НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

ДІКАЛ МАР’ЯНА ВІКТОРІВНА

УДК 616.61-002.2:616-008.6

МЕХАНІЗМИ РОЗВИТКУ ТУБУЛО-ІНТЕРСТИЦІЙНОГО СИНДРОМУ ПРИ ХРОНІЧНОМУ НЕФРИТІ МАЗУГІ

(експериментальне дослідження)

14.03.04 –патологічна фізіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Буковинському державному медичному університеті МОЗ України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Роговий Юрій Євгенович,

Буковинський державний медичний університет,

професор кафедри фізіології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Гоженко Анатолій Іванович,

Одеський державний медичний університет,

завідувач кафедри загальної та клінічної патологічної

фізіології

доктор медичних наук, професор

Кришталь Микола Васильович,

Національний медичний університет

ім. О.О. Богомольця,

професор кафедри патологічної фізіології

Захист відбудеться “20“травня“ 2008 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 01024, м.Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою:01024,м.Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “18“квітня“ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Хронічний гломерулонефрит – це найбільш важке захворювання нирок, яке займає одне із перших місць серед причин розвитку хронічної ниркової недостатності. Сповільнення прогресування даного захворювання є однією із найбільш важливих проблем практичної нефрології (Лапчинська І.І., 2006; Смирнов А.В., 2002). У зв’язку з цим особливий інтерес викликає дослідження патогенетичних механізмів розвитку, прогресування хронічного гломерулонефриту, методи лікування та попередження розвитку і сповільнення прогресування хронічної ниркової недостатності (Корякова Н.Н., 2005; Мойсеєнко В.О., 2004).

Серед механізмів прогресування хронічного гломерулонефриту важливе значення надається розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому, який характеризується первинним ураженням клубочків нирок з подальшим залученням до патологічного процесу канальців та інтерстиція (Чеботарева Н.В., 2006). Зміни, які відбуваються в канальцях нирок при більшості захворювань проявляються пошкодженням проксимального відділу нефрону, дисфункція якого носить універсальний характер (Вашурина Т.В., 2003; Шулутко Б.И., 2004).

Значну роль у пошкодженні канальців та інтерстицію при хронічному нефриті Мазугі відіграють ряд факторів: ішемія тубулярного епітелія та інтерстиційних клітин, гіперамоніогенез із дифузією молекул NH₄ ⁺ в тканини нирок, процеси пероксидного окиснення ліпідів (Команденко М.С., 2000; Синяченко О.В., 2006), утворення в канальцях вільних радикалів кисню, дифузія їх в інтерстицій і активація фібробластів, перевантаження канальців білком призводить до розвитку їх дисфункції (Шишкин А.Н., 2005; Mackinnon В., 2005). Важливим фактором вважається протеїнурія, яка розвивається внаслідок порушення реабсорбції молекул білка через тубулярні клітини, які токсично впливають на клітини проксимальних канальців, порушуючи їх метаболізм та ушкоджуючи структуру з розвитком запалення, яке трансформується в патологічний процес інтерстицію (Gekle М., 2005; Iseki К., 2003).

Продукція цитокінів пошкодженими нефронами, а саме фактора некрозу пухлин-a, трансформуючого фактора роста-b, активація макрофагів і стимуляція колагеногенезу, із розвитком нефросклерозу (Паунова С.С., 2005; Самусеева Е., 2005; Zhang C., 2005), активація ренін-ангіотензинової системи сприяє формуванню хронічного патологічного процесу (Синяченко О.В., 2006; Antoine А.М., 1997; Border W.A., 1998).

