ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД
ТЕРНОПІЛЬСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені І. Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО” МОЗ УКРАЇНИ
САДЛЯК ОКСАНА ВОЛОДИМИРІВНА
УДК 616-056.3-039.54-036.12: 616.155 32]-085.274-
ЛІМФОЦИТОПОСЕРЕДКОВАНІ МЕХАНІЗМИ
ЗА УМОВ ХРОНІЧНОЇ ГІПЕРІМУНОКОМПЛЕКСЕМІЇ ТА ВПЛИВ НА НИХ КОРВІТИНУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ
14.03.04 – патологічна фізіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата медичних наук
Тернопіль – 2008
Дисертацією є рукопис
Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Чоп’як Валентина Володимирівна,
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри клінічної імунології та алергології.
Офіційні опоненти:
доктор медичних наук, професор Мисула Ігор Романович, Державний Вищий навчальний заклад “Тернопільський державний медичний університет імені І. Я. Горбачевського” МОЗ України;
завідувач кафедри медичної реабілітації та спортивної медицини,
доктор медичних наук Нещерет Олександр Павлович, Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України, провідний науковий співробітник лабораторії епідеміології і цукрового діабету.
Захист відбудеться 26 травня 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 58.601.01 у Державному вищому навчальному закладі “Тернопільський державний медичний університет імені І. Я. Горбачевського” МОЗ України (46001, м. Тернопіль, Майдан Волі, 1)
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державного вищого навчального закладу “Тернопільський державний медичний університет імені І.Я. Горбачевського” МОЗ України (46001, м. Тернопіль, вул. Січових Стрільців, 8)
Автореферат розісланий 23 квітня 2008 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор медичних наук, професор Я.Я. Боднар
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. У структурі алергічних захворювань імунокомплексне ушкодження тканин розцінюється як провідна патогенетична ланка розвитку багатьох патологій (Langford C.A., 2003; Fernandes N., 2004). Відомо, що гіперімунокомплексемія у клінічній практиці супроводжує ряд інфекційних, запальних, онкологічних та системних захворювань, що є підґрунтям для формування імунодефіцитних та автоімунних синдромів (Ройт А., 2000; Haruta K. et al., 2001; Sullivan K.E., 2003; Амосова К.М. 2007). Патогенетичні механізми розвитку цих захворювань, крім ушкодження судин та внутрішніх органів, також супроводжуються продукцією структурно-неповноцінних антитіл, послабленням функцій системи фагоцитів та зниженою активністю дезорієнтованих імунними комплексами лімфоцитів (Чоп’як В.В., 1998; Лєбєдєв К.А., 2005). Проведені наукові дослідження останнього часу засвідчують, що процеси утворення та відкладання імунних комплексів, а відтак і формування гіперімунокомплексного захворювання, залежать від рівня оксиду азоту (NO) в організмі та індукції активних форм кисню (Forstermann U., 2006). Патогенетичну основу токсичної дії оксиду азоту, за цих умов, складає його спряжена реакція із супероксид-аніон радикалом, результатом якої є утворення пероксинітриту, а посилення некомпенсованої генерації вільних радикалів призводить до руйнування клітинних компонентів, розвитку метаболічно-імунної дизадаптації та формування тяжких системних патологій (Коцюруба А.В., 2000; Lum H., Roebuck K.A., 2001; Мисула І.Р., 2007). Тому імунорегуляторна роль оксиду азоту в імунокомплексних процесах та її вплив на міжклітинну кооперацію ефекторних і мішеневих клітин, за цих умов, стала об’єктом більш ґрунтовного вивчення участі NO-залежних механізмів у розвитку лімфоцитарно-ендотеліальних взаємодій за умов хронічної гіперімунокомплексемії (Tesfamariam B., DeFelice A.F., 2007 ). Проте слід відзначити, що оксид азоту, субстратом для якого є амінокислота – L-аргінін, не обмежений лише синтазним шляхом метаболізму. Обмін L-аргініну здійснюється, як мінімум, двома шляхами: окисним – (NO-синтазним) і неокисним (аргіназним), що значно розширює розуміння ролі цієї амінокислоти в організмі (Cагач В.Ф., 2001; Горпинченко І.І., 2002; Чалісова Н.І., 2007). Зміни в метаболізмі L-аргініну, особливо при інгібуванні його NO-синтазного шляху, можуть зумовити суттєві порушення у генетично обумовлених функціях імунокомпетентних та ендотеліальних клітин (Zhang C. et al., 2001; Граник В.В., 2003; Kitamoto S. et al., 2005; Нещерет О.П., 2006).
