Антиоксиданти в профілактичній терапії вільнорадикального пошкодження см'яників при хронічному надходженні прооксидантів

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ШИШ Наталія Віталіївна

УДК 616.681-099-084:577.16

АНТИОКСИДАНТИ В ПРОФІЛАКТИЧНІЙ ТЕРАПІЇ ВІЛЬНОРАДИКАЛЬНОГО ПОШКОДЖЕННЯ СІМ'ЯНИКІВ ПРИ ХРОНІЧНОМУ НАДХОДЖЕННІ ПРООКСИДАНТІВ

(експериментальне дослідження)

14.03.05 – фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одеса – 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Вищому державному навчальному закладі України «Українська медична стоматологічна академія» МОЗ України, м. Полтава.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Бобирьов Віктор Миколайович, Вищій державний навчальний заклад України «Українська медична стоматологічна академія» МОЗ України, м. Полтави, завідувач кафедри експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Воскресенський Олег Миколайович Інститут стоматології АМН України, м. Одеси, завідувач відділу фармакології і токсикології доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Лук'янчук Віктор Дмитрович Луганський державний медичний університет МОЗ України м. Луганськ, завідувач кафедри фармакології

Захист відбудеться «__7 __»_____травня ______2008 р. о_13°° _годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01 в Одеському державному медичному університеті за адресою: 65082, м. Одеса, Валіховський пров., 2.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Одеського державного медичного університету за адресою: 65082, м. Одеса, Валіховський пров., 3.

Автореферат розісланий «__27 __ »____березня ____ 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 41.600.01

к. мед. н., доцент В.В. Годован

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема безплідного браку до теперішнього часу залишається однією з найактуальніших і має не тільки медичне, але і соціальне значення [Т.Ю. Филиппова, 2005]. У більшості країн, у тому числі і промислово розвинених 30% браків залишаються бездітними [В.П. Чащин, 2003]. Причиною бездітності в 36-61% випадків є субфертильність чоловіків [В.Н. Золотухина, 2003; В.А. Божедомов, 2005].

Використання нераціональних промислових технологій приводить до збільшення екзотоксикантів в навколишньому середовищі [О.М. Воскресенський, 1997; В.Д. Лук'янчук, 2003; Ю.И. Кундиев, 2004] і на сучасному етапі розглядається як одна з найбільш поширених причин порушення репродуктивної функції людини [Н.Р. Шепельская, 2001; М.Г. Магомедов, 2002; А.Г. Войтенко, 2006], і приводе до зниження чоловічої фертильності і в решті до неповноцінності потомства [Н.К. Хитров, 2003; В.В. Гордієнко, 2005; І.М. Трахтенберг, 2006]. У сільському господарстві та міських умовах широке розповсюдження як пестициди знайшли похідні карбонової, пірідінкарбонової кислот - клопіралід і його солі [Dow Agro Sciences, 1998; Л.И. Повякель, 2001; М.Г. Проданчук, 2005]. Розвиток промисловості і транспорту, будівельної індустрії, сільськогосподарського виробництва супроводжується забрудненням навколишнього середовища сполуками важких металів, з них істотну увагу привертає свинець, як глобальний забруднювач [R.D. Masters, 2000; А.А. Добровольский, 2005; І.М. Трахтенберг, 2006].

Провідна роль процесів вільнорадикального перекисного окислення (ВРПО) ліпідів при дії на організм несприятливих екологічних чинників визнається багатьма дослідниками [О.М. Воскресенський, 1997; В.Н. Золотухіна, 2003; В.Д. Лук'янчук, 2003; Л.П. Курпаш, 2006; М.М. Бабенко, 2006]. У деяких роботах показана роль вільних радикалів і перекисів в ушкоджувальній дії солей важких металів і пестицидів на макромолекули клітин, що дозволяє з повною підставою віднести їх в групу прооксидантів [І.М. Трахтенберг, 2001; M. Margues, 2001; О.Б. Леоненко, 2002]. Одним із загальних механізмів дії важких металів і пестицидів є порушення окислювально-встановлених процесів, зокрема посилення ВРПО ліпідів, перш за все, в швидко проліферуючих тканинах - клітинах гонад: сперматогенного епітелію, сперматоцитах і сперматозоїдах [О.І. Цебржинський, 2000; R.J. Potts, 2000; S.C. Sikka, 2001]. Є окремі публікації про гонадотоксичні властивості важких металів [І.М. Трахтенберг, 2000; Y.L. Huang, 2001]. Практично не вивчена токсикодинаміка гербіциду клопіраліду відносно репродуктивної системи. Відсутні ефективні методи лікування і профілактики наслідків дії важких металів і пестицидів на репродуктивну систему.

