НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В. ПАЛЛАДІНА НАН УКРАЇНИ
ШИМАНСЬКИЙ ІГОР ОЛЕКСАНДРОВИЧ
УДК 612.82+577.164.15+616-03
МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ
РЕАЛІЗАЦІЇ НЕЙРОТРОПНОЇ ДІЇ ВІТАМІНУ РР
ТА ЙОГО БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ ПОХІДНИХ
03.00.04 – Біохімія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2008
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України Донченко Георгій Вікторович, завідувач відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, старший науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології Київського національного університету імені Тараса Шевченка;
доктор медичних наук, професор Мхітарян Лаура Сократівна, керівник відділу біохімії ННЦ “Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України.
Захист відбудеться “ 17 ” березня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 при Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: м. Київ, вул. Леонтовича, 9.
Автореферат розісланий “ 15 ” лютого 2008 р.
Учений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми . Новий інтерес до вітаміну РР, пов’язаний з можливістю його ефективного застосування у неврологічній практиці [StevensM.J. etal, 2007], обумовлює доцільність подальшого з’ясування конкретних механізмів біологічної дії вітаміну за різних функціональних станів нервової системи. Нині цілком очевидно, що більшість функцій вітаміну РР реалізується у клітинах через його нуклеотидні похідні, зокрема NAD+ та NADP+ [Maiese K., Chong Z., 2003]. Хоча NAD+ упродовж багатьох десятиліть і був відомий лише як основний акцептор гідрид-іонів у метаболічних реакціях оксидоредукції [Magni G. et al, 1999], останнім часом все більшу увагу привертає його регуляторна роль. Так показано, що NAD+ є субстратом у таких важливих клітинних регуляторних процесах, як ковалентна модифікація білкових молекул (моно та полі-ADP-рибозилювання) [Ame J.C. et al, 2004], реакції деацетилювання гістонів за участю Sir2, нещодавно відкритого класу ферментів, які беруть участь у регуляції “генного сайленсингу” [Yu S.W. et al, 2002]. Поряд з цим, NAD+ та NADP+ необхідні для синтезу відповідно циклічної ADP-рибози та NAADP+ – важливих медіаторів кальцієвих сигнальних шляхів [Guse A.H., 2005]. Порушення у будь-якому з цих процесів потенційно може спричинювати дисфункції клітин, призводячи до підвищення ризику розвитку нейродегенеративних захворювань.
Нейротропні ефекти вітаміну РР за нормальних фізіологічних умов та за розвитку деяких патологічних станів нервової системи можуть здійснюватись, принаймні частково, на рівні регуляції процесів синаптичної передачі, опосередкованих NAD+ . У синаптичних мембранах головного мозку щурів виявлено існування NAD-модуляторної системи, фізіологічне значення якої полягає у спряженні специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами з процесом їхньої деполяризації, що індукує вивільненням нейромедіаторів із нервових закінчень [Халмурадов А.Г. и др., 1983]. Молекулярний механізм такого спряження не виключає можливості залучення мембранних систем транспортування катіонів та деяких компонентів основних шляхів клітинної сигналізації. З огляду на це, актуальною є оцінка можливості функціональної взаємодії NAD-модуляторної системи з системами транспортування катіонів та сигнальної трансдукції. Дослідження молекулярних механізмів некоферментної дії NAD+ на синаптичні закінчення, що реалізуються через специфічну рецепцію нуклеотиду NAD-зв’язувальним білком синаптичних мембран, дозволить розширити уявлення щодо механізмів нейротропної дії вітаміну РР.
У контексті з’ясування молекулярних механізмів, які лежать в основі некоферментної функції вітаміну РР, велике значення має вивчення NAD-модуляторної системи синаптичних закінчень за різних функціональних станів нервової системи. Відомо, що дефіцит вітаміну РР та піридинових нуклеотидів або порушення у їх обміні можуть викликати селективну нейродегенерацію внаслідок патогенетичних змін окисно-відновних процесів та регуляторних функцій в нервових клітинах насамперед тих, що залучені до контролювання синаптичної активності. Раніше показано, що NAD-зв’язувальний білок бере участь у реалізації нейротропної дії вітаміну РР за експериментальних РР-гіповітамінозу, епілепсії та хвороби Паркінсона [Фоменко А.И. и др., 1997; Кучмеровська Т.М., 1998]. Не достатньо з’ясованими, однак, залишаються питання, наскільки у патогенезі різних захворювань нервової системи зміни в ключових NAD+ -залежних регуляторних процесах, зокрема моно та полі-ADP-рибозилюванні білків, впливають на NAD-рецепцію та процеси нейротрансмісії та якою мірою вітамін РР може залучатись до регуляції зазначених процесів.
