Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу

Національна академія наук України

Інститут біології клітини

Люта Мар’яна Ярославівна

УДК 616.379-008.64:612.111:[577.152.1.+577.112.4+547.477]

Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу

03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Львів – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі біохімії біологічного факультету

Львівського національного університету імені Івана Франка

Міністерство освіти і науки України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор

Сибірна Наталія Олександрівна ,

Львівський національний університет

імені Івана Франка,

завідувач кафедри біохімії

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Великий Микола Миколайович,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

пров. наук. співр. відділу біохімії коферментів

- доктор біологічних наук, професор

Янович Вадим Георгійович,

Інститут біології тварин УААН,

гол. наук. співр.

Захист відбудеться “ 20 ”лютого 2008 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.246.01 в Інституті біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології клітини НАН України за адресою: 79005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16.

Автореферат розісланий “18” січня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук В.М. Убийвовк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Цукровий діабет є однією з найголовніших медико-соціальних проблем і займає третє місце серед захворювань, які найчастіше є причиною ранньої інвалідності і летальності серед населення практично у всіх країнах світу [Gale, 2002]. Кількість хворих на ЦД у світі перевищила100 млн. осіб. У медичних закладах України на обліку їх біля 1 млн. Щорічно число хворих збільшується на 5-7%, а кожні 15 років – подвоюється [Томашевський, 1996].

ЦД 1-го типу є автоімунним захворюванням з деструкцією в-клітин острівців підшлункової залози, що розвивається під дією факторів зовнішнього середовища та при наявності генетичних передумов. Дана патологія супроводжується порушеннями вуглеводного, ліпідного та білкового обмінів, що призводить до формування ряду ускладнень. Незважаючи на велику кількість досліджень у цілому світі патогенез ЦД з’ясований не до кінця [Кураева и др., 2003]. У останній час головні завдання дослідників – перехід від діагностики діабету до його передбачення, від лікування до попередження.

Метаболічні порушення, які розвиваються внаслідок інсулінової недостатності при ЦД, значно ускладнюють функціонування систем підтримки гомеостазу, важливою ланкою якого є еритроцити периферичної крові. При ЦД суттєво змінюються фізичні, біохімічні, морфофункціональні властивості еритроцитів. За умов гіперглікемії глікозилювання гемоглобіну – основного білка червоних кров’яних клітин викликає зміну його спорідненості до кисню, посилення гіпоксії периферичних тканин у хворих на ЦД 1-го типу. Крім того, метаболічні процеси, індуковані глюкозою, проявляються активацією перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), що впливає на стабільність клітинної мембрани, адсорбцію на ній токсичних речовин, Це веде до порушень у обміні речовин, і, як наслідок, знижує життєздатність цих клітин [Бондарь и др., 2003]. В цілому зміни еритроцитарної ланки в комплексі метаболічних порушень у хворих ЦД вивчені недостатньо. Розуміння цих змін дозволить проводити адекватну фармакологічну корекцію при цьому захворюванні.

Відомо, що система L-аргінін/NO може брати участь у формуванні кисеньтранспортної системи крові, тобто впливати на основну функцію клітин еритрону через внутрішньоеритроцитарні механізми регуляції, кисеньзалежний характер утворення NO, підтримку судинного тонусу, дію пероксинітриту [Зинчук, 2003]. Вивчення її впливу на морфологічні та біохімічні показники еритроцитів за умов ЦД 1-го типу є надзвичайно актуальним, оскільки для цієї патології характерне посилення гіпоксії тканин пропорційно до розвитку діабетичних ускладнень.

Характер рівноваги між інтенсивністю вільнорадикальних процесів та функціонуванням системи антиоксидантного захисту значною мірою залежить від рівня продукування NO та депонування оксиду азоту в еритроцитах. Тому виникає потреба пошуку нових фармакологічних агентів, здатних коригувати розвиток цукрового діабету шляхом послаблення токсичної дії вільних радикалів кисню і азоту за умов даної патології. В цьому плані надзвичайно перспективним є застосування інгібіторів NO-синтаз селективної дії, які пригнічують, передусім, індуцибельну ізоформу фермента, що проявляє свої функції, в основному, за критичних умов.