Загальні закономірності патогенезу тубуло-інтерстиційного синдрому встановлені на прикладі моделі сулемової нефропатії в поліуричну стадію розвитку патологічного процесу (Роговий Ю.Є., 2000). Водночас особливості розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі на рівні кіркової, мозкової речовини та сосочка нирок з аналізом особливостей структурних, гістоензимохімічних змін нирок, виясненням ролі пероксидного окиснення ліпідів, антиоксидантного захисту, фібринолізу, протеолізу, фактора некрозу пухлин альфа практично не досліджені. Це склало основу для проведення наших досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася в рамках науково-дослідницької роботи кафедр медичної хімії та патологічної фізіології Буковинського державного медичного університету “Дослідження порушень водно-електролітного обміну, закономірностей центральних стресіндукованих та ішемічних дисфункцій, паренхіматозно-стромального дисбалансу при ушкодженні внутрішніх органів за умов впливу екологічно несприятливих чинників з розробкою шляхів корекції виявлених патологічних змін” номер державної реєстрації 01.04 V 009029, IH. 09.00.001.04. Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми, в якій дослідила можливі механізми розвитку тубуло-інтерстиційного сидрому при експериментальному нефриті Мазугі, функціональний стан нирок, стан системи тканинного фібринолізу та протеолізу, пероксидне окиснення ліпідів, окиснювальну модифікацію білків, антиоксидантну систему, елементи сполучної тканини та цитокіни. Провела експериментальне патогенетичне обгрунтування застосування фібринолітичного препарату урокінази та імуномодулятора GA-40.

Мета дослідження. З’ясувати механізми розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому із патогенетичним обгрунтуванням лікування даного патологічного процесу при хронічному нефриті Мазугі.

Завдання дослідження:

1. Вивчити функціонально-біохімічний стан нирок та взаємозв’язки між показниками функції нирок при хронічному нефриті Мазугі.

2. Дослідити роль пероксидного окиснення ліпідів, ферментів антиоксидантного захисту, окиснювальної модифікації білків, фактора некрозу пухлин-альфа, оксипроліну в патогенезі розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за умов хронічного патологічного процесу нирок.

3. Вивчити значення необмеженого протеолізу, тканинного фібринолізу та енергообміну на моделі прогресуючої ниркової недостатності в механізмах розвитку поєднаної патології ниркових канальців та інтерстицію.

4. Вивчити морфологічну та гістоензимохімічну характеристику моделі прогресуючої ниркової недостатності при експериментальному хронічному нефриті Мазугі.

5. Дослідити патогенетичну роль урокінази та препарату GA-40 як засобів лікування тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі.

Об’єкт дослідження: патогенез хронічної ниркової хвороби.

Предмет дослідження:тубуло-інтерстиційний синдром за хронічного нефриту Мазугі.

Методи дослідження:Експериментальні - моделювання тубуло-інтерстиційного синдрому; фізіологічні – функціональні показники діяльності нирок (діурез, кількість випитої рідини, екскреція креатиніну, іонів натрію, калію, білка, клубочкова фільтрація, проксимальна, дистальна реабсорбція іонів натрію, відносна реабсорбція води); біохімічні – визначення малонового альдегіду, дієнових кон’югатів, активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, окиснювальної модифікації білків, оксипроліну, білка за методом Лоурі; хімічні – визначення іонів натрію, калію; гістоензимохімічні – визначення активноті сукцинатдегідрогенази та лужної фосфатази; гістологічні – (забарвлення зрізів нирок: гематоксилін-еозин, PAS-реакція, Слінченко); імуно-ферментні - визначення фактора некрозу пухлин-a; статистичні – визначення середньої арифметичної, стандартної похибки, показника достовірності, кореляційний, регресійний та багатофакторний регресійний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. У дисертації вперше встановлений патогенез тубуло-інтерстиційного синдрому як основи розвитку хронічного та швидко-прогресуючого патологічного процесу в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок за умов хронічного нефриту Мазугі. Вперше показано при розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі наявність фіброзної трансформації інтерстиційних клітин ІІ типу сосочка нирок. Вперше встановлено, що активація сукцинатдегідрогенази в дистальному відділі нефрону за хронічного нефриту Мазугі супроводжувалася адекватною тенденцією до зростання транспорту іонів натрію в цьому відділі ниркових канальців. За умов формування тубуло-інтерстиційного синдрому вперше біохімічно обгрунтовано розвиток вторинної деструкції сполучної тканини. Вперше показано, що хронічний гломерулонефрит Мазугі супроводжується зростанням концентрації фактора некрозу пухлин-альфа в плазмі крові і сечі, який при цьому негативно корелює з проксимальною реабсорбцією іонів натрію та супроводжується атрофією канальців нефрону, що пояснюється активацією процесів апоптозу за участю даного фактора. Вперше встановлено захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі, що проявляється підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону. Вперше показано, що препарат GA-40 в умовах розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проявляє захистний вплив на збалансованість регуляторних процесів в кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу.

