Перехід у низькоспіновий стан супроводжується його зміщенням на 0,07 нм у площину гему, що спричиняє поетапний розрив сольових зв’язків між б-субодиницями і зміщенням субодиниць уздовж контактів б1-в2 і б2-в1.
Нітрозування дезокси-Hb щурів із стрептозотоциновим діабетом супроводжувалось гіперхромним ефектом в області поглинання ароматичних амінокислот, що реєструвалося як зміщення максимуму поглинання з 268,3 до 274,9 нм, і появою широкої смуги поглинання при 334 нм порівняно з NO-Hb контрольних тварин. Зміни спектру поглинання в ультрафіолетовій області відбуваються за рахунок взаємодії NO з білковою частиною молекули Hb, адже відомо, що при 320-360 нм поглинають світло S-нітрозотіольні похідні білків [Stamler, 1992]. Очевидно, відбувається утворення SNO-Hb, який є продуктом нітрозилюванням в-93 цистеїну. Спектри нітрозо-Hb контрольних та з ЕЦД типу щурів, які представлені на рис.2, свідчать про те , що введення AG in vivo (крива -3) мало нормалізуючий вплив на фізико-хімічні властивості молекули Hb.
При дослідженні нітритредуктазної ланки утворення NO за участю дезоксигемоглобіну за умов цукрового діабету виявлено що дезоксигемоглобін щурів із ЕЦД виявляє відносно більшу нітритредуктазну активність порівняно з дезокси-Hb контрольних щурів. Введення AG практично не змінювало досліджуваних нами показників у контрольних тварин. Проте, у тварин з ЕЦД показано зниження нітритредуктазної здатності дезокси-Hb за введення AG, про що свідчить зниження інтенсивності процесів нітрозилювання дезокси-Hb.
При аналізі кривих дисоціації оксигемоглобіну (КДО) отримано чітко виражений зсув кривої дисоціації вліво і зниження Р50 у щурів з ЕЦД (рис. 3). Виявлено також достовірне зростання вмісту глікозильованого гемоглобіну, що є одним з факторів, що викликає ці зміни (табл. 2). Введення AG контрольним щурам викликає зсув КДО вправо порівняно з контролем, що свідчить про зменшення спорідненості гемоглобіну до кисню (Р50 =29,31±1,39). При дії AG за умов ЕЦД нормалізуються киснево-транспортні функції гемоглобіну, тобто відбувається зсув КДО вправо порівняно з діабетом і наближення до контролю (рис. 3), вміст глікозильованого гемоглобіну при цьому достовірно зменшується (табл. 2). При введенні аміногуанідину за умов ЕЦД зсув КДО вправо вказує на перерозподіл у співвідношенні : MetHb / HbFe2+ NO / SNO-Hb в сторону утворення HbFe2+ NO.
Табл. 2.
Напівнасичення гемоглобіну киснем та вміст глікозильованого гемоглобіну
(М±m, n=8-10)
| Варіант досліду | Р 50, мм рт. ст.. | Вміст Hb Ac, % |
| Контроль | 26,61±2,11 | 4.53 ± 0.05 |
| Діабет | 19,20±1,60* | 8.81 ± 0.41* |
| Контроль + AG | 29,31±1,38 | 4.49 ± 0.07 |
| Діабет + AG | 23,31±1,08** | 6.03 ± 0.28** |
Тобто відбувалось зниження спорідненості гемоглобіну до кисню та полегшення дисоціації оксигемоглобіну і гіпоксичного стану, що виникає при даній патології.
Поліморфізм еритроцитів периферичної крові у нормі та за умов цукрового діабету 1-го типу на фоні впливу L-аргініну та інгібіторів NO-синтази
Результати досліджень поверхневої архітектоніки еритроцитів щурів в нормі та за умов ЕЦД на фоні впливу основного субстрату та інгібіторів NO-синтази представлені на рис. 4, 5. Отримано достовірні дані про кількість дискоцитів, стоматоцитів (клітини, які мають форму округлого диску з вираженою увігнутістю з одного боку), ехіноцитів (еритроцитів з виростами різної форми) і форми еритроцитів, які важко піддаються класифікації (табл. 3).