З’ясування особливостей функціонування системи антиоксидантного захисту (АОЗ), ферментів біосинтезу NO, механізмів депонування NO за допомогою гемоглобіну, та їх роль у регуляції морфофункціонального стану еритроцитів дозволить розширити наші уявлення про патогенез ЦД 1-го типу та механізми розвитку ускладнень за даної патології.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась на кафедрі біохімії біологічного факультету Львівського національного університету імені Івана Франка згідно плану науково-дослідної роботи кафедри за темами: “Діагностика та розробка засобів корекції метаболічних порушень при цукровому діабеті” (№ держреєстрації 0193U024092) і “Структурно-функціональні та біохімічні особливості клітин системи крові за умов цукрового діабету 1-го типу” (№ держреєстрації 0103U001909).

Мета та завдання досліджень. Метою даної роботи було з’ясування біохімічних механізмів впливу системи L-аргінін/NO на морфологічний та функціональний стан еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу та пошук шляхів корекції метаболічних порушень, які виникають при даній патології.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Оцінити інтенсивність еритропоезу у щурів з експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

2. Дослідити активність NO-синтази в еритроцитах щурів у нормі і за умов ЦД 1-го типу на фоні введення щурам peros субстрату даного ферменту (L-аргініну) та його інгібіторів (L-NAME (N^щ –nitro-L-arginine methyl ester) і аміногуанідину (AG)).

3. З метою дослідження процесів депонування NO вивчити динаміку вмісту лігандних форм гемоглобіну (Hb) в еритроцитах, кисень-зв’язуючу функцію основного пігмента крові, нітритредуктазну активність дезокси-Hb та процес нітрозування Hbinvitroв нормі, за умов експериментального ЦД та на фоні введення AG.

4. Проаналізувати електронні спектри нітрозил-Hb (NOHb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG для оцінки можливості моделювання коригуючого впливу на процеси депонування NO.

5. За допомогою скануючої електронної мікроскопії дослідити поверхневу архітектоніку та поліморфізм еритроцитів щурів при введенні L-аргініну, L-NAME та AGinvivo у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу.

6. З’ясувати вплив L-аргініну, L-NAME та аміногуанідину на стан системи антиоксидантного захисту та рівень перекисного окислення ліпідів в еритроцитах контрольних тварин і на моделі експериментального стрептозотоцинового діабету.

Об'єкт досл i дження : біохімічні механізми, що опосередковують морфологічні та функціональні зміни в еритроцитах контрольних щурiв та тварин із експериментальним цукровим діабетом.

Предмет дослiдження : цитологічні та фізико-хімічні показники клітин еритроїдного ряду периферичної крові та кісткового мозку, ізоформи NOS (ендотеліальна конститутивна та індуцибельна NO-синтаза), лігандні форми гемоглобіну, NO-похідні гемоглобіну (нітрозо- та нітрозилгемоглобін), нітритредуктазна активність дезоксигемоглобіну, ферментативна система антиоксидантного захисту (СОД, каталаза, ГПО, ГР), рівень продукції перекисного окислення ліпідів (ТБК-позитивні продукти).

Методи досл i дження : біохімічні, методи абсорбційної спектроскопії, скануючої електронної мікроскопії, цитологічні, статистичні.

Наукова новизна отриманих результатів. Отримані дані по вмісту фетального гемоглобіну, кількості еритроцитів у периферичній крові та добовій продукції і швидкості дозрівання ретикулоцитів у поєднанні з аналізом препаратів кісткового мозку ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Показано, що за умов експериментального ЦД значно зростає активність іNOS у еритроцитах.

Проведено аналіз лігандних форм гемоглобіну еритроцитів щурів у нормі та при ЦД 1-го типу на фоні введення аміногуанідину – інгібітора індуцибельної ізоформи NOS та процесів неферментативного глікозилювання. Показано, що за умов ЦД інтенсифікується процес S-нітрозилювання гемоглобіну.

