишей «Цисплатин» внутрішньоочеревинно по 0,2 мл на мишку 1 раз в три дні, починаючи з 10 дня після перещеплення карциноми Льюїс. За умов досліду тваринам-пухлиноносіям вводили per os NSE по 1мг та по 5 мг на тварину двічі на день з 4 дня після перещеплення пухлини, а з 10 дня починали вводити Цисплатин. Такі тварини були поділені в групи „Цисплатин + NSE 1 мг” і „Цисплатин + NSE 5 мг”. Порівняльний аналіз проводили з групою мишей-пухлиноносіїв „Контроль”.
За динамікою росту пухлин слідкували за допомогою заміру діаметрів стегна тварини в двох взаємно перпендикулярних площинах з періодичністю 1 раз в 7 днів. Гальмування росту пухлини розраховували в порівнянні з розмірами контрольної групи тварин.Для оцінки інтенсивності процесу метастазування використовували такі критерії: середня кількість метастазів на тварину в групі, середній об’єм метастатичного ураження легенів на тварину в групі.
Процеси перекисного окислення ліпідів оцінювали за накопиченням продуктів перекисного окислення, реагуючих з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реагуючих продуктів) [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972].Рівень антиоксидантної активності злоякісних та умовно нормальних клітин визначали за активністю каталази [Королюк М.А. и др.,1988].
Активність аргінази визначали колориметричним методом за реакцією з використанням диметилгліоксиму, в результаті якої утворюється сечовина. Активність аргіназної реакції виражали в нмоль сечовини за 1 хв на мг білка.
Поліаміни визначали за кількістю путресцина за допомогою 2,4 – динітрофторбензола. (ДНФБ )(Serva, ФРГ) [Сяткин С.П., 1980 ].
Ліпідний екстакт готували, використовуючи метод [BlighE.G., DyerW.I., 1959]. Отриманий ліпідний екстракт висушували на роторному випаровувачі для видалення розчинника. Сухий ліпідний залишок зберігали в бензолі при температурі – 18 о С.Розділення індивідуальних фосфоліпідів проводили за методом двовимірної тонкошарової хроматографії (ТШХ) на підготовленому силікагелі [Беленький Б.Г. и др., 1984], нанесенному на скляних платівках 6 х 6 (см).Ідентифікацію індивідуальних фосфоліпідів проводили з урахуванням відомих значень Rf розподілу ліпідних плям стандартних розчинів фосфоліпідів та за допомогою якісних реакцій на функціональні групи. Для визначення ліпідних плям платівку обприскували 10% розчином сірчаної кислоти в метанолі. Вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів у ліпідних екстрактах визначали за допомогою молібдатного реагента [VaskovskyV.E. и др., 1975].
Рівень вільного та естерифікованого холестеролу визначали на газорідинному хроматографі на скляних колонках (0,5 м ) з носієм 1,5 % OV-1 на ChimaliteW (80-100 меш) при t+250 о C і розраховували відносно стандартного розчину β-ситостеролу.
Метилові ефіри жирних кислот отримували, використовуючи методичні прийоми, наведені W.WChristie [ChristieW.W., 1979], після чого проводили кількісний аналіз жирних кислот за допомогою газо-рідинної хроматографії на хроматографі CarloErba (Італія) з полум’яно-йонізаційним детектором на скляній колонці, яка була заповнена 10 % фазою SP-2300 (Silar 5 CP) на “ChromosorbW/HP” при програмованій температурі 140-175-225-250 о С (2 о С /хв).
Сфінгозин визначали за методом, основаним на його властивості утворювати забарвлений комплекс з метилоранжем, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації сфінгозину [LauterCJ, TramsCG., 1962].
Дослідження in vitro . Щобз’ясувати можливість впливу NSE на пухлинні клітини іншого типу як онкологічну модель використовували клітини лінії L1210 лейкемічних лімфоцитів миші (♀ № 234, сублінія 212, лінія DBA). Клітини культивували у скляних 20 см2 культуральних флаконах Карреля у середовищі DMEM (Sigma, США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (Sigma, США). Для проведення дослідів клітини висівали на пластикові 24-лункові планшети в кількості 5х105 клітин на лунку. В інкубаційне середовище додавали водно-спиртовий розчин NSE (10-4 , 10-6 , 10-8 М). Час дослідної експозиції – 24 - 96 годин. Оцінку життєздатності клітин проводили за тестом забарвлення трипановим синім. Для виявлення клітин з конденсованим або фрагментованим ядром використовували такі флуоресцентні барвники: DAPI, Хехст 33342 та акридиновий оранжевий.
Для дослідження впливу NSE на інтенсивність апоптозу використовували післяопераційну адренокортикальну тканину надниркових залоз людини (альдостерому та умовно нормальну тканину, що межує з пухлиною), яку одержували з хірургічного відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України. Тканина паралельно досліджувалась патологоанатомами. Післяопераційну тканину надниркових залоз людини переносили на лід, відділяли пухлинну тканину від умовно нормальної, додавали водно-спиртовий розчин NSE (10-4 , 10-6 , 10-8 М) та інкубували зрізи протягом трьох годин при 37 о С в 1 мл інкубаційного середовища. Після 3 годин інкубації проби швидко охолоджували, гомогенізували і виділяли ДНК. Для визначення інтенсивності фрагментації ДНК використовували електрофорез в агарозному гелі. Гелі після електрофорезу фотографували цифровою відеокамерою в трансілюмінаторі. Фрагменти ДНК сканували за допомогою програми „PhotoCaptMw. Кількісну оцінку інтенсивності апоптозу проведено по полосам, що відповідають 400 та 200 пар нуклеотидів. Інтенсивність фрагментації ДНК визначали по долі площі її фрагментів на сканограмі по відношенню до загальної кількості ДНК на доріжці. Дані порівнювали з контрольними зразками пухлинної тканини, до яких додавали водно-спиртовий розчин без NSE.
Статистичний аналіз проводили з використаннямt-крітерію Стьюдента; вірогідними вважали дані при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Вплив N -стеароїлетаноламіну на ріст і метастазування карциноми Льюїс у мишей. В результаті досліджень було показано, що NSEгальмує ріст пухлини і на початковій стадії розвитку пухлини, і на етапі вже сформованої неоплазми (введення NSE з 4 дня після перещеплення і з 21 дня після перещеплення, рис.1), при цьому NSE знижує кількість метастазів та зменшує об’єм метастатичного ураження легенів на різних етапах розвитку пухлини (табл.1).Також спостерігається гальмування росту пухлини за умов введення різних доз NSE (рис.2).
Ефект N -стеароїлетаноламіну на ріст клітинної лінії L 1210.
Антипухлинний ефект N-стеароїлетаноламіну вивчали також на лейкемічних клітинах лінії L1210 мишей. На рис. 9 показано, що за умов введення NSE спостерігається гальмування проліферації клітин, причому максимальний ефект виявляється через 48 год після введення препарату до клітинного середовища.
Таким чином, отримані результати свідчать, що N-стеароїлетаноламін може гальмувати ріст пухлини та процес метастазування незалежно від стадії розвитку неоплазми. Антипухлинний ефект NSEспостерігається також на інших типах трансформованих клітин, що в подальшому може бути корисним при застосуванні NSE в антипухлинній терапії.
Вивчення біохімічних показників в легенях мишей пухлиноносіїв, а саме в метастазах та в легеневій тканині, що межує з ними, надасть інформацію щодо розуміння шляхів, за якими
8-09-2015, 23:24