Дослідження останніх років дають підставу вважати перспективним застосування препаратів антиоксидантів (АО) як гонадопротекторів при дії на організм несприятливих чинників зовнішнього середовища (солей важких металів і пестицидів), що індукують процеси ВРПО ліпідів в організмі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом планової НДР Вищого державного навчального закладу України «Українська медична стоматологічна академія» (ВДНЗУ «УМСА») МОЗ України «Вивчення специфічної фармакологічної активності біологічно активних речовин рослинного походження» (№ держреєстрації 0101U001130). Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є експериментальне обґрунтування застосування препаратів антиоксидантної дії для профілактики біохімічних, функціональних і морфологічних змін в сім’яниках при хронічній дії прооксидантів - ацетату свинцю і клопіраліду.

Для досягнення даної мети були поставлені наступні завдання:

1. Вивчити вплив хронічного введення ацетату свинцю на стан прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональних змін в сім’яниках білих щурів.

2. Вивчити вплив хронічної дії клопіраліду на стан прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональних змін в сім’яниках білих щурів.

3. Вивчити профілактичний вплив б-токоферолу ацетату на стан прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональні зміни в сім’яниках при хронічному надходженні ацетату свинцю і клопіраліду.

4. Вивчити профілактичний вплив екстракту ехінацеї рідкого на стан прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональні зміни в сім’яниках при хронічному надходженні ацетату свинцю і клопіраліду.

5. Вивчити профілактичний вплив азупростату, на стан прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональні зміни в сім’яниках при хронічному надходженні ацетату свинцю і клопіраліду.

Об'єкт дослідження: Профілактична ефективність антиоксидантів при вільнорадикальному ушкодженні сім’яників.

Предмет дослідження: Гонадопротекторна ефективність б-токоферолу ацетату, екстракту ехінацеї рідкого та азупростату в умовах тривалого надходження ацетату свинцю і клопіраліду до організму.

Методи дослідження: біохімічні, морфометрічні, морфологічні, функціональні і статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження гонадотоксичної дії на тканини сім’яників клопіраліду і ацетату свинцю. Вперше виявлено посилення ВРПО ліпідів і розвиток морфофункціональних змін в сім’яниках при хронічному надходженні прооксидантів - ацетату свинцю і клопіраліду, обумовлене дією вільнорадикальних продуктів. Вперше встановлені тісні кореляційні зв'язки між активністю антиоксидантних ферментів (АФ) і ступенем вираженості морфофункціональних змін в сім’яниках на тлі хронічного надходження ацетату свинцю і клопіраліду. Вперше встановлені гонадопротекторні ефекти екстракту ехінацеї рідкого, б-токоферолу ацетату та азупростату при хронічному надходженні ацетату свинцю і клопіраліду відносно стану прооксидантно-антиоксидантної системи і морфофункціональних характеристик сім’яників, кількісних характеристик сперматозоїдів і їх рухливості. Максимальну протекторну дію в цих умовах надав комплексний препарат - азупростат.

Новизна роботи підтверджена патентом України № 65274 від 01.07.2003 р. «Спосіб накопичення і отримання зрілих сперматозоїдів у дрібних лабораторних ссавців для їх подальшого дослідження», патентом України № 67944 від 01.07.2003 р. «Спосіб моделювання порушень сперматогенезу у дрібних лабораторних ссавців екзотоксикантами», патентом України № 66692 від 18.09.2003 р. «Засіб для біологічної профілактики і лікування патозооспермії при екзогенних причинах у дорослих ссавців».