В нормі еритроцитарний пул представлений в основному двовігнутими дискоцитами (рис. 4) до 97%. Клітинна поверхня дискоцита у скануючому мікроскопі виглядає зглаженою, без рельєфних утворень. Трансформовані форми еритроцитів зустрічаються дуже рідко (3% від усієї кількості клітин). Серед них трапляються дискоцити з виростами, гребенями (ехіноцити), куполоподібні (стоматоцити), дзвоноподібні еритроцити. Це є морфологічним проявом онтогенезу червоних кров’яних клітин. Потрібно відмітити, що у контрольних щурів не виявлено значних змін у поверхневій архітектоніці еритроцитів за умов впливу основного субстрату – L-аргініну та інгібіторів NO-синтази (AG, L-NAME) (рис.4).
Аналізуючи поверхневу архітектоніку еритроцитів щурів при ЕЦД (рис 4, Д, рис. 5), можна побачити, що вони зазнають значних змін. На фоні зменшення чисельності популяції функціонально повноцінних двовігнутих дисків (до 69,72 ±2,18 %) спостерігалось збільшення кількості трансформованих клітин, що знаходяться на різних стадіях дегенерації.
Рис. 5. Окремі дегенеративні форми еритроцитів щурів за умов експериментального ЦД: А, Б, В, Д – еритроцити з гребнями різної форми; Г – дзвоноподібний еритроцит; Е, Є – еритроцити з поодинокими виростами; Ж, З – еритроцити з багатьма виростами.
Це еліпсовидні клітини, клітини у вигляді плоского диску, дискоцити з гребенем, виростами, сферичні, куполоподібні, дзвоноподібні, еритроцити у вигляді спущеного м’яча, дегенеративно-змінені клітини червоної крові, які важко піддаються класифікації. Різноманітність дегенеративних форм еритроцитів, виявлених нами за умов ЕЦД представлена на рис 5. Відмічено достовірне зростання концентрації глюкози та HbAc (табл.3).
Табл.3.
Рівень глюкози та вміст глікозильованого гемоглобіну при введенні досліджуваних речовин щурам у нормі і за умов експериментального цукрового діабету (М±m, n=14)
| Варіант досліду | Вміст HbAc, % |
Рівень глюкози в крові, ммоль/л |
| К | 4.53 ± 0.05 | 5.6 ± 0.5 |
| К +L-Аргінін | 4.47 ± 0.11 | 5.8 ± 0.6 |
| К + L-NAME | 4.60 ± 0.12 | 6.0 ± 0.7 |
| К + AG | 4.49 ± 0.07 | 5.16 ± 0.9 |
| Д | 8.81 ± 0.41* | 12.5 ± 0.5* |
| Д +L-Аргінін | 9.92 ± 0.63** | 14.2 ± 1.1** |
| Д + L-NAME | 8.01 ± 0.47 | 12.2 ± 0.4 |
| Д + AG | 6.03 ± 0.28** | 8.6 ± 0.4** |
Введення піддослідним тваринам L-аргініну призводило до збільшення кількості дегенеративних форм еритроцитів (рис.4., Е,), зокрема – дискоцитів з одним та багатьма виростами – ехіноцитів (до 19,71±1,81 %). Цікаво відзначити, що при введенні L-аргініну значно зростав рівень глюкози у крові тварин з ЕЦД та вміст глікозильованого гемоглобіну, тобто посилювався патологічний стан (табл. 3). Інгібітори NO-синтази AG та L-NAME за умов ЕЦД викликали зменшення кількості трансформованих клітин (рис 4., Є, Ж). Крім того введення AG знижувало рівень глюкози в крові і вміст глікозильованого гемоглобіну (див. табл. 3) за рахунок пригнічення неферментативного глікозилювання білків, що, незаперечно, має протекторний вплив на увесь організм за умов даної патології.
Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи еритроцитів у нормі та при ЦД 1-го типу . Результати дослідження ферментів антиоксидантного захисту та продуктів ПОЛ представлені в табл. 4. Активність супероксиддисмутази (СОД) при діабеті знижується, що може бути пов’язане із впливом кінцевих продуктів глікозилювання та пероксинітриту. Введення L-аргініну та інгібіторів NO-синтаз як у нормі, так і за умов ЦД мало ефект підвищення активності досліджуваного ферменту. Окремо потрібно відзначити, що введення AG мало за умов ЦД нормалізуючий вплив, тобто значення активності СОД було порівняльним до величини цього показника у нормі.
Каталаза реагувала на запропоновані модельні ситуації подібним чином. Глутатіонпероксидаза (ГПО) – фермент, який виявив найменші амплітуди відповіді, але слід зазначити, що навіть незначне інгібування ГПО за фізіологічних умов спричиняє зростання токсичних ефектів та підвищення концентрації активних форм кисню.