Для більш глибокого розкриття конкретних біохімічних механізмів, відповідальних за нейротропну дію вітаміну РР та його похідних у функціонуванні збудливих клітин, нами проведено дослідження на експериментальній моделі цукрового діабету 1 типу (ЦД1). Оцінка характеру порушень NAD-модуляторної системи у взаємозв’язку з рівнем нікотинамідних динуклеотидів головного мозку, деякими NAD-утилізуючими та NAD-генеруючими процесами, а також функціональним станом серотонінергічної системи є актуальною та сприятиме як з’ясуванню патогенетичного значення змін NAD-модуляторної системи за діабетичної невропатії, так і, в цілому, кращому розумінню її біологічної ролі у функціонуванні синаптичних закінчень та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР.
Мета та завдання роботи. Метою роботи було дослідження молекулярних механізмів участі NAD+ у функціонуванні NAD-модуляторної системи головного мозку щурів та механізмів нейротропної дії вітаміну РР і його біоактивних похідних за експериментального цукрового діабету 1 типу.Відповідно до поставленої мети в роботі вирішувались наступні завдання:
1. Дослідити молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD+ на синаптосомальній моделі:
-З’ясувати роль іонних каналів при NAD-індукованій деполяризації синаптичних мембран головного мозку щурів;
- Вивчити вплив NAD+ на активність Na+ ,К+ -АТPази синаптосом та синаптичних мембран головного мозку;
- Оцінити можливість існування функціонального взаємозв’язку NAD-модуляторної системи з компонентами ключових систем внутрішньоклітинної сигналізації у нервових закінченнях;
- У порівняльному аспекті дослідити концентраційнозалежні ефекти нікотинаміду (NAm) та NAD+ на трансмембранний цитоплазматичний потенціал нервових закінчень та вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку.
2. Вивчити функціональний стан NAD-модуляторної системи за експериментального ЦД1 та за умов введення нікотинаміду.
3. Дослідити роль сигнального шляху Gs -білок/cAMP/PKA пресинаптичних закінчень у модуляції синаптичної активності за цукрового діабету та у механізмі нейротропної дії вітаміну РР та його похідних.
Об’єкт дослідження : процеси модуляції синаптичної активності за різних функціональних станів нервової системи та у механізмі реалізації нейротропної дії вітаміну РР і його похідних.
Предмет дослідження – поглинання та вивільнення нейромедіаторів ізольованими синаптичними закінченнями, генерування мембранного потенціалу, стан системи антиоксидантного захисту та пероксидне окислення ліпідів, підтримання структурно-функціональної цілісності геному у нервовій системі нормальних і діабетичних щурів та за введення сполук з РР-вітамінною активністю.
Методи дослідження : виходячи з основних задач дослідження, проведено експериментальне моделювання цукрового діабету 1 типу та інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі, використано біохімічні (методи ензимології, препаративної біохімії, біокінетики), біофізичні методи, методи радіорецепторного аналізу та статистично-математичні.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана дисертаційна робота є частиною фундаментальних досліджень відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за темами “Дослідження механізмів реалізації біологічної дії вітамінів, коферментів та їх специфічних білків-акцепторів в регуляції метаболізму спеціалізованих клітин” (1997-2001); “Вивчення механізмів функціональної взаємодії вітамінів А, С, Д, РР, В1 та Q в організмі тварин в нормі та за умов деяких патологій” (2002-2006); “Дослідження молекулярних механізмів реалізації біологічної ролі вітамінів, коферментів та їхніх білків-акцепторів у забезпеченні функціонування та життєздатності клітин за норми та за умов деяких патологій” (2007-2011).