Практичне значення одержаних результатів. Доведена ефективність застосування урокінази та препарату GA-40 з метою профілактики та лікування тубуло-інтерстиційного синдрому. В даній роботі вперше виявлений захисний вплив урокінази на розвиток тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі з підсиленням протеолізу, фібринолізу плазми крові, зменшенням ступеня інтерстиційного фіброзу, зростанням проксимальної та дистальної реабсорбції іонів натрію, зниженням величини протеїнурії, поліпшенням кислотовидільних процесів у канальцях нефрону, що дає можливість рекомендувати цей препарат для проведення апробації в клінічній практиці в хронічному періоді гломерулонефриту з метою профілактики та лікування тубуло-інтерстиційного синдрому.

Виявлений захисний вплив препарату GA-40 за умов розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі в збалансованості регуляторних процесів у кірковій речовині та сосочку нирок, що проявляється в попередженні розростання сполучної тканини в інтерстиції нирок, запобігає процесам обтурації на рівні ниркового сосочка та гальмує розвиток гломерулосклерозу.

Для ранньої і більш точної діагностики ниркового тубуло-інтерстиційного синдрому на основі дослідження біопсійного матеріалу доцільно визначати вміст оксипроліну як маркера розростання сполучної тканини та активності сукцинатдегідрогенази в кірковій речовині нирок як кількісного критерію пошкодження ниркових канальців (Деклараційний патент 18785).

Особистий внесок здобувача. Здобувачем визначена мета та завдання даного дослідження, проаналізована наукова література з обраної теми. Особисто проведені всі біохімічні дослідження, аналіз та узагальнення результатів дослідження, написані всі розділи роботи, сформульовані висновки і практичні рекомендації, які відображені в опублікованих роботах. Тексти всіх публікацій написані здобувачем особисто. У наукових розробках, що висвітлені в статтях, опублікованих сумісно з співавторами, участь здобувача полягала в проведенні літературного пошуку, лабораторних досліджень, статистичній обробці отриманих даних, формулюванні висновків та підготовці публікацій до друку.

Апробація результатів дослідження. Результати досліджень, що включені до дисертації, доповідались на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Проблеми діагностики, профілактики та лікування екзогенних та ендогенних інтоксикацій” (м.Чернівці, БДМА, 2004 р.); Науковій конференції III читання ім.В.В.Підвисоцького (м.Одеса, 2004 р.); IV Національному конгресі патофізіологів України “Фундаментальні аспекти сучасної медицини” (м.Чернівці, 2004 р.); Міжнародній студентській науковій конференції “Молодь-медицині майбутнього” (м.Одеса, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Сучасні проблеми медичної та клінічної біохімії” (м.Чернівці, 2005 р.); 67 Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених, присв’яченій 75-й річниці з дня заснування ДонДМУ ім.М.Горького “Актуальні питання клінічної, експериментальної, профілактичної медицини та стоматології” (м.Донецьк, 2005 р.); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Оздоровчі ресурси Карпат і прилеглих регіонів” (м.Чернівці, 2005 р.); Міжнародній науково-практичній конференції “Хронобіологія і хрономедицина: теоретичні та клінічні перспективи” (м.Чернівці, 2006 р.); XVII З’їзді фізіологів України (м.Чернівці, 2006 р.).

Публікації. За матеріалами досліджень опубліковано 10 наукових праць, з них 6 – статті у фахових наукових журналах, рекомендованих ВАК України, де можуть публікуватися матеріали кандидатських та докторських дисертацій (2 одноосібні); 2 роботи - тези в матеріалах і збірниках конференцій та конгресів, отримано 2 патенти України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалу і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел (151 – кирилицею та 161 – латиницею). Дисертація викладена на 178 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 17 таблицями і 53 рисунками та 15-ма актами впровадження.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У дослідах на 267 статевозрілих щурах-самцях масою 0,15-0,18 кг та 16 кроликах досліджували функціональний стан нирок, процеси клубочково-канальцевого та канальцево-канальцевого балансу, процеси пероксидного окиснення ліпідів та окисної модифікації білків, стан антиоксидантної системи та роль прозапальних цитокінів у розвитку тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі.