Вперше показано коригуючий вплив аміногуанідину на кисеньтранспортну систему, активність ферментів антиоксидантного захисту, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів та морфофункціональний стан еритроцитів щурів із експериментальним стрептозотоциновим діабетом.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані по коригуючому впливу аміногуанідину на морфофункціональний стан еритроцитів (поліморфізм червоних кров’яних клітин, вміст глюкози та глікозильованого гемоглобіну, кисеньтранспортну функцію, активність ферментів системи антиоксидантного захисту, депонування NO шляхом нормалізації процесу S-нітрозилювання гемоглобіну) за умов ЦД 1-го типу вказують на доцільність його застосування в комплексній терапії та корекції ускладнень, що виникають при досліджуваній патології і на його основі вести пошук та розробку нових фармакологічних препаратів для лікування даного захворювання. Результати досліджень нітритредуктазної активності, процесів нітрозилювання та нітрозування дезоксигемоглобіну in vitro та аналіз електронних спектрів нітрозилгемоглобіну дозволяють охарактеризувати механізми депонування NO за участю гемоглобіну та роль системи L-аргінін/NO у процесах формування адаптаційного захисту при ЦД.

Отримані у дисертаційній роботі дані використовуються у навчальному процесі під час викладання спецкурсів, які читаються на кафедрі біохімії біологічного факультету Л НУ імені Івана Франка.

Особистий внесок здобувача. У всіх серіях досліджень дисертант безпосередньо брала участь у створенні моделі стрептозотоцинового діабету, виконала весь обсяг експериментальних досліджень, статистичну обробку отриманих результатів, здійснила пошук та аналіз джерел наукової літератури згідно з темою кандидатської дисертації. Автор особисто брала участь у підготовці публікацій до друку. Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів методом скануючої електронної мікроскопії виконано спільно із к.б.н., ст.н.сп., Кулачковським О.Р. Планування експериментальної роботи, аналіз та обговорення результатів, формулювання основних положень і висновків проведено спільно з науковим керівником, д.б.н., завідувачем кафедри біохімії, проф. Сибірною Н.О. Співучасть співробітників кафедри біохімії у виконанні роботи відмічена у спільних публікаціях.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені на IV Національному конгресі патофізіологів України (Чернівці, 2004); І з’їзді фізіологів СНД (Сочі, 2005); Міжнародній науково-практичній конференції „Біологічне окиснення в нормі і патології” (Тернопіль, 2006); ІХ З’їзді Укр. біохім. тов. (Харків, 2006); третій Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”(Львів, 2007); 2-му З`їзді Українського Товариства Клітинної Біології (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, які включають 6 статей у фахових наукових журналах та 4 тез доповідей на міжнародних та вітчизняних наукових конференціях, з’їздах, конгресах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація містить наступні розділи: вступ, аналітичний огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та список використаних джерел. Дисертацію викладено на 124сторінках друкованого тексту і проілюстровано 12 рисунками та 13 таблицями. Список літератури включає 177 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури проаналізовано сучасні дані стосовно етіології ЦД 1-го типу та його ускладнень, а також експериментального стрептозотоцинового діабету. Охарактеризовано морфофункціональний стан системи еритрону, киснево-транспортну функцію крові та біологічну систему L-аргінін/NO у нормі і за умов досліджуваної патології.

Матеріали і методи досліджень. Експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) у щурів викликали введенням стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 7 мг на 100 г маси тіла дочеревинно. Розвиток діабету контролювали за вмістом глюкози в крові, яку визначали глюкозооксидазним методом з використанням набору реактивів “Lachema” (Чехія) [Tringer, 1969]. У експериментах in vivo з моменту індукції діабету тваринам per os вводилися досліджувані речовини з питною водою: L-аргінін у концентрації 1,25 г/л протягом 14 днів; L-NAME у концентрації 70 мг/л протягом 14 днів ; AG у концентрації 1 г/л протягом 30 днів. Дослідження проводили в таких групах: 1. Контроль (К); 2. К + L-аргінін; 3. К + L-NAME; 4. К + AG; 5. Діабет (Д); 6. Д + L-аргінін; 7. Д + L-NAME; 8. Д + AG.