Наукова новизна одержаних результатів. Результати досліджень, проведених на моделі синаптосом, поглиблюють розуміння конкретних молекулярних механізмів секретогенної дії NAD+ . Вперше встановлено, що деполяризація синаптичних мембран та стимулювальний вплив динуклеотиду на процес вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку опосередковуються активацією сигнальних шляхів протеїнкінази С та/або А і реалізуються через інгібування активності Na+ ,K+ -АТPази за неконкурентним механізмом та активацію потенціалкерованих натрієвих каналів. Показано, що нейротропна дія нікотинаміду на рівні синаптичних закінчень у концентраціях, наближених до фізіологічних, найімовірніше здійснюється не прямо, а опосередковано через NAD+ .
Отримані дані розкривають конкретні патогенетичні механізми розвитку діабетичної невропатії та свідчать про важливу роль порушень NAD-модуляторної системи в розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Вперше показано, що зростання специфічного зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за цукрового діабету корелює з підвищенням як спонтанного, так і індукованого деполяризуючими агентами вивільнення серотоніну синаптосомами головного мозку, але спостерігається зниження вивільнення медіатору у відповідь на дію екзогенного NAD+ . При цьому виявлено, що не існує прямої залежності між рівнем NAD+ у головному мозку та його зв’язуванням синаптичними мембранами.
Результати проведених досліджень свідчать про опосередкований полі-АDP-рибозополімеразою (Parp) механізм порушення біодоступності NAD+ при розвитку дисфункцій головного мозку за ЦД1. Зокрема, вперше продемонстровано можливий зв’язок між зростанням активності цього NAD-залежного ферменту у клітинних ядрах та зниженням вмісту динуклеотиду у головному мозку діабетичних щурів, що пов’язано з репарацією розривів ДНК в умовах виявленої інтенсифікації за діабету пероксидокислювальних та вільнорадикальних процесів. Вперше встановлено, що посилення моно-ADP-рибозилювання Gs -білків та активація сигнального шляху cAMP/протеїнкіназа A, принаймні частково, може бути ендогенним сигналом, який сприяє підвищенню вивільнення нейромедіаторів за цукрового діабету.
Механізм позитивної нейротропної дії за діабету нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, введених у терапевтичних дозах, включає нормалізуючий ефект цих сполук на рівень NAD+ і специфічне зв’язування динуклеотиду синаптичними мембранами головного мозку, що корелює з нормалізацією процесів зворотного поглинання та вивільнення серотоніну ізольованими синаптичними закінченнями.Здатність вітаміну РР і його похідного ефективно коригувати NAD-опосередковані мембранні процеси за експериментальної діабетичної невропатії, принаймні частково, є результатом антиоксидантної дії цих сполук та інгібування процесів моно- і полі-АDP-рибозилювання білків.
Практичне значення одержаних результатів. Позитивна нейротропна дія вітаміну РР та його похідних, яка на рівні контролю синаптичної активності реалізуються опосередковано через NAD-зв’язувальний білок синаптичних мембран, обумовлює можливість та доцільність їх застосування з метою нормалізації специфічних нейрохімічних процесів у синаптичних закінченнях та забезпечення ефективної нейропередачі за діабетичної невропатії.Крім цього, продемонстровано можливість успішного використання нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК у фармакологічних дозах як інгібіторів загального ADP-рибозилювання та сполук з антисорбітоловими та антиоксидантними властивостями у лікуванні даного захворювання. Результати проведених досліджень також підтверджують, що порушення процесів рецепції NAD+ синаптичними мембранами та його нейромодуляторної дії можуть бути спільним проявом розвитку різних захворювань центральної нервової системи.
В цілому, проведені дослідження розширюють уявлення щодо механізмів біологічної дії вітаміну РР та нікотиноїл-ГАМК у головному мозку та складають теоретичне підґрунтя для подальшого вивчення досліджуваних сполук та інших біоактивних похідних на їх основі як препаратів, що використовуються з метою цілеспрямованої фармакологічної корекції порушень функціонування ЦНС за діабетичної невропатії та інших патологій нервової системи.