Отже, на сьогоднішній день простої і однозначної картини впливу метаболізму L-аргініну на імунну систему немає. Тому розуміння та оцінка ролі цих механізмів взаємозв`язку за умов хронічної гіперімунокомплексемії матиме важливе значення у вивченні пошкодження не тільки в судинній стінці, але і захворювань, пов’язаних з порушенням імунітету, що в подальшому сприятиме пошуку вирішення проблем патогенетичної імунокорекції та профілактики імунокомплексних захворювань. Експериментальні та клінічні дослідження останніх років спонукають до активного пошуку і вивчення нових середників, які, володіючи властивостями антиоксидантів та мембранопротекторів, здатні проявляти і селективну дію на популяції та субпопуляції імунокомпетентних клітин, що є особливо актуальним за умов даної патології. У плані корекції імунокомплексних захворювань перспективним є застосування біофлавоноїдів (Кanashiro A. Et al. 2004). Особливе зацікавлення науковців викликає природний флавоноїд – кверцетин, а саме – його водорозчинна форма – корвітин. Біологічні ефекти цього препарату зумовлені його здатністю до блокування вільнорадикальної ліпопероксидації клітинних мембран, впливом на експресію мРНК індуцибельної NО-синтази, збереженням рівня оксиду азоту та модулюючою дією на його активні метаболіти (Ковалев В.Б., 1999; Pietta P.G. 2000; Chen Y.C., 2001; Wadsworth T., 2001 Мойбенко А.А., 2003; Jeong Y.M. et al., 2005). Таким чином, з’ясування особливостей NO-синтазного та аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну у лімфоцитах і ендотеліоцитах, за умов застосування корвітину, дозволить краще зрозуміти основні клініко-патогенетичні закономірності розвитку імунокомплексного процесу, можливості його попередження та адекватної фармакологічної корекції.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.Дисертаційна робота є фрагментом планової наукової міжкафедральної теми “Імуно-нейтрофільно-ендотеліально-епітеліально залежні механізми в розвитку гіперімунокомплексного синдрому в експерименті і клініці”, яка виконувалась на кафедрах патологічної фізіології, клінічної імунології та алергології, ендоскопії і малоінвазивної хірургії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (№ державної реєстрації 0101U00933). У рамках даної тематики автором проведено дослідженя стосовно експериментального моделювання хронічної гіперімунокомплексемії та її корекції корвітином. Тема дисертації затверджена Проблемною комісією “Патологічна фізіологія та імунологія” 26 cічня 2006 року (протокол № 50).
Мета дослідження. З’ясування особливостей NO-синтазного та аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну у лімфоцитах та ендотеліоцитах за умов хронічної гіперімунокомплексемії та вивчення впливу на ці процеси корвітину.
Завдання дослідження:
1. Дослідити особливості NО-синтазного і аргіназного шляхів метаболізму L-аргініну в лімфоцитах і ендотеліоцитах при їх сумісній інкубації in vitro, в нормі та за умов хронічної гіперімунокомплексемії.
2. Дослідити NО-синтазний та аргіназний шляхи метаболізму L-аргініну в лімфоцитах і ендотеліоцитах в нормі та при хронічній гіперімунокомплексемії за умов in vivo.
3. Дослідити вміст стабільних метаболітів оксиду азоту – нітрит-аніону, нітрат-аніону і нітрозоглутатіону у лімфоцитах та ендотеліоцитах в нормі та при хронічній гіперімунокомплексемії.
4. Вивчити електронномікроскопічні зміни ультраструктури лімфоцитів і ендотеліоцитів в нормі та при хронічній гіперімунокомплексемії.
5. Оцінити вплив корвітину на окисний та неокисний шляхи метаболізму L-аргініну у лімфоцитах і ендотеліоцитах в нормі та при хронічній гіперімунокомплексемії (в умовах in vitro та in vivo).
6. З’ясувати можливість корекції виявлених морфологічних порушень корвітином.