Гломерулонефрит Мазугі моделювали за методом (K.Rother, H. Sarre, 1963) з проведенням дослідження на 45-ту добу після введення щурам нефротоксичної сироватки, що відповідало хронічному періоду розвитку експериментального гломерулонефриту із сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом (Б.А.Пахмурний, 1978).

Функція нирок вивчалася за умов водного індукованого діурезу. Водне навантаження (50 мл/кг маси тіла) проводили підігрітою до 37^о С водогінною водою за допомогою металевого зонда, який вводили в шлунок. Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації під ефірним наркозом. У сечі концентрацію креатиніну визначали за методом Фоліна (Е.Б.Берхин, Ю.И.Иванов, 1972), у плазмі крові - за методом Поппера у модифікації А.К.Мерзона (1970); концентрацію білка в сечі визначали сульфосаліциловим методом (А.І. Міхеєва, І.А.Богодарова, 1969), вміст кислот, що титруються, та аміаку в сечі визначали титрометрично ( С.И.Рябов и соавт., 1997), концентрацію іонів натрію і калію в плазмі крові та сечі визначали методом фотометрії полум`я з використанням фотометра ФПЛ-1.

На підставі отриманих даних розраховували показники функціонального стану нирок за формулами, наведеними в роботах (О.Шюк, 1981; С.И.Рябов, Ю.В.Наточин, 1997). Проводили кореляційний аналіз між показниками функції нирок за умов хронічного нефриту Мазугі.

У кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок визначали показники пероксидного окиснення ліпідів і антиоксидантних систем: дієнові кон’югати за методом (Б.В. Гаврилов, М.И.Мишкорудная, 1983), малоновий альдегід за методом (И.Д.Стальная, Т.Г.Гаришвили, 1977), активність супероксиддисмутази [КФ 1.15.1.1.] за методом (С.Чевари, И.Чаба, Й.Секей, 1985), активність каталази [КФ 1.11.1.6.] за методом (М.А.Королюк, Л.И.Иванова, И.Г.Майорова, В.Е.Токарев, 1988) і активність глутатіонпероксидази за методом (І.Ф.Мещишен, В.П.Пішак, Г.П.Копильчук, 1994). Білок в тканинах визначали за методом (O.H.Lowry, N.I. Rosebrough, A.L.Parr, R.I. Randwall, 1951). Вміст окисно- модифікованих білків у плазмі кров та гомогенатах тканин визначала за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином з утворенням гідразонів характерного спектру поглинання (І.Ф.Мещишен, В.П.Польовий, 1999).

Cтан енергетичного обміну оцінювали за активністю сукцинатдегідрогенази [КФ 1.3.99.1], яку визначали за методом (Ю.М.Торчинский, 1959) в модифікації (А.И.Гоженко, 1974). Кількісну оцінку ступеня колагеногенезу в кірковій речовині нирок проводили за визначенням вмісту оксипроліну (H. Stegeman, 1958).

Тканинний фібриноліз в нирках та сечі оцінювали за визначенням лізису азофібрину з оцінкою сумарної (СФА), неферментативної (НФА) (інкубація проб в присутності блокатора ферментативного фібринолізу e-амінокапронової кислоти) з розрахунком ферментативної фібрино­літичної активності (О.Л.Кухарчук, 1996). Стан необмеженого протеолізу в кірковій, мозковій речовині нирок та сечі оцінювали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (В.П.Пішак 1998).

Імуноферментні дослідження проводились за допомогою стандартних наборів “Amersham” (Англія) та “Immuno Nuclear Corporation” (США) для визначення концентрації ФНП-a.

З гістологічних методів використовували забарвлення депарафінованих зрізів гематоксилін-еозином, за методом Слінченка (І.Ю.Олійник, 1999), проводили PAS-реакцію (U. Schmidt, M.Horster, 1977).

Гістоензимохімічно в нирках виявляли лужну фосфатазу та сукцинатдегідрогеназу (М.Берстон, 1965).