Особистий внесок здобувача. Автором особисто підібрано та критично проаналізовано великий обсяг сучасної вітчизняної та зарубіжної літератури за темою запланованого наукового дослідження. Дисертантом розроблено конкретні схеми вирішення поставлених завдань, інтерпретовано отримані результати, підготовлено до друку публікації. Експериментальна частина роботи виконана особисто здобувачем. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено спільно з науковим керівником – зав. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, член-кор. НАН України, д.б.н., проф. Донченко Г.В. та пров. науков. співр. відділу біохімії коферментів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна, д.б.н. Кучмеровською Т.М.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на VI з’їзді ендокринологів України (2001, Київ); VI міжнародній конференції “Биоантиоксидант” (2002, Москва); VIII Українському біохімічному з’їзді (2002, Чернівці); Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, 2004); V Парнасівській конференції (2005, Київ); міжнародній конференції “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (2005, Пущино, Росія); II Європейському Конгресі з фармакології (1999, Угорщина); V Всесвітньому Конгресі IBRO з нейронаук (1999, Єрусалим, Ізраїль); IX, XI, XII Конгресах “NEURODIAB Diabetic Neuropathy” Європейської Асоціації з Вивчення Діабету, EASD (1999, Маастріхт, Нідерланди; 2001, Абердін, Шотландія; 2002, Балатонфюред, Угорщина;); III об’єднаному З’їзді DFSG (група з вивчення діабетичної стопи) та NEURODIAB (2004, Регенсбург, Німеччина); 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43-му Щорічних Конгресах Європейської Асоціації з Вивчення Діабету (1999, Брюссель, Бельгія; 2000, Єрусалим, Ізраїль; 2001, Глазго, Великобританія; 2002, Будапешт, Угорщина; 2004, Мюнхен, Німеччина; 2005, Афіни, Греція; 2006, Копенгаген-Мальмо, Данія-Швеція; 2007, Амстердам, Нідерланди); 19-му Всесвітньому Діабетичному Конгресі (2006, Кейптаун, Південна Африка).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 наукових праць, з яких 6 - статті у фахових наукових виданнях.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, заключної частини, висновків та списку використаних джерел, який містить 330 посилань. Робота викладена на 166 сторінках друкованого тексту та проілюстрована 11 таблицями та 29 рисунками.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Огляд літератури. Розглянуто некоферментні функцій вітаміну РР та його біологічно активних похідних у забезпеченні процесів життєдіяльності клітин; проведено аналіз сучасних уявлень про значення вітаміну РР та його похідних за різних функціональних станів центральної нервової системи; особливу увагу приділено нейрохімічним порушенням за цукрового діабету та висвітлено можливу роль вітаміну РР у їхній корекції.
Матеріали та методи дослідження. Експерименти проводили на щурах-самцях лінії Вістар вагою 130-160 г, яких утримували в стандартних умовах віварію при відповідному освітленні та годуванні ad libitum.
Експериментальний цукровий діабет 1 типу у щурів викликали одноразовим введення стрептозотоцину ("Sigma") з розрахунку 70 мг/кг маси тіла внутрішньоочеревинно (Chatfopadhyay S. et al, 1997). Розвиток діабету контролювали за зростанням рівня глюкози крові, яку визначали глюкозооксидазним методом (Marks V., 1963). В експериментах використовували тварин через 4 тижні після індукції діабету з рівнем глюкози 14,5-16,5 ммоль/л, у яких, за даними літератури, розвивається діабетична невропатія. Тваринам вводили NAm або нікотиноїл-ГАМК (N-ГАМК) щоденно в дозі 20, 100 та 200 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно, упродовж 7-14 діб.
Модель інтенсифікації біосинтезу NAD+ в організмі створювали : а/ введенням тваринам NAm та/або N-ГАМК на 6 годин або упродовж 2 тижнів по 20, 100 або 200 мг на кг маси тіла; б/ введенням NAm за 6 годин до забою у дозі 500 мг на кг маси тіла (Чаговець Р.В. та інш., 1977).
Синаптосоми та синаптичні мембрани головного мозку виділяли методом диференційного центрифугування в градієнті густини сахарози за методом Abita J. et al. (1977). В основу процедури виділення ядер клітин головного мозку було покладено метод, розроблений Blobel G. et al. (1966).
У кислотних екстрактах головного мозку, які одержували при його обробці 0,6 н HClO4 (при температурі 0-4о С), визначали вміст NAD+ , NADP+ , ATP та сорбітолу ферментативними методами (Bergmeyer H.U., 1974).
Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ (питома активність 269 мКи/ммоль, "Amersham", Англія) синаптичними мембранами головного мозку щурів визначали радіолігандним методом (Варфоломеев С.Д. и др., 1982) як різницю між загальним (кінцева концентрація [U-14C]NAD+ 0,32 мкМ) та неспецифічним зв’язуванням у присутності 1000-кратного надлишку неміченого динуклеотиду.