Об’єкт дослідження – хронічний гіперімунокомплексний процес, відтворений на білих лабораторних щурах-самцях із використанням моделі хронічної сироваткової хвороби.
Предмет дослідження – показники метаболізму системи L-аргініну в лімфоцитах та ендотеліоцитах інтактних тварин, тварин з хронічним гіперімунокомплексним процесом та за умов введення цим тваринам корвітину, а також ультраструктура лімфоцитів і ендотеліоцитів щурів до та після корекції корвітином.
Методи дослідження : з метою вивчення особливостей функціонально-структурних змін лімфоцитів та ендотеліоцитів за умов хронічної гіперімунокомплексної патології в експерименті були застосовані такі методи: виділення клітин (виділення лімфоцитів – на градієнті щільності фекол-верографіну, виділення ендотеліальних клітин – метод ферментативного диспергування); імунологічні (визначення вмісту ЦІК методом преципітації в ПЕГ, визначення активності системи комлементу); біохімічні (визначення ферментативної активності NO-синтаз – іNOS та сNOS, рівня стабільних метаболітів оксиду азоту – NO2 Ї і NO3 Ї, вмісту нітрозоглутатіону – GSNO та активності аргінази і сечовини); морфологічні (дослідження ультратонкої структури лімфоцитів та ендотеліоцитів методом електронної мікроскопії); математичні (статистичне опрацювання одержаних результатів).
Наукова новизна одержаних результатів: Уперше встановлено порушення процесів синтезу оксиду азоту, зокрема його NO-синтазного шляху метаболізму в лімфоцитах та ендотеліоцитах за умов хронічної гіперімунокомплексемії. Уперше показано, що розвиток хронічної гіперімунокомплексемії супроводжується активацією аргіназного шляху метаболізму NO. Виявлено, що за умов хронічної гіперімунокомплексної патології, корвітин виступає як інгібітор неокисного метаболізму L-аргініну за аргіназним шляхом, внаслідок чого нормалізується окисний метаболізм L-аргініну за NО-синтазним шляхом. Встановлено коригуючий ефект корвітину на морфологічний стан лімфоцитів та ендотеліальних клітин при хронічній гіперімунокомплексемії.
Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених досліджень розкривають раніше невідомі механізми патофізіологічних змін у лімфоцитах і ендотеліоцитах за умов хронічної гіперімунокомплексемії та доповнюють відомості про патогенез імунокомплексної патології. Отримані дані дозволяють оцінити участь в цих процесах двох шляхів метаболізму L-аргініну та обгрунтовують доцільність застосування корвітину, як імуномодулятора та ендотеліопротектора в терапії імунокомплексних захворювань.
Теоретичні та практичні узагальнення роботи викладені у деклараційному патенті на корисну модель (№13287) та актах впровадження, які використовуються в навчальному процесі кафедр патологічної фізіології, патологічної анатомії і фармакології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, кафедрі загальної і клінічної патофізіології Одеського державного медичного університету, кафедрах патологічної фізіології, патологічної анатомії, фармакології з клінічними фармакологією та фармакотерапією, внутрішньої медицини з клінічною імунологією та алергологією Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, на кафедрах патофізіології та ендокринології, клінічної імунології і алергології Донецького державного медичного університету імені О.М. Горького, кафедрі клінічної імунології та алергології Київського національного медичного університету імені О.О. Бого-мольця.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним науковим дослідженням. На основі проведеного патентно-інформаційного пошуку та літературного огляду автором, спільно з науковим керівником, сформульовано мету і завдання дослідження, вибрано і відпрацьовано адекватні моделі і методики. Під час виконання експериментальної частини здобувачем самостійно проведено моделювання хронічної гіперімунокомплексемії та її корекція, опанована і проведена методика виділення ендотеліальних клітин. Під час виконання експериментальної частини здобувач брала участь у проведенні імунологічних методів дослідження та підготовці зразків для електронної мікроскопії. Біохімічні дослідження – визначення активності ферментів NO-синтаз, вмісту нітрит – і нітрат аніонів, нітрозоглутатіону та рівнів аргінази і сечовини виконано в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна. За сприяння у виконанні біохімічних досліджень автором висловлюється щира подяка ст.н.сп., к.б.н. – Коцюрубі А.