Табл. 4.
Активність ферментів антиоксидантної системи та вміст продуктів перекисного окиснення ліпідів у щурів в досліджуваних умовах
(M±m, n=14)
Показники Умови |
СОД, ум.од. на 1 мл крові | Каталаза, нмоль Н2 О2 на 1 мг Hb за 1 хв (еритроцити) | ГПО, мкмоль GSH на 1 г Hb за 1 хв (еритроцити) | ГР, нмоль NADPH на 1 мг Hb за 1 хв (еритроцити) | ТБК–позитивні продукти, нмоль на 1 мл плазми |
| Контроль (К) | 0,91±0,01 | 215,74±4,83 | 700,23±11,48 | 3,07±0,06 | 67,66±8,50 |
| Діабет (Д) | 0,76±0,05* | 197,88±3,23* | 665,57±7,33* | 6,77±0,84 * | 124,29±11,7* |
| К + AG | 1,05±0,01* | 333,78±5,34* | 678,99±6,02* | 5,57±0,46* | 69,42±3,07 |
| Д + AG | 0,99±0,02** | 311,96±6,24** | 608,32±5,64** | 4,08±0,32** | 102,46±2,45** |
| К + L-Аrg | 1,45±0,12* | 226,57±7,86 | 715,66±8,43 | 4,15±0,96* | 77,56±6,30 |
| Д + L- Аrg | 1,10±0,09** | 249,36±9,17** | 687,04±7,46 | 3,35±0,58** | 129,99±9,78 |
| К + L-NAME | 1,28±0,09* | 273,56±15,62* | 710,78±23,87 | 3,54±0,15* | 75,43±6,38 |
| Д +L-NAME | 1,09±0,13** | 232,49±12,7** | 669,87±20,03 | 3,76±0,10** | 89,64±7,44** |
Глутатіонредуктаза (ГР) – це фермент, який у наших дослідженнях виявився найбільш лабільним. Його активність зросла за умов ЦД на 125%. Вплив L-аргініну та інгібіторів NOS мав різноспрямовану дію у нормі та при патології. У нормі активність ферменту на фоні введення досліджуваних речовин зростала, а за умов стрептозотоцинового діабету нормалізувалася, тобто знижувалася. Також нами продемонстровано зростання на 83% вмісту ТБК-позитивних продуктів за умов ЦД порівняно з контролем у еритроцитах (табл.4.), що є наслідком збільшення вмісту активних кисневих метаболітів за умов інтенсифікації окислювальних процесів у клітинах крові за умов діабету.
Характеризуючи зміни статусу АОC у розглянутій експериментальній моделі, можна зауважити, що за умов ЦД відбувається функціональне перемикання на захисну антиокиснювальну систему глутатіону. Розглядаючи зміни активності ферментів АОС організму в контексті динаміки змін вмісту ТБК-активних продуктів, слід відмітити антиоксидантні властивості інгібіторів NOS, введення яких супроводжувалося нормалізацією співвідношення процесів ПОЛ та інактивації активних форм кисню. Особливо потрібно відзначити позитивний вплив AG.
ВИСНОВКИ
Отримані результати розширюють та доповнюють уявлення про біохімічні механізми, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин еритроїдного ряду за умов експериментального цукрового діабету та можливі способи корекції цих змін. У даній роботі обґрунтовується роль процесів нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну, ферментативної системи антиоксидантного захисту, різних ізоформ NO-синтази у розвитку метаболічних порушень за умов даної патології.
1. Зміни в системі еритрону при експериментальному цукровому діабеті виявляються в посиленні еритропоезу (збільшення вмісту ретикулоцитів периферичної крові в 1,4 разів, їх добової продукції – у 1,3 разів, а швидкості дозрівання – у 1,5 разів), перерозподілі фракційного складу (підвищення вмісту фетального гемоглобіну в 1,6 разів) і лігандних форм гемоглобіну (зростання вмісту метгемоглобіну у 7,8 разів) та наростанні поліморфізму еритроцитарної популяції (наявність в крові трансформованих еритроцитів), що є відображенням порушення структури мембрани і метаболізму червоних кров’яних клітин.
2. Сповільнене дозрівання еритрокаріоцитів у кістковому мозку (зниження вмісту поліхроматофільних нормоцитів у 1,3 разів та оксифільних – у 1,7 разів) та підвищення елімінації ретикулоцитів у русло периферичної крові при стрептозотоциновому діабеті розкриває механізм розвитку анемії на клітинному рівні за патологічних умов.