Кількість еритроцитів та ретикулоцитів визначали згідно методик [Сибірна та ін., 1997]. Визначення швидкості дозрівання та добової продукції ретикулоцитів визначали за методикою, описаною [Ілюхін и др., 1982 ]. Для отримання цитологічних препаратів клітин кісткового мозку застосовували комбіноване фарбування за Папенгеймом.

Активність NO-синтази визначали як описано в роботах [Онуфриев, 1995, Сумбаев, 2000] у нашій модифікації або опосередковано контролювали за вмістом кінцевих продуктів метаболізму NO: нітритів за методом Гріса [Мокроносов, 1989], нітратів за методом [Cawse, 1967].

Лігандні форми Hb визначали методом абсорбційної спектроскопії [Білий та ін., 1998]. Нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну визначали у гемолізатах, отриманих з використанням 33 мМ К⁺ /Na⁺ -фосфатного буферу (рН 7,36). Процес дезоксигенації гемоглобіну здійснювали у вакуумі [Иванов, 1975] і контролювали спектрофотомерично. Концентрацію гемоглобіну у гемолізатах визначали за методикою [VanKampen, 1961]. Реакцію відновлення NO₂ ^- аніонів за участю дезоксигемоглобіну ініціювали додаванням до гемолізату розчину NaNO₂ та реєстрували зростання оптичної густини розчину при 480 нм [Gross, 1999]. Електронні адсорбційні спектри досліджували за допомогою спектрофотометра UV-VIS “SpecordM-40” (Німеччина). Нітрозування проводили у спеціальному сатураторі. При цьому через відновлений дитіонітом натрію гемолізат пропускали оксид азоту, який одержували шляхом відновлення нітроксильного іону при поєднанні розчинів та аскорбінової кислоти [Gross, 1999].

Дослідження поверхневої архітектоніки еритроцитів здійснювали методом скануючої електронної мікроскопії. Виділення, відмивання та фіксацію еритроцитів для електронної мікроскопії проводили за методикою [Сидоров и др., 2001, Новицкий и др., 2001]. Готові зразки вивчали в скануючому електронному мікроскопіJEOLJSM-T 220 AScanningmicroscope (Японія) Для отримання кількісної характеристики морфологічних форм еритроцитів у кожному препараті статистично підраховували 500 клітин, використовуючи класифікацію [Боднарь и др., 2003, Погорелов и др., 2005].

Супероксиддисмутазну активність (СОД, КФ 1.15.1.11) визначали методом, який ґрунтується на відновленні нітросинього тетразолію супероксидними радикалами [Чевари и др., 1991]. Каталазну активність (КФ 1.11.1.6) визначали за інтенсивністю забарвлення комплексу Н₂ О₂ з молібдатом амонію [Королюк и др., 1988]. Глутатіонпероксидазну активність (ГПО, КФ 1.11.1.9) визначали за допомогою методу, в основі якого лежить розвиток кольорової реакції внаслідок взаємодії SH-груп з реактивом Еллмана [Моин, 1986]. Активність глутатіонредуктази [ГР, КФ 1.6.4.2] оцінювали за зменшенням вмісту NADPH [Панченко и др., 1975]. Вміст сполук, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-позитивні продукти), визначали за методикою [Тимирбулатов и др., 1981]. Глікозильований гемоглобін визначали колориметричним методом [Van Kampen, 1983].