В. Електронно-мікроскопічні дослідження проводились у лабораторії електронної мікроскопії ЛНМУ ім Данила Галицького, за консультативної допомоги к.б.н – В.І. Ковалишина, за що йому, автором, висловлюється щира подяка. Автором самостійно проведено статистичну обробку результатів дослідження, аналіз і узагальнення отриманих даних, написання всіх розділів дисертації та підготовку публікацій до друку. Висновки і практичні рекомендації сформульовано разом з науковим керівником. У наукових працях, опублікованих у співавторстві, а також актах впровадження, що стосуються науково-практичної новизни, викладено дані, отримані автором у процесі виконання дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на науково-практичних конференціях: ”Стан і перспективи розвитку медичної генетики, алергології та клінічної імунології“ (Львів-Трускавець, 2005), ”Сучасні методи діагностики та лікування алергічних захворювань“ (Київ, 2006 ), ”ІV чтение им. В.В. Подвысоцкого“ (Одеса, 2007), ”Здобутки клінічної і експериментальної медицини“ (Тернопіль, 2007), “Роль месенжерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології“ (Тернопіль 2007), а також на Міжнародній науковій конференції “Імунодіагностика та імунотерапія ревматологічних хворих” (Львів, 2006) та ІІІ міжнародній науковій конференції ”Гомеостаз: фізіологія, патологія, фармакологія і клініка“ (Одеса, 2007).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 робіт, з яких 8 – у фахових наукових журналах, 6 тез доповідей у матеріалах наукових з’їздів, конференцій та конгресів, 1 деклараційний патент на корисну модель.
Структура дисертації. Дисертація викладена на 176 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних джерел (всього 268) і додатків. Текст дисертації ілюстрований 26 рисунками та 19 таблицями. Бібліографічний опис джерел літератури та додатки викладені на 40 сторінках.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на статевозрілих білих щурах-самцях масою 200-250 г., в осінньо-зимовий період. Експериментальні втручання та евтаназія тварин проводилась із дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних наукових досліджень (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (протокол № 15 від 12 грудня 2005 р.) порушень морально-етичних норм при виконанні науково-дослідної роботи не виявлено. У процесі дослідження використано 200 тварин, яких розподіляли на групи: перша – інтактні тварини, які отримували плацебо і служили контролем; друга – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією; третя – інтактні тварини, які отримували корвітин; четверта – тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, які отримували корвітин.
Хронічну гіперімунокомплексемію відтворювали за допомогою класичного методу за Cohrane C. і Kofler D. (1973) з посиланням на праці Williams R. (1980) та досліджень Чоп’як В.В. (1998). Для цього у хвостову вену кожні 7 днів упродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін (НВФ “Simko Lpd”, Україна) із розрахунку 100 мг/кг. Розчин корвітину (виробництва ЗАТ НВЦ “Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”, Україна) вводили внутрішньоочеревинно в дозі 40 мг/кг раз на добу впродовж 10 днів. Евтаназію тварин здійснювали шляхом декапітації.
Отримання клітин лімфоцитів проводили на подвійному градієнті щільності розчинів фікол-урографіну: фікол (Ficoll-400 – “Pharmacia Fine Hemical”, Швеція) урографін (Urografin – “Shering”, Німеччина) із густинами, що відповідали (с1 =1,095 г/см3 та с2 = 1,077 г/см3 ) (Boyum A., 1987). Ендотеліальні клітини виділяли із черевної аорти щура методом ферментативного диспергування з використанням 0,1% розчину колагенази (“Fluka Chemic A.G.“, Німеччина) (Коваленко Т.М., 1999).
Інкубацію ізольованих лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили у середовищі 199 (РАМН Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) з 20% вмістом телячої ембріональної сироватки (НВП “Cангва”, Україна) в 24 лункових пластикових планшетах (“Sigma“, США). Для запобігання змішуванню лімфоцитів та ендотеліоцитів клітини розділяли напівпроникними мембранами з діаметром пор 3мм (“Sigma“, США), виділені клітини вносились в лунку планшети у співвідношенні 1:1. Клітини інкубували в термостаті при 370 С в атмосфері із 5% СО2 впродовж 1 год (Мойбенко О.О., Сагач В.Ф., 2000). Розчин корвітину, в дозі 1•10– 4 г/л, в умовах in vitro вносили в лунку планшети. Дозу застосування корвітину визначали на підставі літературних даних (Мойбенко О.О., 2000; Караванская И.Л., 2002).