3. За умов цукрового діабету 1-го типу в еритроцитах відбувається зміна співвідношення активності ендотеліальної та індуцибельної ізоформ NOS. Зниження активності eNOS та зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів лежить у основі розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і веде до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії.
4. Процеси депонування NO мали різну динаміку у нормі та за умов експериментального цукрового діабету. Введення селективного інгібітора іNOS – аміногуанідину є фактором напрямленого модулювання швидкості (зменшення часу переходу дезоксигемоглобіну в нітрозоформу у 3,3 разів) та інтенсивності (зміни в електронних спектрах) нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну і є перспективним напрямком для подальших досліджень з метою виявлення етіології багатьох патологічних станів та методів їх корекції.
5. Введення аміногуанідину за умов модельного цукрового діабету викликало зсув кривої дисоціації оксигемоглобіну вправо та збільшення показника Р50 на 21,4 %, що свідчить про зниження спорідненості гемоглобіну до кисню, полегшення дисоціації оксигемоглобіну і є позитивним коригуючим фактором за умов гіпоксичного стану, що виникає при даній патології.
6. Для послаблення токсичної дії NO і корекції патологічного стану, пов’язаного з його гіперпродукцією у організмі за умов цукрового діабету 1-го типу, доцільним є використання аміногуанідину як селективного інгібітора iNOS, інгібітора неферментативного глікозилювання, антиоксиданта, а також чинника, здатного попереджати посттрансляційні модифікації білків за участю пероксинітриту.
СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ
ДИСЕРТАЦІЇ
1. Сибірна Н.О., Бурда В.А., Люта М.Я. Активність різних ізоформ NO-синтази еритроцитів за умов цукрового діабету 1 типу // Клін. та експериментал. патологія .- 2004.- Т.3, №2. - С.210-212.
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних і експериментальних даних, участь в отриманні матеріалу та написання і оформлення статті. Дисертант особисто визначала активність ферментів синтезу оксиду азоту).
2. Сибірна Н.О., Вовк О.І., Бурда В.А., Люта М.Я. Вплив L-аргініну та інгібіторів NO-синтази на стан антиоксидантної системи за умов цукрового діабету 1 типу // Лаб. діагност. – 2004, №4. – С .47-51
(Дисертант опрацювала дані літератури та власні результати, їй належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).
3. Сибірна Н.О., Люта М.Я., Бурда В.А., Біронт Н.В., Федорович А.М., Дудок К.П. Вплив системи L-аргінін: NO на динаміку вмісту лігандних форм та спектральні характеристики гемоглобіну за умов цукрового діабету 1 типу //Медична хімія. – 2004. – Т.6, №3. – С.26-29
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті. Здобувач особисто здійснювала визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну).
4. Сибірна Н.О., Люта М.Я., Бурда В.А., Федорович А.М. Вплив аміногуанідину на фізико-хімічні властивості гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Біологія тварин. – 2005. – Т.7, №1-2. – С.194-199
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних і експериментальних даних, участь в отриманні матеріалу та написання і оформлення статті).
5. Бурда В.А., Люта М.Я., Федорович А.М., Сибірна Н.О. Дослідження нітритредуктазної активності гемоглобіну за умов цукрового діабету 1-го типу // Медична хімія.-2006.-Т.8, №4. – С. 92-94
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні статті).
6. Люта М.Я., Кулачковський О.Р., Барська М.Л., Сибірна Н.О. Поверхнева архітектоніка еритроцитів щурів за умов експериментального цукрового діабету при введенні L-аргініну та інгібіторів NO-синтази // Лабораторна діагностика. – 2007. – Т. 2. – С. 63-69
(Дисертант опрацювала дані літератури та власні результати, їй належить участь в отриманні матеріалу, експериментальній роботі та написанні статті).
7. Сибирная Н.О., Бродяк И.В., Лютая М.Я., Буслик Т.В. Молекулярные механизмы изменений структурно-функционального состояния клеток крови при сахарном диабете 1-го типа // Научные труды І Съезда физиологов СНГ. – Сочи (Россия). – 2005. - Т. 2. – С. 16-17
(Дисертант брала участь в опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).