Зворотне поглинання [2-14C]серотоніну (57 мКи/ммоль, "Amersham"), вивчали в інкубаційному середовищі об’ємом 1 мл, що містило 100 мМ Na – фосфатний буфер, рН 7,4; 120 мМ NaCl; 5 мМ КСl; 1 мM CaCl2; 1 мM MgCl2; 0,5 мM Na2HPO4; 10 мМ глюкозу; 10 мкМ іпроніазид (Gandhi V.C., 1990). До інкубаційного середовища вносили 0,5 мг білка синаптосом та преінкубували 5 хв при 37oC. Після цього додавали мічений серотонін, кінцева концентрація якого становила 1,48 мкмоль/л. Після закінчення інкубації (10 хвилин за температури 370 С) проби швидко фільтрували через фільтри GF/C "Whatman" та промивали 15 мл 0,1 М фосфатного буферу. Поглинену синаптосомами радіоактивність на висушених фільтрах підраховували у РС-101 на рідинно-сцинтиляційному спектрометрі SL-30 ("Intertechnique", Франція).
Для визначення вивільнення [2-14C]серотоніну фільтри з навантаженими міченим серотоніном синаптосомами поміщали у перфузійні камери, приєднані до перистальтичного насосу і промивали 6 мл інкубаційного середовища (в яке вносили досліджувані агенти) зі швидкістю 1,0 мл/хв. Фракції з радіоактивністю, що вивільнилась, збирали кожної хвилини упродовж 6 хв і підраховували радіоактивність в сцинтиляційній рідині РС-103.
Мембранний потенціал вимірювали за поглинанням ліпофільного катіону тетра[3 Н]фенілфосфонію броміду ([3 H]ТФФ+ , 20 Ки/ммоль, "Amersham") синаптосомами головного мозку щурів (Pauwels P.J., 1986). Кінцева концентрація катіону становила 2,5 нмоль/л. Величину потенціалу розраховували як різницю поглинання [3 H]ТФФ+ синаптосомами головного мозку за високої (1) та низької (2) концентрації K+ , використовуючи рівняння Нернста: Е = ─ 26,7ln[3 H]ТФФ1 + /[3 H]ТФФ2 + , де [3 H]ТФФ1 + та [3 H]ТФФ2 + - радіоактивність на фільтрах після інкубування синаптосом у середовищі 1 та 2. За умов проведених експериментів величина Е дорівнювала 0 при концентрації KCl 120ммоль/л.
Активність Na+ ,K+ -АТPази (АТР: фосфогідролаза 3.6.1.3)визначали за утворенням неорганічного фосфату як різницю між сумарною активністю АТРаз та активністю Ca2+ ,Mg2+ -АТФази (у присутності 0,1 мМ уабаїну) (Rathbun P.J., 1969).
Про активність полі-ADP-рибозополімерази (NAD+ : полі(аденін-дифосфат-D-рибозил)-акцептор-ADP-D-рибозилтрансфераза 2.4.2.30) судили за кількістю радіоактивно мічених ADP-рибозильних фрагментів NAD+ , включених до загальних ядерних білків клітин головного мозку щурів, за методом Tanigawa Y. et al., 1977. Рівень базального та індукованого холерним токсином (2 мкг преактивованого у 20 мМ дитіотрейтолі токсину на 1 мг білка синаптосом) моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків оцінювали за включенням [U-14 C]ADP-рибозильних фрагментів NAD+ до синаптосомальних білків (Qian Z. et al., 1983).
Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за рівнем дієнових кон’югатів (Тимирбулатов Р.А., 1983) та ТБК-активних продуктів (Тимирбулатов Р.А., 1981). При визначенні вмісту дієнових кон’югатів у гомогенаті мозку, їх екстрагували у гептан-ізопропаноловій суміші та вимірювали оптичну густину гептанового шару (l = 233). Вміст ТБК-активних продуктів визначали спектрофотометрично за їх реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Ступінь пошкодження ДНК визначали спектрофотометрично за (Ходарев Н.Н. и др., 1981).
Результати досліджень оброблялись статистично з використанням t-критерію
8-09-2015, 19:29