Розвиток і верифікацію хронічної гіперімунокомплексемії оцінювали у сироватці крові за рівнем циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), визначення яких проводили за допомогою методу преципітації в поліетиленгліколі – 600, та загальною комплементарною активністю сироватки крові, яку визначали за методом 50% гемолізу еритроцитів (Осипов С. Г., Логинский В.Е., 1983).
Дослідження активності ферментів NO-синтаз (сNOS та іNOS) проводили калориметричним методом (Selter M., 1991). Вміст нітрит-аніонів визначали за допомогою методу Гріна в модифікації Коцюруби А.В. (Green L. S., 1982; Коцюруба А. В., 2000), нітрат аніонів методом (Bank N.R. 1993). Визначення вмісту нітрозоглутатіону (GSNO) проводили за методом (Gerdel D., 1996). Аргіназну активність визначали з допомогою спектрофотометрії (СФ-40) за методом (Gardanta C. L., 1982). Вміст сечовини в інкубаційній суміші та безбілкових зразках проб визначали калориметричним методом за допомогою добірки реактивів (ВІО-LA-TEST, МОКОVINA, “Lachema”, Чехія) та реактивів фірми (“Філіст-Діагностика“, Україна).
Дослідження ультратонкої структури лімфоцитів та ендотеліальних клітин проводили методом трансмісійної електронної мікроскопії за допомогою електронного мікроскопа ПЕМ-100.
Статистичне опрацювання результатів дослідження проводили із застосуванням статистичного пакету прикладних програм Statistica 6.0 for Windovs.
ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Для реалізації поставленої мети, першим етапом нашої роботи було дослідження процесів NO-синтазної та аргіназної активності в ізольованих лімфоцитах та ендотеліальних клітинах при їх інкубації за умов норми і хронічної гіперімунокомплексемії.
Результати, отримані в умовах in vitro, встановили, що присутність в інкубаційному середовищі ендотеліальних клітин за умов норми здатна незначно впливати на процеси синтезу оксиду азоту в лімфоцитах. Зменшення активності іNOS (Р<0,05) компенсовано майже рівнозначним підвищенням активності сNOS (Р<0,05). Сумарна активність NOS у лімфоцитах за умов їх інкубації з ендотеліоцитами має лише тенденцію до зростання. Зміни вмісту стабільних метаболітів NO та нітрозоглутатіону (GSNO) за цих умов були недостовірними. Паралельно з цим відзначено пониження активності аргінази в 1,4 раза (Р<0,05) та зменшення вмісту сечовини у 2,9 раза (Р<0,05). У ендотеліоцитах за умов їх інкубації з лімфоцитами спостерігається зростання активності іNOS і сNOS у 2,1 раза (Р<0,001), проте дана активність ферментів не забезпечила достовірних змін у рівні нітрит - та нітрат - аніонів. У вмісті нітрозоглутатіону достовірних змін також не встановлено.
Отримані результати підтверджують той факт, що ендотеліальні клітини володіють сильною системою захисту від ушкоджувального впливу агресивних факторів, що і проявилося значним збільшенням потенціалу NOS (Р<0,001). Стосовно активності аргінази, то в умовах сумісної інкубації клітин, в ендотеліоцитах виявлено зменшення її активності у 2,5 раза (Р<0,05). Одночасно відзначено падіння рівня сечовини в клітинах ендотелію, проте воно було недостовірним.
Аналіз кооперативної взаємодії лімфоцитів та клітин ендотелію у тварин із змодельованою хронічною гіперімунокомплексемією виявив дещо інші особливості у процесах метаболізму оксиду азоту. Так, інкубація лімфоцитів в присутності ендотеліоцитів по відношенні до контролю показала істотне підвищення в 3,6 раза іNOS (Р<0,001) та зменшення в 2,2 раза сNOS (Р<0,001). Досить цікавим за цих умов є зниження вмісту NO2
Ї- аніону у порівнянні з клітинами контролю (Р<0,001), показник рівня NO3
Ї – аніону є також понижений (Р<0,001). Паралельно у досліджуваних тест-об’єктах зменшується і вміст GSNO (Р<0,001). Показник сумарної активності NOS
8-09-2015, 22:21