8. Люта М.Я., Буслик Т.В., Федорович А.М., Бурда В.А. Вплив аміногуанідину на нітритредуктазну активність дезоксигемоглобіну за умов експериментального цукрового діабету // Тези доповідей ІХ З’їзду Укр. біохім. тов. Харків.-2006. –Т.2. – С.83-84
(Здобувач брала участь у проведенні досліджень, опрацюванні та аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).
9. Люта М.Я., Кандя Л.І., Бурда В.А., Федорович А.М., Сибірна Н.О. Дослідження кисеньтранспортної функції гемоглобіну за умов експериментального цукрового діабету на фоні впливу аміногуанідину// Тези доповідей третьої Міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів „Молодь та поступ біології”. Львів. – 2007.
(Дисертанту належить опрацювання робочої схеми експерименту, аналіз літературних даних і власних результатів, участь у написанні та оформленні тез).
10. Люта М.Я., Сибірна Н.О. Скануюча електронна мікроскопія еритроцитів щурів за умов цукрового діабету, індукованого стрептозотоцином. // Тези доповідей 2-го З`їзду Українського Товариства Клітинної Біології. Київ. – 2007.
(Здобувач брала безпосередню участь дослідженні, аналізі експериментальних даних, написанні та оформленні тез).
АНОТАЦІЯ
Люта М.Я. Морфофункціональні та біохімічні особливості системи еритрону за умов цукрового діабету 1-го типу. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.11 – цитологія, клітинна біологія, гістологія. – Інститут біології клітини НАН України, Львів, 2007.
Дисертація присвячена дослідженню біохімічних механізмів, які опосередковують зміни морфологічного та функціонального стану клітин еритроїдного ряду та способам корекції метаболічних процесів, які призводять до виникнення та розвитку ускладнень за умов цукрового діабету (ЦД) 1-го типу.
З’ясовано механізм розвитку анемії при ЦД 1-го типу на клітинному рівні. Виявлені зміни в системі еритрону (посилення еритропоезу, наростання поліморфізму еритроцитарної популяції) відображають порушення структури мембрани і метаболізму червоних кров’яних клітин. Показано, що в основі біохімічних порушень, які зумовлюють зміни структурно-функціонального стану еритроцитів за умов ЦД 1-го типу, лежить значне зростання продукції оксиду азоту (NO), викликане зміною співвідношення активностей конститутивної (eNOS) та індуцибельної (iNOS) ізоформ NO-синтази. Зростання активності iNOS на фоні інтенсифікації вільнорадикальних процесів є однією з причин розвитку оксидативного стресу та метаболічної інтоксикації і веде до гальмування фізіологічної регуляторної функції NO та прояву його цитотоксичної дії. Виявлено, що аміногуанідин як селективний інгібітор іNOS впливає на процес утворення і розпаду депо NO, яке контролюється швидкістю та інтенсивністю нітрозування і нітрозилювання гемоглобіну, а також на кисеньтранспортну функцію крові, полегшуючи дисоціацію оксигемоглобіну, що є позитивним коригуючим фактором за умов гіпоксичного стану, що виникає при даній патології. Запропонованно на основі аміногуанідину вести пошук і розробку нових препаратів для запобігання розвитку ЦД та корекції діабетичних ускладнень.
Ключові слова: цукровий діабет 1-го типу, еритроцити, NO-синтаза, гемоглобін, нітрозилювання, аміногуанідин.
АННОТАЦИЯ
Лютая М.Я. Морфофункциональные и биохимические особенности системы эритрона при сахарном диабете 1-го типа. – Рукопись.
Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 – цитология, клеточная биология, гистология. – Институт биологии клетки НАН Украины, Львов, 2007.
Диссертация посвящена исследованию биохимических механизмов, опосредующих изменения морфологического и функционального состояния клеток эритроидного ряда и способам коррекции изменений в метаболических процессах, вызывающих возникновение и развитие осложнений при сахарном диабете 1-го типа.
Выяснено механизм развития анемии при сахарном диабете 1-го типа на клеточном уровне. Обнаруженные изменения в системе эритрона (усиление эритропоэза, нарастание полиморфизма еритроцитарной популяции) отображают нарушения структуры мембраны и метаболизма красных кровяных клеток. Показано, что в основе биохимических нарушений, предопределяющих изменения структурно-функционального состояния эритроцитов при сахарном диабете 1-го типа, лежит значительное возрастание продукции оксида азота, вызванное изменением соотношения активности конститутивной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) изоформ NO-синтазы. Повышение активности
8-09-2015, 22:26