Корекцію тубуло-інтерстиційного синдрому при хронічному нефриті Мазугі проводили препаратом GA-40 “ALEXIS” (Грузія), (комплекс поліпептидів, виділених з екологічно чистого рослинного матеріалу) щоденно внутрішньом’язево в дозі 2 мкг/кг та урокіназою НВФ “Simko, ltd” (Україна) з питомою активністю 3000 од. Plough/мг білка вводили в черевну порожнину в дозі 5 од. Plough/100 г 1 раз у 3 дні в 0,2 мл дистильованої води впродовж всього періоду розвитку хронічного нефриту.

Весь цифровий матеріал статистично оброблений методами параметричної статистики, включаючи кореляційний, регресійний та багатофакторний регресійний методи аналізу за допомогою програм “Statgrafics” та “Excel 7.0” та “Statistica”. Показник вірогідності в таблицях, вказаний тільки для вірогідних відмінностей, на рисунках достовірно відмінні величини (р< 0,05) відмічені відповідними значками. У таблицях кореляційного аналізу, в рівняннях і на рисунках простої та багатофакторної регресійних залежностей представлені результати тільки з вірогідними (р< 0,05) зв`язками.

У розділах одержаних результатів та їх обговоренні наведені дані про дослідження тубуло-інтерстиційного синдрому за хронічного нефриту Мазугі на 45-ту добу після введення кролячої нефротоксичної сироватки, який характеризувався відсутністю змін з боку величини сечовиділення, зростанням концентрації іонів калію в сечі та його екскреції, мала місце тенденція до розвитку гіперкаліємії в плазмі крові (табл. 1). Концентрація креатиніну в сечі та його екскреція мали тенденцію до гальмування. Спостерігалася ретенційна азотемія, на що вказувало зростання концентрації креатиніну в плазмі крові. Клубочкова фільтрація та концентраційний індекс ендогенного креатиніну знижувалися, мав місце розвиток протеїнурії. Оцінка показників транспорту іонів натрію за хронічного нефриту Мазугі показала зростання концентрації іонів натрію в сечі та його екскреції. Концентрація іонів натрію в плазмі крові мала тенденцію до зростання, а фільтраційна фракція та абсолютна реабсорбція іонів натрію характеризувалася тенденцією до гальмування. Відносна реабсорбція іонів натрію знижувалася, зростали концентраційний індекс та кліренс іонів натрію.

Проксимальна реабсорбція іонів натрію характеризувалася тенденцією до гальмування, а дистальна реабсорбція цього електроліту мала тенденцію до зростання. Водночас при разрахунках дистальної реабсорбції іонів натрію на 100 мкл клубочкового фільтрату виявлено достовірне зростання цього показника. Кліренс вільної від іонів натрію води не змінювався.

Таблиця 1

Показники функції нирок на 45-ту добу хронічного нефриту Мазугі в період формування тубуло-інтерстиційного синдрому (x±Sx)

p- вірогідність різниць порівняно з контролем; n-число спостережень.

Дослідження кислоторегулювальної функції нирок за умов хронічного нефриту Мазугі на 45-ту добу розвитку патологічного процесу показало наступне. Екскреція кислот, що титруються, та іонів амонію зростали. Водночас амонійний коефіцієнт змін не зазнавав. Концентрація іонів водню в сечі зростала, а його екскреція характеризувалася тенденцією до збільшення. Водночас стандартизована екскреція іонів водню за швидкістю клубочкової фільтрації зростала вірогідно. Крім того, екскреція кислот, що титруються та іонів амонію, розраховані на 100 мкл клубочкової фільтрації також зростали.

У кірковій речовині нирок у цей час виявлено інфільтрацію строми, клубочків та перигломерулярного простору клітинними елементами, дистрофічні зміни проксимальних канальців (рис. 1).

За хронічного нефриту Мазугі встановлено наявність тубуло-інтерстиційного синдрому в кірковій, мозковій речовині та сосочку нирок, що підтверджено атрофічними та дистрофічними змінами канальців нефрона, наявністю патологічних змін з боку базальних мембран, інтерстицію та явищами інфільтрації строми клітинними елементами, з наявністю тромбозу та фіброзу. За хронічного нефриту Мазугі зі сформованим тубуло-інтерстиційним синдромом внаслідок пошкодження проксимального відділу нефрону – показано зниження


8-09-2015, 19:42