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально встановлені гонадопротекторні властивості препаратів АО при хронічному надходженні прооксидантів - ацетату свинцю і клопіраліду є підставою для їхнього застосування як гонадопротекторів. Зіставлення го надопротекторних властивостей досліджених препаратів АО свідчило про більшу ефективність азупростату, що дає підставу для розширення показань для застосування препарату.

Результати роботи по вивченню гонадопротекторних властивостей препаратів антиоксидантної дії впроваджені в учбовий процес клінічних і теоретичних кафедр вузів України: Луганського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету, Запорізького державного медичного університету, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, ВДНЗУ «УМСА».

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведений патентно-інформаційний пошук, наліз літератури за темою дисертації, відпрацьовані експериментальні моделі, виконана експериментальна частина роботи, а також проведений аналіз, систематизація і статистична обробка отриманих результатів. Сформульовані основні положення та висновки роботи, опубліковані основні положення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були представлені на: ІІ з'їзді токсикологів України (Київ, 2004); Міжнародному Медико-фармацевтичному конгресу "Ліки та життя" (Київ, 2005); ІІ науково-практичній конференції молодих вчених і фахівців «Актуальні проблеми фармакології і токсикології» (Київ, 2005); ІІІ Національному з'їзді фармакологів України (Одеса, 2006).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових робіт, серед яких 8 журнальних статей у спеціалізованих виданнях, рекомендованих ВАК України (4 - одноосібно). Одержано 3 патенти України. Надруковано 4 тез у матеріалах з’їздів, конгресів, науково-практичних конференцій різних рівнів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 163 сторінках і складається з введення, огляду літератури, розділу "Матеріал, моделі та методи дослідження", 3 розділів власних досліджень, заключення, висновків, списку використаних джерел. Одержані дані представлені в 17 таблицях, ілюстровані 48 рисунками. Бібліографія включає 266 джерел, з яких 169 представлені кирилицею, 97 - латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали моделі та методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені експериментальні дослідження на 120 статевозрілих щурах-самцях и 180 статевозрілих щурах-самках лінії Wistar вагою 190-250 г. Лабораторних тварин утримували в умовах акредитованого віварію ВДНЗУ «УМСА» на типовому раціоні годування (раціон 3.2 згідно наказу 1179 про нормативи годування лабораторних тварин в закладах охорони здоров’я). Групування дослідів подане в табл. 1. Моделювання хронічної інтоксикації відтворювали внутрішньошлунковим введенням тваринам ацетату свинцю на фізіологічному розчині дозою 60 мг/кг маси тіла [А.І. Штенберг, 1983], або клопіраліду в дозі 150 мг/кг один раз на добу, експеримент тривав протягом 56 діб [C. Felkner, 1982]. Усі експериментальні досліди були проведені під контролем комісії з біоетики ВДНЗУ «УМСА» (протокол №36 від 25.04.06).

Евтаназію щурів здійснювали під тіопенталовим наркозом (50 мг/кг маси тіла, внутрішньоочеревинно) після добового голодування. У хронічних експериментах використовувались антиоксидантні препарати: a-токоферолу ацетат; екстракт ехінацеї пурпурової рідкий, азупростат на протязі 56 діб. Шлях введення і дозування АО подані в табл. 1. Дози препаратів АО відпрацьовані в лабораторії біохімії і фармакології антиоксидантів ВДНЗУ «УМСА» [В.М. Бобирьов, 1990], при цьому враховувалась мета дослідження – вивчення дії АО, як гонадопротекторів.

Основними об'єктами дослідження у експериментальних тварин були кров, тканина сім’яників і сперма. У крові і тканинах сім’яниківекспериментальних тварин досліджували біохімічні показники: дієнові кон’югати (ДК) в сироватці [О.М. Воскресенский, В.А. Дельва, 1982], ТБК-реактанти в сироватці та сім’яниках [Ю.А. Владимиров, А.І. Арчаков, 1972], Спонтанний гемоліз еритроцитів (СГЕ) [В.В, Спиричев, И.И. Матусин, 1970], активність супероксиддисмутази (СОД) в крові [О.С. Брусов, А.М Герасимов, 1976], каталази в крові [О.Г. Архипова, 1995], вміст церулоплазміну [В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1976]. В тканинах сім’яників визначали джерело активних форм кисню (АФК) (in vitro) [О.І. Цебржинський, 2002].