Результати досліджень обробляли статистично з використанням коефіцієнта Ст’юдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Цитологічні та фізико-хімічні показники периферичної крові та кісткового мозку щурів у нормі та за умов експериментального ЦД 1-го типу . Показано, що за умов експериментального цукрового діабету (ЕЦД) відбувається збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові у 1,4 разів, їх добової продукції у 1,3 разів, а швидкості дозрівання у півтора рази порівняно до норми. Розвиток стрептозотоцинового діабету веде до підвищення вмісту лужностійкого та глікозильованого гемоглобіну (Hb). Збільшення кількості фетального гемоглобіну є компенсаторною реакцією системи еритрону на гіпоксичний стан, який розвивається за умов ЦД. При аналізі цитологічних препаратів кісткового мозку виявлено зниження процентного вмісту поліхроматофільних (у 1,3 разів) та оксифільних (у 1,7 разів ) нормоцитів при стрептозотоциновому діабеті, яке можна пояснити їх сповільненим дозріванням та швидкими темпами елімінації ретикулоцитів у русло крові. Отримані нами результати ілюструють механізм розвитку анемії у хворих на ЦД 1-го типу на клітинному рівні.

Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів у нормі та за умов ЦД 1-го типу. Згідно даних, приведених в табл.1, введення L-аргініну у нормізбільшувало NO-синтазну активність еритроцитів приблизно на 30%. L-NAME – структурний аналог L-аргініну та неспецифічний інгібітор, який конкурентно інгібує всі форми NOS, знижував активність досліджуваного ферменту на 29%, а дія аміногуанідину – селективного інгібітора іNOS, була дуже слабкою. За умов індукованого стрептозотоцином діабету ми спостерігали іншу картину. Введення L-аргініну викликало зниження активності NOS. Це можна пояснити інгібуванням активності ферменту за принципом негативного зворотного зв’язку за умов значного збільшення концентрації NO. При введенні інгібіторів при ЕЦД спостерігалося пригнічення активності NOS в еритроцитах щурів. Цікаво відзначити, що зниження активності цього ферменту при введенні AG за умов ЦД є у три рази стрімкішим по відношенню до вихідного рівня, ніж у нормі. Це свідчить про переважаючий вклад іNOS у сумарну активність синтаз оксиду азоту за умов патології.

Табл. 1

Активність NOS і вміст нітритів та нітратів в еритроцитах периферичної крові за досліджуваних умов ( М±m, n=14)

Примітка. Тут і далі:

* - різниця вірогідна порівняно з контролем, р<0.05

** - різниця вірогідна порівняно із діабетом, р<0.05

При аналізі вмісту стабільних метаболітів NO – нітратів та нітритів ми отримали результати, які підтверджують дані змін активності NOS, визначеної прямим методом (табл.1).

Вплив аміногуанідину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну за умов ЦД 1-го типу. Проведено дослідження впливу аміногуанідину на вміст лігандних форм, спектральні характеристики, нітритредуктазну активність гемоглобіну та кисеньтранспортну функцію еритроцитів. З метою виявлення факторів, які могли б впливати на кисневу афінність гемоглобіну і функціонування киснево-транспортної системи організму в цілому був проведений аналіз лігандних форм гемоглобіну крові щурів у нормі та за умов ЕЦД при введенні AG з використанням методу абсорбційної спектроскопії. В результаті проведених експериментів ми зареєстрували достовірне зростання вмісту метгемоглобіну за умов ЦД. Введення in vivo AG – як у нормі так і за умов цукрового діабету викликало зниження метгемоглобіну, що може свідчити про те, що зростає роль нітритредуктазної ланки оксиду азоту. Для того з’ясування механізмів депонування NO за умов модельного ЦД 1-го типу було досліджено процес нітрозування Hbinvitro, а також проаналізовано електронні спектри дезокси-Hb та нітрозил-Hb (NO-Hb) у нормі, за умов стрептозотоцинового діабету та на фоні введення AG. Поступове перетворення дезокси-Hb в NO-Hb спостерігали за характерними змінами поглинання у видимій області спектру (рис.1). Широка асиметрична смуга з максимумом при 555-560 нм замінялася двома смугами із максимумами поглинання 545,8 нм та 572,4 нм, які є характерними для нітрозил-Hb [Van Kampen, 1983]. Час переходу дезокси-Hb у NO-Hb за умов стрептозотоцинового діабету зростав приблизно


8-09-2015, 22:26