Проводили морфометрічні досліди з визначенням маси сім’яників та масового коефіцієнту [Г.Г. Автанділов, 1990]. Оцінювали морфологічний стан сперматогенного епітелію, на зрізі сім’яника у кожному канальці визначали кількість шарів сперматогенного епітелію, кількість канальців з 3 і 4 шарами епітелію, обчислювали індекс сперматогенезу [І.В. Саноцкій, 1979; О.В. Стефанов, 2001]. Крім того визначали кількість: нормальних сперматогоній, канальців з 12 стадією мейозу, канальців із злущеним сперматогенним епітелієм, канальців з атрофічним або пошкодженим епітелієм [Ю.І. Ухов, 1983; Д.С. Саркисова, 1996]. Зрілі сперматозоїди вилучали з придатку та підраховували кількість сперматозоїдів, життєздатність сперматозоїдів визначали за допомогою еозинового тесту, підраховували кількість живих та мертвих клітин. Визначали кількість патологічних форм сперматозоїдів [Ю.В. Іванов, 1983]. Також оцінювали рухливість сперматозоїдів: підраховували відсоток клітин з швидкою поступальною ходою (50 мм/сек) - нормокінезис, сповільненою поступальною ходою – гіпокінезис (менше 40 мм/сек), нерухомих - акінезис, і безладними рухами, що коливаються, - дискінезис [М.А. Базарнова, 1988].

Для визначення репродуктивної здатності самців їх спарювали з інтактними самками у співвідношенні 1:5. На 21-й день вагітності самок виводили з експерименту, для кожної самки підраховувалися: загальна кількість жовтих тіл в яєчниках; кількість місць імплантації; кількість живих плодів; кількість мертвих ембріонів; кількість резорбованих зародків і плодів [Н.Р. Шепельська, 2001]. Виходячи з даних показників, обчислювали загальну ембріональну і постімплантаційну летальність [Т.І. Харченко, 1988].

Статистичну обробку результатів було проведено за допомогою комп’ютерного пакета програм «Exell» та «Statistica for Windows. Release 6.0», розробленою фірмою StatSoft з використанням t критерія Ст’юдента та кореляційного аналізу по Спірману. Достовірно різними вважались результати при p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. При хронічному введенні щурам прооксиданту - ацетату свинцю спостерігалася індукція ВРПО ліпідів, що супроводжується підвищенням рівня первинних і проміжних продуктів ВРПО ліпідів в крові і тканинах сім’яників (рис. 1), падінням антиоксидантної забезпеченості організму піддослідних тварин (р<0,05). У тварин на тлі падіння активності каталази (р<0,02) і вмісту церулоплазміну (р<0,01), спостерігалося індуктивне підвищення активності СОД (р<0,001). Це призводило до морфологічних порушень в сім’яниках у вигляді атрофії сперматогенного епітелію, порушення його диференціювання, набряку межуточної тканини, запальної інфільтрації межуточної тканини, спустошення сім’яних канальців, ушкодження сперматогенного епітелію, зниження індексу сперматогенезу і кількості сперматозоїдів, збільшення кількості патологічних форм сперматозоїдів, форм з гипо- і дискінезисом (табл. 2). Порушення репродуктивної функції щурів самців приводили до істотних розладів ембріо- і фетогенезу у спарених з ними інтактних самок (рис. 2).

Аналогічні, але виражені більшою мірою, зміни спостерігалися при хронічному введенні клопіраліду. Виявлялась активація ВРПО ліпідів в організмі, і зниження рівня гідрофобних АО. У крові та тканинах сім’яників достовірно збільшувався рівень ТБК-реактантів. У крові тварин наростала концентрація ДК (р<0,01) (рис. 3), зростання рівню СГЕ (р<0,05), прогресивно знижувалася активність каталази (р<0,05) і вміст церулоплазміну (р<0,01), на тлі збільшеної активності СОД (р<0,001). Відмічалось спустошення сім'яних канальців, ураження сперматогенного епітелію особливо на кінцевих етапах сперматогенезу, некроз канальців сім’яників. Що, призводило до зниження індексу сперматогенезу, функціональної здатності сперми, зростання патологічних форм сперматозоїдів, порушення їх рухливості (див. табл. 2). Спостерігалися порушення ембріо- і фетогенезу у спарених з ними інтактних самок, знижувалася кількість місць імплантації і живих ембріонів, збільшувалося число мертвих і резорбованих зародків, підвищувалася загальна і постімплантаційна ембріональна летальність (рис. 4).

Аналіз виявлених змін свідчить, що дія ацетату свинцю призводила до більш вираженої інтенсифікації ВРПО ліпідів у крові, а клопіраліду - в тканинах сім’яників, що, вочевидь, обумовлено тропністю прооксидантів до відповідних тканин. Дія обох прооксидантів призводила до дискоординації між інтенсивністю ВРПО і антиоксидантною забезпеченістю, що супроводжувалося порушенням окислювальних процесів і активності АФ. Визначення генерації АФК в тканинах сім’яників свідчить, що провідний внесок в продукцію супероксиду в сім’яниках при дії ацетату свинцю дає мітохондріальне окислення, а вплив клопіраліду стимулює витік супероксиду з мікросомального електронно-транспортного ланцюга.

В цілому одержані дані свідчать про те, що за рахунок прооксидантних ефектів клопіраліду і ацетату свинцю спостерігалося зниження запліднюючої здатності сперми. Що підтверджувалось результатами проведеного кореляційного аналізу. У щурів, що одержували ацетат свинцю, виявлений тісний зворотний взаємозв'язок між рівнем СГЕ, що відображає забезпеченість організму гідрофобними АО, і індексом сперматогенезу r=-0,78. Рівень продуктів ВПРО ліпідів ТБК-реактантів в сім’яниках корелює з кількістю сперматозоїдів з дискінезісом r=0,78, та з кількістю канальців з атрофічним або ушкодженим епітелієм r=0,80. Підтверджує ці закономірності

Рис. 1. Зміст ДК в сироватці крові та ТБК-реагуючих продуктів в тканинах сім’яників тварин, що отримували препарати АО на тлі введення ацетату свинцю.

В рис. 1-4: * - достовірність порівняно з інтактною групою;

** - достовірність порівняно з контрольною групою.

Рис. 2. Кількість живих, мертвих и резорбованих ембріонів у інтактних самок спарених с самцями, що отримували препарати АО на тлі введення ацетату свинцю.

Виявлений зворотнийкореляційний зв'язок між рівнем ТБК-реактантів з кількістю нормальних сперматогонієв r=-0,81.

У щурів-самців, що одержували клопіралід встановлені аналогічні кореляційні зв'язки між рівнем ВРПО ліпідів і функціональними показниками репродуктивної системи: рівень ТБК-реактантов крові прямо корелював з кількістю канальців із злущеним епітелієм r=0,83. Виявлялася пряма кореляційна залежність між рівнем ТБК-реактантів в сім’яниках з кількістю сперматозоїдів з дискінезісом r=0,82, що прямо указує на патогенетичний зв'язок рівня ВРПО ліпідів і порушення рухливості сперматозоїдів. Активність антиоксидантного захисту впливав на процеси імплантації зародка, про що свідчив прямий кореляційний зв'язок між активністю каталази і кількістю місць імплантації на самку r=0,94. В цей же час збільшена активність субстратіндуцибельної СОД обумовлена компенсаторною реакцією на підвищення продукції АФК. Таким чином, тісні кореляційні зв'язки між концентрацією продуктів ВРПО ліпідів, станом сперматогенного епітелію, рухливістю сперматозоїдів, ембріональною летальністю вказували на патогенетичну роль процесів ВРПО в ушкодженні репродуктивної системи прооксидантами у щурів,

Рис. 3.Зміст ДК в сироватці крові та ТБК-реагуючих продуктів в тканинах сім’яників тварин, щоотримували препарати АО на тлі введення клопіраліда.

Рис. 4. Кількість живих, мертвих и резорбованих ембріонів у інтактних самок спарених


8-09-2015, 19:54